鄭平 陳偉 鄭艷

[摘要] 目的 探討三甲胺-N-氧化物（TMAO）與腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）在人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）炎癥中的關系及作用機制。方法 ELISA檢測來自2020年9—12月福州市中醫(yī)院心血管內科的動脈粥樣硬化（AS）患者（n=36）與正常人（n=25）血漿中TMAO、血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）的表達情況;采用不同梯度的TMAO干預HUVECs細胞誘導炎癥;通過CCK-8法檢測HUVECs細胞增殖;劃痕實驗分析HUVECs細胞遷移;血管形成實驗分析內皮細胞的功能障礙;通過ELISA實驗檢測各組HUVECs細胞炎癥因子白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-18（IL-18）、內皮型一氧化氮合酶（eNOS）水平;通過WB實驗檢測RAS系統(tǒng)中血管緊張素原（AGT）、血管緊張素轉化酶（ACE）、AngⅡ及血管緊張素受體（ATR）的表達。結果 相比于正常人，AS患者血漿中TMAO與AngⅡ高表達，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;成功建立了不同梯度濃度的TMAO干預HUVECs細胞的炎癥模型;TMAO干預后抑制細胞增殖，且呈劑量依賴性;TMAO能夠抑制HUVECs細胞的遷移能力;TMAO干預后內皮細胞血管成環(huán)數(shù)減少，環(huán)變小，抑制血管形成;TMAO干預后促進炎癥因子IL-1β、IL-18的表達，抑制eNOS的表達;在TMAO干預下RAS系統(tǒng)中的AGT、ACE、ANGⅡ及ATR的表達水平均顯著升高。結論 TMAO能夠調節(jié)RAS系統(tǒng)誘導HUVECs炎癥。

[關鍵詞] 三甲胺-N-氧化物;RAS系統(tǒng);HUVECs炎癥;血管緊張素Ⅱ

[中圖分類號] R965? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2022）06-0028-05

[Abstract] Objective To explore the relationship and mechanism of trimethylamine-N-oxide（TMAO） and renin-angiotensin system （RAS） in the inflammation of human umbilical vein endothelial cells （HUVECs）. Methods The expression of the plasma levels of TMAO and Angiotensin Ⅱ （AngⅡ） in the atherosclerosis （AS） patients （n=36） and the healthy people （n=25） from the Department of Cardiovascular Medicine， Fuzhou Traditional Chinese Medicine Hospital from September to December 2020 were detected by ELISA; different gradients of TMAO was used to interfere with HUVECs to induce inflammation; HUVECs proliferation was detected by CCK-8 method; Scratch test was used to analyze HUVECs migration; the dysfunction of endothelial cells was analyzed by angiogenesis assay; the levels of inflammatory factors， such as interleukin-1β （IL-1β）， interleukin-18 （IL-18） and endothelial nitric oxide synthase （eNOS）， in each group of HUVECs were detected by ELISA; the expression of angiotensinogen （AGT）， angiotensin converting enzyme （ACE）， AngⅡ and angiotensin receptor （ATR） in the RAS system was detected by WB assay. Results Compared with the healthy people， TMAO and AngⅡ were highly expressed in the plasma of AS patients， and there were significant differences（P<0.05）; different gradient concentrations of TMAO were successfully established to interfere with the inflammation model of HUVECs; after TMAO intervention， cell proliferation was inhibited in a dose-dependent manner; TMAO was able to inhibit the migration ability of HUVECs; after the intervention of TMAO， the number of endothelial cell vascular loops was decreased and the loops became smaller， which inhibited the formation of blood vessels; after TMAO intervention， the expression of inflammatory factors IL-1β and IL-18 was promoted， and the expression of eNOS was inhibited; under the intervention of TMAO， the expression levels of AGT， ACE， ANGⅡ and ATR in the RAS system were significantly increased. Conclusion TMAO can regulate the RAS system to induce the inflammation of HUVECs.

[Key words] Trimethylamine-N-oxide ; RAS system; HUVECs inflammation; Angiotensin Ⅱ

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是心血管疾病的主要病理基礎。既往研究已證實腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）是促進AS的一個獨立危險因素[1]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群及其代謝產物三甲胺-N-氧化物（trimetrylamine oxide，TMAO）是促進AS發(fā)生的一個新的獨立危險因素[2]。研究發(fā)現(xiàn)，TMAO通過膽汁酸途徑影響脂質代謝[3];通過上調巨噬細胞清道夫受體，誘導泡沫細胞形成[4]，促進AS斑塊發(fā)生。TMAO通過激活ROS-TXNIP-NLRP3炎性小體，抑制eNOS/NO合成[5]，抑制人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）增殖、遷移和粘附，導致內皮炎癥和功能障礙，促進AS的早期病理過程[6]。此外，循環(huán)TMAO升高，會誘導HUVECs異常增殖和遷移受損，導致血管功能障礙和重構，加速血管衰老[7]。AS患者中TMAO 水平升高，通過調節(jié)脂質代謝和炎癥，增加AS發(fā)生風險[8]。

過去，將TMAO、RAS組分血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，AngⅡ）單獨作為AS發(fā)生的風險因素進行研究，TMAO誘導AS血管炎癥反應的機制是否與RAS系統(tǒng)有關，尚未見到報道。因此，本文將在HUVECs中探討TMAO與RAS的關系及作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料來源

36例AS患者與25例正常人血漿樣本來自2020年9—12月福州市中醫(yī)院心血管內科;本研究經福州市中醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審查批準（批件號：2019-09-05-01）。人臍靜脈血管內皮細胞HUVECs購自武漢普諾賽生命科技有限公司;TMAO購自阿拉丁;Lipofectamine3000、LipofectamineTM 2000 Transfection Reagent購自Invitrigen;DMEM-H培養(yǎng)基、Penicillin-Streptomycin（10，000 U/mL）、Trypsin-EDTA （0.25%）、phenol red、L-Glutamine 200 mM（100×）、0.25%Trypsin-EDTA（1×）購自Gibco;優(yōu)質胎牛血清FBS購自PAN biotech;PBS購自Hyclone;Qpcr Mix購自PROMEGA;彩色預染蛋白質分子量購自碧云天;BCA 蛋白濃度測定試劑盒（50T）、5×蛋白上樣緩沖液、Human eNOS ELISA KIT購自北京索萊寶科技有限公司;ECL發(fā)光試劑購自Thermo;NucleoZol購自基因生物技術國際貿易（上海）有限公司;Cell Counting Kit-8 （CCK-8）購自Dojindo;Human IL-18 ELISA Kit、Human IL-1 beta ELISA Kit購自博士德生物;Corning matrigel basement membrane matrix購自Corning;Human Angiotensin Ⅱ（AngⅡ）ELISA kit購自SAB;人三甲基胺氧化物（TMAO）酶聯(lián)免疫分析購自上海酶免;GAPDH Monoclonal antibody、Angiotensinogen Polyclonal Antibody、ACE Polyclonal Antibody、ATR Polyclonal Antibody、Angiopoietin 2 Polyclonal Antibody購自Proteintech。

1.2 方法

1.2.1 ELISA法檢測AngⅡ濃度? 準備好稀釋后的標準品、空白和樣品孔。標準孔7孔，空白孔1孔。分別在相應孔中加入標準品、空白和樣品稀度各50 μl。然后立即在每孔中加入50 μl的檢測試劑A。輕輕搖板，用封板器蓋住。37℃孵育1 h。各孔取1×洗滌液300 μl，靜置1～2 min。將孔板輕拍在吸水紙上，將所有孔中的剩余液體完全除去，共洗3次。在最后一次清洗后，將孔板倒置，用吸水紙吸干。每孔加檢測試劑B工作液100 μl。蓋上封板膜，37℃孵育1 h，清洗5次，甩孔中液體。每孔加90 μl底物溶液。用新的封板器蓋住。37°C孵育15～25 min（不超過30 min）。避光。隨著底物溶液的加入，液體會變藍。每孔加50 μl終止液，加入終止液后，液體會變黃。通過輕拍孔板的側面混合液體。擦拭孔板底部的水滴和指紋，確認液體表面沒有氣泡，酶標儀450 nm處檢測OD值。

1.2.2 ELISA法檢測TMAO濃度? 根據(jù)說明書稀釋標準品，分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣 50 μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μl，然后再加待測樣品 10 μl（樣品最終稀釋度為5倍）。將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。用封板膜封板后置37℃溫育30 min。將試劑盒中的洗滌液稀釋至1×后使用。板溫育后，小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 s后棄去，如此重復5次，拍干。每孔加入酶標試劑 50 μl，空白孔除外，37℃溫育30 min，洗5次板。每孔先加入顯色劑A 50 μl，再加入顯色劑B 50 μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10 min，每孔再加入50 μl終止液，終止反應（此時藍色立轉黃色）。以空白孔調零，450 nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。測定應在加終止液后15 min內進行。

1.3不同濃度TMAO干預HUVECs誘導炎癥

將培養(yǎng)至對數(shù)生長的HUVECs細胞消化后，接種于6孔板中，保持每孔中的細胞數(shù)量差不多，置于5%CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待每孔細胞密度達到60%，每孔中分別加入0、100、200、300、400、600 mM的TMAO進行干預，細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。

1.4 CCK-8檢測細胞增殖

將上述不同濃度TMAO干預的HUVECs細胞分別接種于不同的96孔板中，保持每孔中的細胞數(shù)量差不多，待每孔細胞密度為50%～70%時，分別在0、24、48、72 h四個時間點向每孔細胞中加入10 μl 10% CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1～2 h。用酶聯(lián)免疫檢測儀在OD450 nm處檢測各孔的吸光值。

1.5 Western-blot檢測細胞中蛋白表達情況

收集細胞加入含PMSF的蛋白裂解液，冰上靜置20 min，4℃，12 000 rpm離心20 min，取上清蛋白液于EP管中。BCA蛋白測定法檢測樣品總蛋白濃度，沸水變性后進行SDS-PAGE電泳、轉膜，用5%BSA，40 rpm搖床上室溫封閉2 h。封閉完后將NC膜放入裝有一抗的抗體雜交盒中，搖床4°C孵育過夜。第2天用TBST洗滌孵育好的NC膜，洗3次，每次10 min。清洗完畢后，將NC膜放入1∶5000稀釋的鼠二抗雜交盒中，水平搖床上室溫孵育2 h;如果室溫高同樣可適當縮短時間。結束后，同樣用TBST洗3次，每次10 min。將NC膜平置于透明膜上，Thermo ECL試劑盒的A液和B液等體積混合后加到膜表面，暗處靜置3 min后去除膜上發(fā)光液，置于透明膜上。采用凝膠成像系統(tǒng)Versa DocTM imaging system發(fā)光檢測，收集條帶圖像。用凝膠成像系統(tǒng)分析條帶灰度值，確定樣品中目的蛋白表達的相對含量。

1.6內皮細胞血管形成實驗

試驗前1d提前把Matrigel基底膠4℃冰箱解凍，槍頭、96孔板預冷;吸取50 μl/孔Matrigel至96孔板中，整個操作盡量保持低溫環(huán)境（冰上進行），不可以產生氣泡;37℃培養(yǎng)箱放置至少30 min，使試劑充分凝固，凝膠過程中進行細胞消化處理;細胞以3×104/孔加入鋪有Matrigel的96孔板中，每孔100 μl的完全培養(yǎng)基，同樣注意別產生氣泡，槍頭不可觸碰到膠;37℃培養(yǎng)8 h（每隔一段時間觀察），選取最佳成管時間;在倒置顯微鏡下，以100×放大倍數(shù)觀察內皮管形成效果，并隨機選取視野拍照保存。

1.7 劃痕實驗檢測遷移能力

將處于對數(shù)生長期的各實驗組細胞胰酶消化后，完全培養(yǎng)基重懸成細胞懸液，細胞計數(shù)，調整懸液濃度為 3×105 cells/ml，24 h后，細胞能剛剛長滿單個小孔。在 ibidi 細胞插件的每孔中加入70 μl的細胞懸液，注意不要大力晃動培養(yǎng)皿，以防止細胞不均勻;當所有細胞均貼壁且剛長滿時，用鑷子將傷口愈合插件提出，加入無血清培養(yǎng)基，0、24 h觀察傷口愈合情況。

1.8 ELISA法檢測HUVECS細胞干預后炎癥因子IL-1β、 IL-18、eNOS表達水平

收集細胞，采用細胞裂解液（用于ELISA）裂解細胞，離心取上清，-80℃保存。嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測炎癥因子IL-1β、IL-18、eNOS水平。

1.9 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件進行實驗數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗;多組比較采用單因素方差分析;不符合正態(tài)分布時，采用非參數(shù)檢驗。計數(shù)資料采用χ2檢驗，多因素分析采用logistic回歸分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TMAO與AngⅡ在AS患者血漿中高表達

TMAO與AngⅡ在AS患者和正常人血漿中的表達情況分別如圖1A、圖1B所示。AS患者血漿中的TMAO與AngⅡ的濃度均明顯高于正常人，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.2 TMAO能夠抑制HUVECs細胞的增殖

為了進一步證明TMAO是否能影響AS的發(fā)生，建立了6個不同梯度濃度下的TMAO干預HUVECs細胞的炎癥模型，利用CCK-8實驗檢測細胞的增殖情況。TMAO對HUVECs細胞的增殖影響情況見圖2。當TMAO對HUVECs細胞的干預濃度為100 mM時，隨著干預時間的增加，HUVECs細胞的活性始終比TMAO的干預濃度為0 mM時低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。且TMAO的干預濃度越高，HUVECs細胞的活性越低，不同濃度下HUVECs細胞的活性均有顯著差異。

2.3 TMAO能夠抑制HUVECs細胞的遷移能力

不同TMAO干預濃度下HUVECs細胞的遷移情況見圖3。圖3A為細胞劃痕圖，在4種TMAO干預濃度下，HUVECs細胞生長24 h后，劃痕愈合面積最多的是無TMAO干預的細胞，其次是TMAO干預濃度為200 mM的細胞，而濃度為400 mM與600 mM時，劃痕愈合面積明顯較少。圖3B為劃痕愈合面積的量化圖。由此可知，當TMAO干預濃度為200 mM、400 mM、600 mM時劃痕愈合面積顯著小于TMAO干預濃度為0 mM時，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01，P<0.01），且TMAO干預濃度越高細胞越難愈合。

2.4 TMAO的干預抑制了血管的形成

為了驗證TMAO是否對血管形成產生影響，利用內皮細胞血管形成實驗觀察4種TMAO干預濃度下血管的形成情況（封三圖3）。當TMAO干預濃度為0 mM時，HUVECs細胞成環(huán)數(shù)較多，環(huán)較大，成環(huán)情況較好;當TMAO干預濃度為200 mM時，細胞成環(huán)數(shù)較少且環(huán)較小;當TMAO干預濃度為400 mM和600 mM時成環(huán)數(shù)明顯少于前兩組，且成環(huán)情況較差，TMAO的濃度越高越難形成血管。

2.5 TMAO干預HUVECs細胞后促進炎癥因子白細胞介素-1β（IL-1β），白細胞介素-18（IL-18）的表達，抑制內皮型一氧化氮合酶（eNOS）的表達

利用ELISA法檢測不同TMAO干預濃度下HUVECs細胞中IL-1β、IL-18及eNOS濃度的表達情況見圖4。當TMAO干預濃度為400 mM和600 mM時，與無TMAO干預相比，HUVECs細胞中IL-1β濃度顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）;當TMAO干預濃度為200 mM、400 mM和600 mM時，與無TMAO干預相比，HUVECs細胞中IL-18濃度顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.001）;當TMAO的干預濃度為200 mM、400 mM和600 mM時，與無TMAO干預相比，HUVECs細胞中eNOS濃度顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.001）。

2.6 TMAO干預HUVECs細胞后促進RAS系統(tǒng)血管緊張素原（AGT）、血管緊張素轉換酶（ACE）、AngⅡ和血管緊張素受體（ATR）的表達

為了探討TMAO與RAS系統(tǒng)的關系，利用WB實驗檢測了TMAO干預HUVECs細胞后RAS系統(tǒng)中AGT、ACE、AngⅡ和ATR的蛋白表達量。封三圖4為不同TMAO干預濃度下HUVECs細胞中AGT、ACE、AngⅡ、ATR蛋白的表達情況。封三圖4A為WB結果圖，AGT、ACE、AngⅡ、ATR蛋白印跡隨著TMAO干預濃度的增加而加深;封三圖4B為封三圖4A的量化圖，AGT、ACE、AngⅡ、ATR蛋白的表達量隨著TMAO干預濃度的增加皆顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01，P<0.001）。

3 討論

AS是心血管疾病中主要的致死原因，其對人體的健康造成極大的威脅。AS的發(fā)病機制復雜，由多種危險因素共同作用引起，已有多項研究表明，代謝紊亂、免疫反應、炎癥及內皮功能障礙均能導致AS的發(fā)生，其中血管壁的慢性炎癥反應是AS發(fā)生發(fā)展的主要因素[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，TMAO可誘導內皮細胞功能障礙及促進血管炎癥，從而引發(fā)AS的發(fā)生發(fā)展[10]，RAS系統(tǒng)是血壓調控系統(tǒng)，該系統(tǒng)中的AngⅡ作為主要效應分子參與AS的發(fā)展，但TMAO與RAS系統(tǒng)在AS中是否能夠相互影響還未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)TMAO與AngⅡ在AS患者血漿中均高表達，說明TMAO與RAS系統(tǒng)可能共同影響AS的發(fā)生發(fā)展。血管內皮細胞損傷后會引發(fā)炎癥[11]、功能衰退，誘導白細胞向血管炎癥部位聚集[12]，促進AS的發(fā)生發(fā)展，是AS發(fā)病的重要因素之一[13]，因此本研究利用HUVECs細胞探討TMAO對內皮功能障礙的影響。本研究構建TMAO干預后的HUVECs細胞炎癥模型，發(fā)現(xiàn)TMAO能夠抑制HUVECs細胞增殖、遷移及血管形成，且呈劑量依賴性抑制，說明TMAO能夠導致血管內皮功能障礙，從而誘發(fā)AS，與Ma等[6]的研究結果一致。Sun等[5]首次證明TMAO可激活ROS-TXNIP-NLRP3炎癥小體從而誘導炎癥和內皮功能障礙，炎癥小體的激活促進了炎癥因子IL-1β與IL-18的表達，且抑制了內皮型一氧化氮合酶eNOS的表達。本研究結果顯示，不同濃度的TMAO干預下的HUVECs細胞中的IL-1β與IL-18呈劑量性依賴顯著增加，eNOS的濃度則顯著下降，與上述研究者的研究結果一致，說明TMAO能夠誘導血管炎癥，且進一步證明HUVECs細胞炎癥模型的成功構建。因此在此基礎上本文利用該模型探討TMAO與RAS系統(tǒng)的關系。本研究通過WB檢測不同濃度TMAO干預后HUVECs細胞中AGT、ACE、AngⅡ和ATR的蛋白表達量，結果顯示TMAO干預HUVECs細胞后促進了RAS系統(tǒng)AGT、ACE、AngⅡ和ATR的表達，且有呈TMAO劑量依賴性增加的趨勢。有研究表明，AngⅡ作為RAS系統(tǒng)的末端活性產物也可促進血管壁的炎癥反應，而ACE的抑制劑能夠阻斷該系統(tǒng)所導致的炎癥反應，血管內皮細胞的功能得到改善，緩解了AS的發(fā)生[14];與TMAO一樣，RAS系統(tǒng)的激活也同樣會導致內皮功能障礙[15]。結合本研究的結果可以說明TMAO能夠調節(jié)RAS系統(tǒng)誘導HUVECs發(fā)生炎癥。

綜上所述，TMAO與AngⅡ在AS患者血漿中高表達預示著TMAO與RAS系統(tǒng)可能共同影響AS的發(fā)生發(fā)展，通過利用TMAO干預建立HUVECs細胞炎癥模型，驗證了TMAO能夠抑制HUVECs細胞的增殖、遷移以及血管的形成導致血管內皮功能障礙，且TMAO能夠促進IL-1β與IL-18的表達，抑制eNOS的表達，說明TMAO能夠誘導血管炎癥。該模型中RAS系統(tǒng)AGT、ACE、AngⅡ和ATR蛋白表達量呈TMAO劑量依賴性增加，說明TMAO能夠調節(jié)RAS系統(tǒng)誘導HUVECs發(fā)生炎癥。而這兩者之間相互作用的具體機制還需要進一步探討。聯(lián)合檢測TMAO和RAS可能更有助于AS的臨床評估，同時針對TMAO和RAS的治療策略或許是AS治療的一個新方向。

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（收稿日期：2021-06-08）