補(bǔ)料分批發(fā)酵條件優(yōu)化提高D-泛酸的產(chǎn)量

周海巖,周斌,鄒樹平,張博,柳志強(qiáng)*

1(浙江省生物有機(jī)合成技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(浙江工業(yè)大學(xué)),浙江 杭州,310014)2(手性生物制造國家地方聯(lián)合工程研究中心(浙江工業(yè)大學(xué)),浙江 杭州,310014)

D-泛酸是水溶性的B族復(fù)合維生素(B5),作為合成輔酶A和酰基載體蛋白的一種前體發(fā)揮作用[1-2]。作為一種重要的生長因子,D-泛酸參與碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪酸的代謝[3]。目前,D-泛酸被廣泛用于醫(yī)藥、食品、飼料工業(yè)等領(lǐng)域[4-5]。

D-泛酸的生產(chǎn)方法主要包括物理誘導(dǎo)結(jié)晶法、化學(xué)拆分法和生物法。物理誘導(dǎo)結(jié)晶法工藝成熟,但只能生產(chǎn)泛酸鈣,無法用于其他泛酸衍生物的生產(chǎn)。化學(xué)拆分法是目前最主要的合成方法,但拆分劑價(jià)格昂貴,分離困難,還存在毒性和環(huán)境污染問題[6-7]。通過合理運(yùn)用微生物或酶來生產(chǎn)D-泛酸,不僅能夠保證泛酸的拆分質(zhì)量而且還能減低反應(yīng)成本[8],相較化學(xué)法,生物法具有更加綠色環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)[9]。生物酶法是利用泛酸合成酶催化D-泛解酸和β-丙氨酸進(jìn)行縮合反應(yīng)生成D-泛酸,反應(yīng)條件溫和,沒有副產(chǎn)物的生成,更有利于產(chǎn)品分離[10-12]。20世紀(jì)90年代,就有學(xué)者開始研究生物發(fā)酵法生產(chǎn)D-泛酸,并取得了一定的成果。但是目前D-泛酸的產(chǎn)量尚未達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的要求,主要原因是D-泛酸代謝途徑長、分支代謝多,目的產(chǎn)物D-泛酸的積累量不高[13];其次,在D-泛酸合成過程中,需要很多前體物質(zhì),對(duì)培養(yǎng)基要求和發(fā)酵控制比較苛刻[14-16]。

本文以實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的E.coliDPA21/pBCST3為D-泛酸生產(chǎn)菌株,在5 L發(fā)酵罐水平進(jìn)行關(guān)鍵發(fā)酵參數(shù)的優(yōu)化,主要包括在分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中對(duì)發(fā)酵溫度、pH、轉(zhuǎn)速進(jìn)行優(yōu)化,以及在補(bǔ)料分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中對(duì)葡萄糖和β-丙氨酸的流加方式和濃度進(jìn)行優(yōu)化,以進(jìn)一步提高D-泛酸的產(chǎn)量,初步建立高效的發(fā)酵調(diào)控工藝,為后期的工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

E.coliDPA21/pBCST3,保藏于浙江工業(yè)大學(xué)生物工程研究所。E.coliDPA21的基因型為DPA17ΔpoxB ΔpflB ΔldhA ΔilvE。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)(g/L)：蛋白胨10、酵母粉5、NaCl 10。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L、(NH4)2SO416 g/L、KH2PO42 g/L、酵母粉2 g/L、金屬鹽溶液1 mL/L、L-異亮氨酸20 mg/L、MgSO4·7H2O 1.0 g/L、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)0.2 mmol/L、卡那霉素(kanamycin,Kan)50 mg/L、維生素B15 mg/L、維生素B122 mg/L、β-丙氨酸 3 g/L。

金屬鹽溶液(g/L)：CaCl210、FeSO4·7H2O 10、ZnSO4·7H2O 1、CuSO40.20、NiCl2·7H2O 0.02。

補(bǔ)料培養(yǎng)基：葡萄糖500 g/L、(NH4)2SO410 g/L、KH2PO414 g/L、酵母粉2 g/L、金屬鹽溶液1 mL/L、L-異亮氨酸 20 mg/L、MgSO4·7H2O 16 g/L、IPTG 0.2 mmol/L、Kan 50 mg/L、維生素B15 mg/L、維生素B122 mg/L;根據(jù)需要添加質(zhì)量濃度為30～50 g/L的β-丙氨酸。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 種子培養(yǎng)

從培養(yǎng)成熟的平板中挑出單一的菌落,接入到裝有50 mL種子培養(yǎng)基(含有50 mg/L Kan)的500 mL三角瓶中,于37 ℃、150 r/min培養(yǎng)14 h。

1.3.2 發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)

按照15%的接種量將種子液接入5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵罐裝液量為2 L,培養(yǎng)溫度(30±1)℃,通氣量為1.5 vvm,流加30%的氨水和30%的磷酸溶液自動(dòng)控制pH使其維持在(6.8±0.1),初始攪拌轉(zhuǎn)速為400 r/min,后期通過偶聯(lián)攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)溶氧(dissolved oxygen,DO)(維持在15%左右)進(jìn)行調(diào)節(jié),直到發(fā)酵結(jié)束。

流加培養(yǎng)：在分批發(fā)酵的基礎(chǔ)上,根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)定來補(bǔ)加補(bǔ)料培養(yǎng)基。

1.4 分析方法

1.4.1 細(xì)胞濃度測(cè)定

取適量的發(fā)酵液用蒸餾水進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尯?用Eppendorf BioPhotometer測(cè)量600 nm處的吸光值(OD600),使用發(fā)酵液上清液作為對(duì)照,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成菌體干重(dry cell weight,DCW),按公式(1)計(jì)算：

DCW(g/L)=0.393 5×OD600+0.014 8

(1)

1.4.2 葡萄糖含量檢測(cè)

葡萄糖濃度采用DNS法[17]進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.3D-泛酸檢測(cè)

將發(fā)酵液樣品在12 000 r/min離心5 min,取1 mL上清液按照一定的比例進(jìn)行稀釋使D-泛酸的含量檢測(cè)值在儀器的檢測(cè)范圍內(nèi);通過無菌濾膜過濾后,D-泛酸的濃度使用HPLC進(jìn)行檢測(cè)。

HPLC檢測(cè)條件：儀器為日本日立(HITACHI)公司Primaide,色譜柱型號(hào)為Eclipse XD8-C18(5 μm,4.6 mm×250 mm),柱溫30 ℃,檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器,檢測(cè)波長210 nm,流動(dòng)相體積比A(磷酸)∶B(乙腈)∶C(水)=1∶50∶950,流速0.9 mL/min,進(jìn)樣量10 μL。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用Excel和Origin 2018軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 5 L發(fā)酵罐分批培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.1.1 不同培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)D-泛酸的影響

溫度是影響微生物生長和存活的主要環(huán)境因素之一,溫度對(duì)發(fā)酵的影響主要表現(xiàn)在對(duì)細(xì)胞生長、產(chǎn)物合成、發(fā)酵液的物理性質(zhì)和生物合成方向等方面。為確定最佳發(fā)酵溫度,在其他條件不變的條件下,分別設(shè)置不同的溫度(27、30、33 ℃)進(jìn)行分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

如圖1所示,在3種不同的溫度下,菌體生長情況在發(fā)酵后期無顯著差別,葡萄糖在22 h左右消耗完,此時(shí)細(xì)胞干重開始呈現(xiàn)穩(wěn)定趨勢(shì)。但由于D-泛酸的生物合成與菌體生長并不是完全耦合的,在基質(zhì)消耗完全后仍會(huì)利用發(fā)酵液中的有機(jī)酸(D-泛解酸、α-酮戊二酸和α-酮異戊酸)和氨基酸(β-丙氨酸、L-谷氨酸)等其他物質(zhì)繼續(xù)合成D-泛酸,最終產(chǎn)量分別達(dá)到5.31、7.30和6.56 g/L。當(dāng)發(fā)酵溫度從27 ℃升高至30 ℃時(shí),D-泛酸產(chǎn)量隨之增加;隨著發(fā)酵溫度的進(jìn)一步升高(33 ℃),D-泛酸產(chǎn)量隨之下降,原因可能為高溫會(huì)影響D-泛酸合成途徑中一些關(guān)鍵酶的活力。因此,選擇30 ℃作為分批發(fā)酵的溫度。

a-菌體生長;b-D-泛酸生產(chǎn);c-葡萄糖消耗圖1 不同培養(yǎng)溫度下D-泛酸發(fā)酵參數(shù)Fig.1 Fermentation parameters of D-pantothenic acid at different temperatures

2.1.2 不同pH對(duì)D-泛酸生產(chǎn)的影響

隨著菌種對(duì)培養(yǎng)基中碳、氮源的利用以及有機(jī)酸和氨基酸的積累,培養(yǎng)液的pH會(huì)發(fā)生一定的變化。pH值主要影響菌體內(nèi)某些關(guān)鍵酶的活性,從而影響產(chǎn)物的產(chǎn)量。pH對(duì)D-泛解酸內(nèi)酯水解酶活力影響顯著[18],而D-泛酸內(nèi)酯水解酶是泛酸合成中的關(guān)鍵酶,當(dāng)pH為6.0～7.5時(shí)最有利于D-泛酸的合成。因此本實(shí)驗(yàn)選擇pH為6.2～7.4進(jìn)行研究。

由圖2可知,在pH 6.2～7.4,pH為6.8時(shí)的菌體生長和D-泛酸合成量在整個(gè)培養(yǎng)過程中均略高于其他pH值時(shí)的水平,因此,選擇pH 6.8作為發(fā)酵pH。

a-菌體生長;b-D-泛酸生產(chǎn);c-葡萄糖消耗圖2 不同pH條件下D-泛酸發(fā)酵參數(shù)Fig.2 Fermentation parameters of D-pantothenic acid at different pH

2.1.3 不同DO對(duì)D-泛酸生產(chǎn)的影響

如圖3所示,在發(fā)酵的前12 h,菌體生長情況基本一致,而發(fā)酵12 h后呈現(xiàn)不同的變化降勢(shì),5%、15%和25%條件下的DCW分別為7.08、7.57和7.44 g/L。DO為5%時(shí)菌體量較低,這說明攪拌轉(zhuǎn)速過低可能會(huì)造成供氧不足,從而影響菌體生長;而過高的轉(zhuǎn)速會(huì)產(chǎn)生剪切力,對(duì)菌體造成一定損傷,使其過早衰亡或自溶[20]。而18 h后,DO為15%時(shí)的D-泛酸產(chǎn)量高于其他2個(gè)溶氧條件下的產(chǎn)量,綜合考慮菌體生長、D-泛酸產(chǎn)量以及工業(yè)生產(chǎn)中能耗的因素,選擇15%作為分批發(fā)酵的溶氧水平。

a-菌體生長;b-D-泛酸生產(chǎn);c-葡萄糖消耗圖3 不同DO條件下D-泛酸發(fā)酵參數(shù)Fig.3 Fermentation parameters of D-pantothenic acid at different DO levels

2.2 β-丙氨酸補(bǔ)料方式和濃度對(duì)發(fā)酵的影響

在發(fā)酵參數(shù)確定的基礎(chǔ)上,對(duì)β-丙氨酸的補(bǔ)料方式進(jìn)行優(yōu)化。主要分為β-丙氨酸與糖混合流加和β-丙氨酸單獨(dú)流加2種方式,β-丙氨酸的質(zhì)量濃度為30、40、50 g/L。

由圖4和圖5可知,在2種不同的β-丙氨酸補(bǔ)料條件下,D-泛酸的最高產(chǎn)量均在β-丙氨酸質(zhì)量濃度40 g/L時(shí),混合流加方式下最高產(chǎn)量為40.25 g/L,高于分開流加時(shí)的27.38 g/L。比較在同一種β-丙氨酸流加方式不同濃度時(shí),發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵20 h左右,即開始補(bǔ)糖時(shí),D-泛酸的合成速率出現(xiàn)差異,流加質(zhì)量濃度為50 g/L時(shí),D-泛酸合成速率最高,但快速進(jìn)入生產(chǎn)穩(wěn)定期。流加質(zhì)量濃度為40 g/L時(shí),D-泛酸合成速率先增大后減小,緩慢進(jìn)入穩(wěn)定期。當(dāng)流加質(zhì)量濃度為30 g/L時(shí),D-泛酸的合成速率較補(bǔ)料前有所下降,但D-泛酸產(chǎn)量一直處于緩慢增長狀態(tài)。說明β-丙氨酸的流加濃度對(duì)D-泛酸的合成有顯著的影響。原因可能為在20 h左右菌體內(nèi)合成D-泛酸的相關(guān)酶活力較高,能夠?qū)⑤^高濃度的β-丙氨酸轉(zhuǎn)化合成D-泛酸。在35 h左右,菌體的活力開始下降,不能夠迅速地將β-丙氨酸進(jìn)行轉(zhuǎn)化,此時(shí),β-丙氨酸消耗速率小于補(bǔ)給速率,使胞外β-丙氨酸大量積累,從而抑制D-泛酸的合成。

a-30 g/L;b-40 g/L;c-50 g/L圖4 混合流加方式下β-丙氨酸的濃度優(yōu)化Fig.4 Optimization of β-alanine concentration in mixed feeding mode

a-30 g/L;B-40 g/L;C-50 g/L圖5 單獨(dú)流加方式下β-丙氨酸的濃度優(yōu)化Fig.5 Optimization of β-alanine concentration under separate feeding mode

2.3 葡萄糖補(bǔ)料方式優(yōu)化

在β-丙氨酸的補(bǔ)料工藝確定的基礎(chǔ)上,對(duì)補(bǔ)糖工藝進(jìn)行優(yōu)化。葡萄糖作為一種重要的發(fā)酵底物,對(duì)微生物生長和代謝至關(guān)重要。從前期的分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),在D-泛酸分批發(fā)酵結(jié)束時(shí),菌體生長和D-泛酸合成都沒有出現(xiàn)快速的下降。因此在葡萄糖耗盡之前如果及時(shí)補(bǔ)充葡萄糖,將可以提高產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率。目前,葡萄糖的流加方式有很多種,本實(shí)驗(yàn)結(jié)合D-泛酸合成的特性,采用2種補(bǔ)料方式,即脈沖補(bǔ)料和勻速補(bǔ)料進(jìn)行D-泛酸的發(fā)酵。理論上較低的葡萄糖濃度更有利于發(fā)酵[21],根據(jù)前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)和ZHANG等[16]的研究,發(fā)現(xiàn)糖質(zhì)量濃度維持在5 g/L左右時(shí)有利于D-泛酸的積累。所以當(dāng)殘余葡萄糖質(zhì)量濃度下降到5 g/L或以下時(shí)開始進(jìn)行葡萄糖流加。

2.3.1 不同脈沖濃度對(duì)D-泛酸發(fā)酵的影響

由圖6可知,在3種不同脈沖(5～10、5～20、5～30 g/L)條件下,DCW變化趨勢(shì)相似。在發(fā)酵后期,當(dāng)脈沖質(zhì)量濃度為5～30 g/L時(shí),D-泛酸的合成早于其他2種條件下達(dá)到平衡,但產(chǎn)量較低;而脈沖質(zhì)量濃度為5～10 g/L時(shí),D-泛酸的產(chǎn)量明顯高于其他2種條件下的水平,達(dá)到41.5 g/L,表明低濃度的葡萄糖更有利于D-泛酸的合成。

a-5～10 g/L;b-5～20 g/L;c-5～30 g/L圖6 不同脈沖糖濃度對(duì)D-泛酸發(fā)酵的影響Fig.6 Effects of different pulsed glucose concentrations on D-pantothenic acid production

2.3.2 不同恒速補(bǔ)糖對(duì)D-泛酸發(fā)酵的影響

分別以2.0、2.5和3.0 g/(L·h)進(jìn)行勻速補(bǔ)糖。由圖7-a可知,當(dāng)補(bǔ)糖速率為2.0 g/(L·h)時(shí),發(fā)酵過程中出現(xiàn)較長時(shí)間的低糖(<5 g/L)階段,菌體生長較緩慢。而當(dāng)補(bǔ)糖速率為2.5 g/(L·h)時(shí)(圖7-b),糖質(zhì)量濃度可以很好地控制在5～10 g/L,菌體生長速率也相對(duì)更快,最終D-泛酸產(chǎn)量達(dá)到32.33 g/L。而當(dāng)補(bǔ)糖速率為3.5 g/(L·h)時(shí)(圖7-c),發(fā)酵后期由于補(bǔ)糖速率超過菌體耗糖速率,發(fā)酵液中糖濃度過高而導(dǎo)致菌體生長和D-泛酸受到影響。總體而言,在勻速補(bǔ)料條件下,D-泛酸的最高產(chǎn)量(32.33 g/L)明顯低于間歇性補(bǔ)料(5～10 g/L)的最高產(chǎn)量(41.5 g/L)。因此,最佳的葡萄糖流加方式為脈沖補(bǔ)料,質(zhì)量濃度為5～10 g/L。

a-2.0 g/(L·h);b-2.5 g/(L·h);c-3.0 g/(L·h)圖7 不同勻速補(bǔ)糖對(duì)D-泛酸發(fā)酵的影響Fig.7 Effects of different rates of glucose supplementation on D-pantothenic acid production

3 結(jié)論

通過對(duì)D-泛酸發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行考察,確定5 L發(fā)酵罐的最佳培養(yǎng)條件為溫度30 ℃、pH 6.8、DO 15%,確定了最佳的β-丙氨酸流加方式,即與葡萄糖溶液混合流加,且β-丙氨酸質(zhì)量濃度最佳為40 g/L。在此基礎(chǔ)上,通過比較脈沖補(bǔ)料和勻速補(bǔ)料方式確定葡萄糖以5～10 g/L的質(zhì)量濃度進(jìn)行脈沖式補(bǔ)料對(duì)于提高D-泛酸的產(chǎn)量效果更好,D-泛酸的最高產(chǎn)量達(dá)到41.5 g/L。后續(xù)需進(jìn)一步縮短反應(yīng)時(shí)間,簡(jiǎn)化發(fā)酵操作流程來提高產(chǎn)量以達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)。