褐藻膠寡糖的制備、分離及表征研究進展

劉以晴，馬月云，劉宗浩，左依瑾，汪秋寬，武 龍，周 慧,3,

（1.大連海洋大學食品科學與工程學院，遼寧 大連 116023；2.河南工業(yè)大學糧油食品學院，河南 鄭州 450001；3.大連工業(yè)大學海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116034）

褐藻膠（Alginate）是一種主要從海帶、巨藻、裙帶菜、馬尾藻等褐藻中提取的水溶性酸性多糖[1?2]，棕色固氮菌、綠膿桿菌等微生物經(jīng)培養(yǎng)也可產(chǎn)生褐藻膠[3]。據(jù)調(diào)查顯示，褐藻膠的世界產(chǎn)量約為30000 t/年[4]。褐藻膠分子是由β-D-甘露糖醛酸（M）和α-L-古洛糖醛酸（G）兩種同分異構(gòu)單體通過1→4糖苷鍵連接而成的直鏈線型嵌段多糖，主要有均聚甘露糖醛酸（PM）、均聚古洛糖醛酸（PG）和異聚褐藻膠（PMG）三種排列方式[3,5]（見圖1）。褐藻膠的M/G、分子量、乙?；潭鹊冉Y(jié)構(gòu)特征，直接影響其粘度、凝膠性、水溶性等物理化學性質(zhì)[6]。褐藻膠作為增稠劑、乳化劑、品質(zhì)改良劑等食品添加劑廣泛應用于食品加工領(lǐng)域。但是由于褐藻膠的分子量較大、凝膠性強、粘度大、不易被機體吸收，限制了其更多潛在的應用[7]。

圖1 褐藻膠的結(jié)構(gòu)單體G和M，褐藻膠的均聚片段polyM和polyG，以及雜聚片段polyMG/GM[3]Fig.1 Structural monomers G and M, homopolymer fragments polyM and polyG,and heteropoly fragment polyMG/GM of alginate[3]

褐藻膠寡糖（Alginate oligosaccharides，AOS）是由褐藻膠通過物理、化學及生物方法降解生成的、聚合度2～25的線性寡糖[3,8]。AOS由于分子量小、水溶性好，克服了褐藻膠粘度大、不易被機體吸收的缺點[9]，并且具有獨特的保鮮[10]、抑菌性[11]、抗腫瘤[12]、抗氧化[13]、降血壓[14]、降血糖[15]、促進植物生長[16]、誘導植物抗性[17]等多種生物活性，因此在食品、保健品、醫(yī)藥和綠色農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域的研究和應用得到了極大的發(fā)展。褐藻膠寡糖的生物活性與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，而降解方法和分離技術(shù)又直接影響著得到褐藻膠寡糖的分子量、化學結(jié)構(gòu)和純度等性質(zhì)[18]。因此，本文對褐藻膠寡糖的制備方法、分離技術(shù)及結(jié)構(gòu)表征進行了綜述，并對其未來的發(fā)展提出了展望，以期為未來褐藻膠寡糖的應用和發(fā)展提供理論參考依據(jù)。

1 褐藻膠寡糖的制備

1.1 物理降解法

物理降解法是指通過輻射[19?20]、高溫高壓[21]等物理手段使褐藻膠中糖苷鍵斷裂生成褐藻膠寡糖的方法。目前研究報道較多的物理降解法主要有輻射法和熱液法。

1.1.1 輻射法 輻射降解法是褐藻膠在高能射線的作用下使糖苷鍵發(fā)生斷裂，從而生成褐藻膠寡糖的一種方法[22]。

El-Mobby等[19]使用60Co的γ射線在劑量為20～100 kGy范圍內(nèi)照射褐藻膠，并加入化學引發(fā)劑過硫酸鉀（KPS）產(chǎn)生協(xié)同效應，以提高褐藻膠降解的速率，減少降解所需褐藻膠的劑量。通過調(diào)節(jié)射線的照射劑量和照射時間，可以控制褐藻膠降解產(chǎn)物的分子量。Hu等[23]通過微波降解法降解褐藻膠，在130 ℃、純水體系中使用1600 W微波降解褐藻膠15 min，得到了重均分子量為3200 Da的褐藻膠寡糖，寡糖產(chǎn)率為71%，發(fā)現(xiàn)制得的褐藻膠寡糖的重均分子量隨著輻射時間的延長和降解溫度的增加而顯著降低，實現(xiàn)了褐藻膠寡糖的可控降解。Jankana等[20]使用紫外光照射1 g/L褐藻膠，加入二氧化鈦（TiO2）作為催化劑，在pH7條件下反應3 h，最終得到產(chǎn)率達到90%、富含PolyMG/GM片段的褐藻膠寡糖。

輻射法不需要對環(huán)境進行特殊的控制，操作簡單，使用的催化劑為二氧化鈦，反應完成后過濾容易除去，綠色環(huán)保。但是由于利用輻射法定向制備褐藻膠寡糖的技術(shù)尚不成熟，還未應用于褐藻膠寡糖的大規(guī)模生產(chǎn)。

1.1.2 熱液法 熱液法分為水熱法和溶劑熱液法，其中水熱法較為常見。在水熱法降解過程中，首先將水加熱使其超過臨界點溫度和壓強，由于處于超臨界狀態(tài)的水具有溶解大量氧氣、離子積大、粘度低、表面張力較低和擴散系數(shù)較高等特點，作為新型反應介質(zhì)具有超級催化作用，能在短時間內(nèi)降解褐藻膠[21]。

Matsushima等[24]采用超臨界水法降解褐藻膠，在250 ℃下，1 s內(nèi)可獲得含有98%古洛糖醛酸的均聚物和富含甘露糖醛酸的水溶性雜聚物、重均分子量為670～770 Da的寡糖，通過改變反應壓強和溫度，可以控制制備寡糖的分子量和寡糖分子中M、G的相對含量。Aida等[25]利用熱液法降解褐藻膠，發(fā)現(xiàn)降解過程中糖苷鍵的裂解有選擇性，裂解順序依次是同聚體MM、異聚體MG、同聚體GG，而不是在隨機位點發(fā)生裂解，利用2.0 wt.%的褐藻膠水溶液在高溫條件下（180～240 ℃）可降解成重均分子量為500～800 Da的寡糖，隨著溫度的升高會促進褐藻膠降解為單糖，同時導致單糖分解產(chǎn)生乳酸和乙酸等副產(chǎn)物。

熱液法可以選擇性的降解褐藻膠，實現(xiàn)定向制備褐藻膠寡糖，但是由于強烈的反應條件會導致褐藻膠過度分解而降低產(chǎn)率，產(chǎn)生過多的副產(chǎn)物。

1.2 化學降解法

化學降解法通過氧化劑、酸或堿與褐藻膠作用，使其中的糖苷鍵斷裂而降解為褐藻膠寡糖的一種方法。目前化學降解法主要包括氧化降解法、酸降解法和堿降解法。

1.2.1 氧化降解法 氧化降解法常用的氧化劑有H2O2、NaClO、KMnO4、NaNO2等，并且在Cu2+、Fe2+等催化劑的協(xié)同作用下可以達到更好的降解效果[3]。其中H2O2作為氧化劑降解褐藻膠，綠色環(huán)保且成本低，易于實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，是研究較深入的一種方法[21]。目前較為公認的H2O2降解機理為：H2O2產(chǎn)生羥自由基導致褐藻膠降解。羥自由基隨機攻擊褐藻膠糖鏈上任意糖殘基C-1位上的氫，使分子重排并破壞1-4糖苷鍵，得到褐藻膠寡糖[26]。

H2O2作為氧化劑降解褐藻膠，反應速率受到氧化物濃度、反應時間、反應溫度等因素的影響[27]。Yang等[26]使用濃度為5%的H2O2溶液降解經(jīng)鹽酸預處理的褐藻膠，在90 ℃下反應0.5～4 h，得到聚合度2～15的甘露糖醛酸寡糖，最大產(chǎn)率為58%，且隨著降解時間的延長，低分子量片段逐漸增加；但是由于反應體系中含有H2O2，寡糖中還原端醛基大部分被氧化成羧基。Gan等[28]采用H2O2降解褐藻膠，0.5 mmol H2O2與40 mmol的Fe2+（芬頓試劑）混合，在37 ℃下反應10 h，得到聚合度為2～10的褐藻膠寡糖。李海波等[29]選用體積分數(shù)6%過氧化氫，在60 ℃下降解褐藻膠8 h，得到重均分子量為1000～6000 Da的褐藻膠寡糖，寡糖的產(chǎn)率可達到70%。曹柳[30]選用H2O2降解褐藻膠，得到褐藻膠降解的最佳條件是5%褐藻膠溶液與2% H2O2，在pH5.0、90 ℃反應2 h，得到聚合度為2～9的褐藻膠寡糖。

H2O2降解褐藻膠反應的唯一副產(chǎn)物是H2O，且沒有其它雜質(zhì)，因此被視為一種綠色降解方法，適用于生產(chǎn)低分子量的褐藻膠寡糖。但是依據(jù)現(xiàn)有的機理研究，H2O2對褐藻膠的降解位點隨機，難以控制生成寡糖的結(jié)構(gòu)，且H2O2具有強氧化性，反應過程中會破壞制備寡糖的還原基，影響寡糖的生物活性。

1.2.2 酸降解法 酸降解法是利用鹽酸、草酸、甲酸等無機或有機酸對褐藻膠進行降解的一種方法。褐藻膠中的糖苷鍵在酸性條件下進行水解，首先糖苷氧質(zhì)子化生成共軛酸；然后共軛酸雜化，形成碳氧鎓離子和非還原端；最后水分子迅速進入碳鎓-氧鎓離子中，形成還原末端[31]（如圖2）。

圖2 褐藻膠酸降解法的機理[31]Fig.2 Acid degradation mechanism of alginate[31]

Haug等[32]在100 ℃下使用1 mol/L的草酸降解褐藻膠10 h，得到了聚合度為10～30的甘露糖醛酸片段和古洛糖醛酸片段，寡糖的產(chǎn)率可達到80%。Chandia等[33]使用鹽酸、硫酸和甲酸降解褐藻膠，在100 ℃利用90%甲酸降解褐藻膠6 h，并不能將褐藻膠完全降解，需用1.5 mol/L甲酸在100 ℃下繼續(xù)反應2 h才能將褐藻膠完全降解，但甲酸降解比硫酸、鹽酸降解效率高，且清潔。Leal等[34]在100 ℃用4.5 mL 90%的甲酸降解10 g/L的褐藻膠6 h，褐藻膠寡糖的產(chǎn)率可達到75%。胡博旸等[35]利用0.5 mol/L鹽酸在90 ℃下降解褐藻膠10 h，得到甘露糖醛酸和古洛糖醛酸的總產(chǎn)率為70%，發(fā)現(xiàn)在前6 h內(nèi)產(chǎn)物中還原糖的含量隨時間的延長而增加。

酸降解法制備褐藻膠寡糖可以保留褐藻膠大分子中固有的結(jié)構(gòu)特征，且一次降解可以獲得系列聚合度的寡糖[21]。但是褐藻膠對無機酸的耐受性較強，很難將褐藻膠完全水解；且酸降解反應在較高溫度下進行，反應劇烈不易控制。

1.2.3 堿降解法 堿降解褐藻膠的機理是β-消除反應，在堿性條件下褐藻膠的C-5失去質(zhì)子，由于羧基誘導效應電子從C-4位轉(zhuǎn)移到C-5位，促使1→4糖苷鍵斷裂，并在降解產(chǎn)物的4→5位上形成一個與羧基共軛的雙鍵[36]（如圖3）。

圖3 褐藻膠堿降解法的機理[36]Fig.3 Alkaline degradation mechanism of alginate[36]

Niemela等[37]在氮氣條件下，分別在95 ℃和135 ℃利用0.5 mol/L和2 mol/L的NaOH溶液對褐藻膠處理2.5 h，發(fā)現(xiàn)褐藻膠在高濃度的堿液和較低溫下會降解生成脫水異糖精酸、糖化異糖精酸和2-脫氧-3-C-甲基酒石酸，而在低濃度堿液中主要產(chǎn)物為2,3-二脫氧戊糖酸。Kristiansen等[38]在高碘酸鈉的作用下，在37 ℃、pH10.4～10.3用0.0625 mol/L碳酸鈣降解3 g/L的褐藻膠，得到重均分子量為1000 g/mol的褐藻膠寡糖。由于氧化殘留物二元醛對堿非常敏感，所以經(jīng)高碘酸鹽氧化處理的褐藻膠比未氧化的褐藻膠在堿性條件下更容易降解。

堿降解法操作簡單，但是其降解是通過β-消除反應實現(xiàn)的，會導致原多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，且目標產(chǎn)物的生成量難以控制，易生成甲酸、乙酸、酒石酸等副產(chǎn)物[8]。

1.3 酶降解法

酶降解法是在褐藻膠裂解酶的作用下使褐藻膠中的1→4糖苷鍵斷裂，從而制備褐藻膠寡糖的一種方法[39]。根據(jù)褐藻膠裂解酶對褐藻膠特定片段表現(xiàn)出的底物特異性，可將褐藻膠裂解酶分為：聚甘露糖醛酸特異性裂解酶（polyM）、聚古洛糖醛酸特異性裂解酶（polyG）和雙功能裂解酶（polyMG）[3]。褐藻膠裂解酶一般來源于藻類、海洋微生物和海洋無脊椎動物等，其中對于來源于黃桿菌、弧菌、假交替單胞菌等海洋微生物的褐藻膠裂解酶的研究和應用最為廣泛[3,40?42]。

Boucelkha等[43]在30 ℃下利用來源于黃桿菌、5個單位的聚古洛糖醛酸特異性裂解酶降解1.0%古洛糖醛酸片段6 h后，得到重均分子量為3742 g/mol、數(shù)均分子量為3219 g/mol的古洛糖醛酸寡糖。Li等[44]利用來源于弧菌SY08的、21.5 U/mg的內(nèi)溶性雙功能褐藻膠裂解酶AlySY08在40 ℃、pH7.6下，降解0.3%褐藻膠8 h，得到聚合度為2～5的褐藻膠寡糖，寡糖的產(chǎn)率可達到81%。Xie等[45]運用來源于假交替單胞菌NJ-21的、具備256 U/mg polyM、625 U/mg polyG和303 U/mg polyMG底物特性的褐藻膠裂解酶Al163，在40 ℃、pH7.0下降解0.2%褐藻膠8 h，得到富含二聚體和三聚體的褐藻膠寡糖。Chen等[46]利用來源于芽孢桿菌Alg07的聚甘露糖醛酸特異性褐藻膠裂解酶AlgA，在40 ℃、pH7.5下降解10 g/L的褐藻膠，得到聚合度2～4的褐藻膠寡糖和甘露糖醛酸寡糖。酶降解法制備褐藻膠寡糖的實例研究總結(jié)見表1。

表1 酶降解制備褐藻膠寡糖Table 1 Preparation of alginate oligosaccharides by enzymatic degradation

褐藻膠裂解酶來源廣泛，酶活力高，專一性強、反應條件溫和、耗能少、產(chǎn)物得率較高，可應用于褐藻膠寡糖的定向制備[46?48]。由于酶降解法得到的褐藻膠寡糖為生物活性高的不飽和寡糖，如圖4所示，所以酶降解法是目前研究應用于制備褐藻膠寡糖的主要方法[49]。但是由于不同來源的褐藻膠裂解酶降解褐藻膠的機理和制備寡糖的結(jié)構(gòu)不同。因此，需深入探索不同褐藻膠裂解酶與制備寡糖的結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系。

圖4 酶降解AOS結(jié)構(gòu)[3]Fig.4 The structure of AOS by enzymatic degradation[3]

1.4 發(fā)酵法

發(fā)酵法是將褐藻膠與特定微生物培養(yǎng)，褐藻膠為微生物生長提供碳源，使微生物分泌褐藻膠裂解酶降解褐藻膠，而制備褐藻膠寡糖[3]。

Bang等[50]將枯草芽孢桿菌KCTC 11782BP菌株與含有1.0%褐藻膠共同培養(yǎng)，在37 ℃培養(yǎng)3 d得到的發(fā)酵產(chǎn)物加入到含有3%褐藻膠的培養(yǎng)基中，在37 ℃下培養(yǎng)14 d，得到平均聚合度為5的褐藻膠寡糖。此外，枯草芽孢桿菌KCTC 11872BP和3%褐藻膠在37 ℃下發(fā)酵14 d，可制得重均分子量低于10 kDa的褐藻膠寡糖[3]。Wang等[51]將斜紋芽孢桿菌M3和0.5（w/v）褐藻膠，同0.5% (NH4)2SO4、0.2 KH2PO4、0.1 MgSO4和0.002% FeSO4，在pH7.2、30 ℃下發(fā)酵24 h，得到聚合度2～4的褐藻膠寡糖。趙婉琳等[52]在25 ℃下將?？曝愄厥暇鶫QZ08與7 g/L的褐藻膠共同培養(yǎng)24 h，得到聚合度為2～6的褐藻膠寡糖，寡糖的產(chǎn)率為32.15%。

與傳統(tǒng)工業(yè)化酶法制備褐藻膠寡糖相比，發(fā)酵法制備褐藻膠寡糖成本低、操作簡單。但是發(fā)酵法對于最優(yōu)發(fā)酵條件和優(yōu)質(zhì)發(fā)酵工程菌的研究尚不成熟，目前產(chǎn)率較低，還需要開發(fā)更多活性高的褐藻膠降解菌株應用于發(fā)酵法制備褐藻膠寡糖[53]。

褐藻膠寡糖制備方法的優(yōu)缺點總結(jié)見表2。

表2 褐藻膠寡糖制備方法Table 2 Preparation methods of alginate oligosaccharides

2 褐藻膠寡糖的分離純化

不同結(jié)構(gòu)和組成的褐藻膠寡糖具有不同的生物活性，由于褐藻膠降解產(chǎn)物是由不同分子量的寡糖組成的混合物，所以選用合適的分離方法分離獲得高純度的褐藻膠寡糖，對其構(gòu)效關(guān)系的研究和應用尤為重要。目前褐藻膠寡糖分離純化的方法主要有沉降分離法、膜分離法和色譜分離法等。

2.1 沉降分離法

沉降分離法是一種傳統(tǒng)的、經(jīng)典的分離方法。將寡糖混合物溶解到有機溶劑（如乙醇或丙酮）中，不同分子量的褐藻膠寡糖在有機溶劑中的溶解度不同，分子量較大的寡糖在較低濃度的有機溶劑中容易被沉淀出來，因此通過調(diào)整有機溶劑的濃度，可將不同分子量范圍的寡糖進行分離[54]。

Hu等[23]利用沉降法對褐藻膠寡糖混合液進行初步分離，寡糖混合液通過80%的乙醇離心沉淀后，取上清液干燥再經(jīng)凝膠滲透色譜分離得到10個寡糖組分。Zhang等[55]將乙醇加入到褐藻膠裂解酶降解制備的褐藻膠寡糖混合液中直至體積比為50%，沉降24 h后，取上清液蒸發(fā)，除去占體積比28%的褐藻膠衍生低聚糖，再經(jīng)凝膠滲透色譜分離、紫外檢測得到4個褐藻膠寡糖組分。

沉降分離法不需要特殊的設(shè)備，操作簡單，且應用范圍廣泛，但其分離不完全，常用于褐藻膠寡糖混合物的初步分離。

2.2 膜分離法

膜分離是在濾膜兩側(cè)施加壓力差、濃度差等推動力，使不同大小的物料選擇性通過濾膜。膜分離近似于篩分過程，褐藻膠寡糖混合物通過膜時，由于不同分子量的寡糖體積不同，大于膜孔徑的微粒被截留，小于膜孔徑的微粒透過濾膜，從而實現(xiàn)寡糖混合物的分離[54,56]。

根據(jù)孔徑的大小濾膜可分為微濾膜（MF）、超濾膜（UF）、納濾膜（NF）、反滲透膜（RO）等[54]。歐昌榮等[57]通過超濾-納濾兩級膜分離發(fā)酵法制備的褐藻膠寡糖，發(fā)酵液經(jīng)離心除去菌體后，取上清液先后利用MWC5000中空纖維膜超濾和MWC325納濾膜納濾，濾液經(jīng)濃縮和冷凍干燥后，得到5個組分的褐藻膠寡糖，寡糖的回收率為94.0%、脫鹽率為93.3%。Luan等[58]采用膜分離法分離輻射法降解制備的褐藻膠寡糖，經(jīng)YM4（截留分子量MWCO30000）、YM3（MWCO10000）、YM2（MWCO3000）、YM1（MWCO1000）纖維膜超濾，得到5個組分，分析各組分的寡糖的分子量，發(fā)現(xiàn)隨著輻照劑量的增加得到寡糖的分子量逐漸降低。Yang等[59]采用膜分離法分離褐藻膠寡糖混合物，經(jīng)MWCO10000的超濾膜初步分離，截留分子量為10 kDa的褐藻膠寡糖。

膜分離法設(shè)備簡單、啟動快、不污染環(huán)境。但是膜分離法的分離效率易受到溫度、壓強、混合液濃度等因素的影響，其分離效果不易控制，且膜清洗的成本較高。

2.3 色譜分離法

分離組分中不同物質(zhì)通過色譜柱，固定相對其吸附力不同，使其在色譜柱內(nèi)移動速度不同，因而流出色譜柱的時間不同，從而達到分離的目的。色譜法具有分離效率高、檢測靈敏度高、分析速度快、易于實現(xiàn)自動化的優(yōu)點[54]。目前已經(jīng)應用于褐藻膠寡糖分離的色譜分離法有凝膠滲透色譜法、離子交換色譜法、硅膠柱分離法、高效毛細管電泳法、薄層色譜法和熒光輔助糖電泳法等。

2.3.1 凝膠滲透色譜法（Gel Permeation Chromatography，GPC） 凝膠滲透色譜法是根據(jù)分子大小和形狀來分離物質(zhì)分子的一種非吸附方式的層析技術(shù)[30]。褐藻膠寡糖混合物在通過具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的凝膠時，因分子體積不同，通過的速度不同，體積大的寡糖速率快，分子小的寡糖速率慢，因此不同寡糖分子通過凝膠的時間不同而實現(xiàn)對不同體積的褐藻膠寡糖的分離[54]。

Aida等[25]利用GS-220HQ柱和GS-520HQ柱分離熱液法制備的褐藻膠寡糖，采用流速1 mL/min 0.3 mol/L的NaNO3為流動相，得到甘露糖醛酸寡糖和古洛糖醛酸寡糖。陳巖君等[60]采用Bio-Gel P2柱分離酶降解制備的褐藻膠寡糖，以流速0.1 mL/min 2.5 mmol/L的NaCl為流動相，在230 nm處經(jīng)紫外測定，得到聚合度均一的三個寡糖組分，寡糖聚合度為4～6。Ueno等[61]利用2.64 cm×100 cm的Bio-Gel P6凝膠柱分離褐藻膠寡糖，加入50 mol/L的磷酸緩沖液平衡到pH7.0，得到聚合度為2～8的褐藻膠寡糖。Chen等[46]采用Superdex Peptide 10/300柱分離的酶降解制備的褐藻膠寡糖，以流速0.4 mL/min 0.2 mol/L NH4HCO3為流動相，得到三個寡糖組分，寡糖聚合度為2～3。

凝膠滲透色譜法操作簡單，條件溫和，分離率高，且不需要有機溶劑，但這種方法對分子量的差異僅表現(xiàn)在流速的差異上，需嚴格控制流速，所以分析速度較慢，且凝膠滲透色譜不能分析分子量相近而結(jié)構(gòu)不同的寡糖，適合分析分子量相差10%以上的寡糖[62]。

2.3.2 離子交換色譜分離法（Ion-exchange chromatography，IEC） 離子交換色譜法是以離子交換劑為固定相、利用被分離組分與固定相之間發(fā)生離子交換能力的差異而實現(xiàn)分離的一種液相色譜分離技術(shù)。離子交換色譜固定相上的離子基團可與褐藻膠寡糖游離的羧基結(jié)合，當用流動相洗脫時，寡糖按結(jié)合能力從小到大的順序依次被洗脫下來，而達到分離的目的[63]。

Balance等[64]選用半制備離子型Pac-AS4A柱分離酸水解得到的褐藻膠寡糖，NaOH/NaAc進行洗脫，并通過脈沖安培檢測技術(shù)（Pulsed-amperometric detection，PAD）對分離寡糖純度進行檢測，得到聚合度為5的寡糖，寡糖的純度為96%。Li等[65]采用2 cm×35 cm的Pharmacia柱分離酶解法制備的褐藻膠寡糖，以0.2 mol/L的NaAc為洗脫劑，流速設(shè)置為1.0 mL/min進行梯度洗脫，在235 nm對分離產(chǎn)品進行紫外檢測，得到包括二糖和三糖的6種寡糖。Peng等[66]采用TSK-GEL DEAE-2SW柱分離褐藻膠寡糖混合物，以0～0.25 mol/L的NaCl作為流動相進行梯度洗脫，流速為7 mL/min，洗脫液在波長230 nm進行紫外檢測，分離得到12個褐藻膠寡糖組分，各組分的純度均高于97%。

離子交換色譜法具有樣品用量少、分離效率高、靈敏度高的優(yōu)點，適用于分離酸性寡糖，但是其定性能力差，可與其它色譜法聯(lián)用提高分離純化效果[63]。

2.3.3 硅膠柱分離法 硅膠柱分離法主要是利用硅膠載體對于不同極性的物質(zhì)結(jié)合吸附的程度不同，而實現(xiàn)分離的一種方法。不同聚合度的褐藻膠寡糖極性不同，一般情況下，極性較大的物質(zhì)容易被硅膠載體吸附，而極性較弱的物質(zhì)不易被硅膠載體吸附，因此，褐藻膠寡糖混合物因吸附程度不同而達到分離[67]。

黃菊等[68]利用粒度為200～300目的柱層析硅膠柱對酶解產(chǎn)生的褐藻膠寡糖進行分離，將200 mg褐藻膠寡糖同5 g硅膠一起加入10 mL蒸餾水中混勻，于35 ℃的烘箱中烘干，洗脫至洗脫液（洗脫液為甲醇:水:正丁醇:醋酸系統(tǒng)）中無糖檢出，洗脫液經(jīng)蒸發(fā)濃縮后通過薄層色譜法（TLC）測定得到4個褐藻膠寡糖組分，各組分已經(jīng)被分為兩種或三種寡糖的混合物，每個組分再次分別進行硅膠柱分離，通過MALDE-TOF-MS測定得到分子量為1000～8000 Da的寡糖，且每種寡糖已經(jīng)得到基本的分離。王紅敏[69]使用粒度為200～300目的柱層析硅膠分離褐藻膠寡糖，將500 mg褐藻膠寡糖同1 g硅膠一起加入1 mL蒸餾水中混勻，于35 ℃的烘箱中烘干，以正丁醇:甲酸:水（4:6:1，v/v）為洗脫劑洗脫混合液至無糖檢出，濃縮蒸發(fā)后經(jīng)質(zhì)譜測定得到4個寡糖組分，各個寡糖組分進行第二次硅膠柱分離，利用TLC分析發(fā)現(xiàn)聚合度為2～5的寡糖達到基本分離，且三糖的純度最大。

硅膠柱分離法操作簡便，不需要昂貴的儀器設(shè)備，成本低，但是由于其洗脫液大多含有大量的有機溶劑，易造成環(huán)境污染。

2.3.4 高效毛細管電泳法（High Performance Capillary Electrophoresis，HPCE） 高效毛細管電泳法是依據(jù)在高壓電場中，不同物質(zhì)在毛細管分離通道中的淌度和分配行為不同而進行分離的一種方法[70]。不同的褐藻膠寡糖帶電荷不同，在均一的緩沖溶液體系中，由于電泳的淌度不同而分離成單一的區(qū)帶，而達到分離純化的效果[63]。

孫燕[71]選用有效長度為48 cm、內(nèi)徑50 μm的熔融石英管為毛細管，通過HPCE分離酶降解制備的褐藻膠寡糖。在進樣壓力為50 mbar、分離溫度為30 ℃下進行分離，在235 nm處進行紫外檢測，得到4個寡糖組分，分別為二糖、三糖、四糖和五糖，且具有較高的純度。張真慶[63]采用高效毛細血管電泳法分離酶降解產(chǎn)生的寡糖，在電壓為20 kV、溫度為25 ℃下，用分離長度為40 cm內(nèi)徑為50 μm未涂層的石英毛細管進行分離，在235 nm處進行紫外在線檢測，得到4個褐藻膠寡糖組分，各組分的純度分別是85.23%、84.73%、97.77%、95.25%。

高效毛細管電泳法分析時間短、耗樣少，進樣量可達納升級，適用于微量試樣的分離純化，但是由于會電滲導致樣品組成發(fā)生變化，從而影響分離效果[71]。

褐藻膠寡糖分離技術(shù)的優(yōu)缺點總結(jié)見表3。

表3 褐藻膠寡糖的分離技術(shù)Table 3 Separation technology of fucoidan oligosaccharides

3 褐藻膠寡糖的表征

3.1 純度分析

熒光輔助糖電泳法是利用可以提供熒光電荷和基團的衍生劑，使寡糖衍生化而攜帶熒光基團和電荷，然后經(jīng)過電泳使不同聚合度的寡糖單體呈現(xiàn)單一的條帶，并對其進行純度分析的一種方法[67]。

王瑩等[72]采用熒光輔助電泳法對稀酸降解制備的褐藻膠寡糖進行分析，將寡糖混合物溶于含5 mg 7-氨基萘-1,3-二磺酸（ANDS）、15% HAc中，在室溫下避光靜止1 h后，加入硼氫化鈉在45 ℃反應12 h，經(jīng)Sephadex G25柱脫鹽，得到的標有熒光的寡糖進行梯度電泳，結(jié)果顯示一條單帶，表明得到的寡糖純度較高。劉斌等[73]采用熒光輔助糖電泳法分析酸降解法制備的褐藻膠寡糖，將100 μg的寡糖利用7-氨基萘-1,3-二磺酸熒光標記后進行分析，結(jié)果呈現(xiàn)較清晰的雙條帶，表明測定的樣品純度較高；經(jīng)進一步分析證實，測定組分分子量越大，電泳距離越短，并且按聚合度大小分布成連續(xù)的梯狀。

熒光輔助糖電泳法是一種簡單、快捷的分析方法，可以獲得分子量信息，使檢測結(jié)果更加直觀有效。但是如果寡糖中存在較多相似的化學組成或異構(gòu)體，采用熒光輔助糖電泳法分析難度很大，且會產(chǎn)生較大的誤差。因此熒光輔助糖電泳法適用于分析結(jié)構(gòu)組成不同的寡糖[72]。

3.2 結(jié)構(gòu)鑒定

由于褐藻膠寡糖的結(jié)構(gòu)直接影響著其理化性質(zhì)與生物活性，所以對褐藻膠寡糖結(jié)構(gòu)的表征尤為重要。褐藻膠寡糖的結(jié)構(gòu)鑒定包括測定寡糖中寡糖聚合度（分子量），M、G的相對含量即M/G，及寡糖中均聚、異聚片段組成、含量等。目前廣泛使用的結(jié)構(gòu)表征方法包括凝膠滲透色譜法、薄層色譜法、紅外吸收光譜、圓二色譜、質(zhì)譜、核磁共振波譜等。

3.2.1 薄層色譜法（Thin Layer Chromatography，TLC）薄層色譜法是利用褐藻膠通過吸附劑時，會不斷地產(chǎn)生吸附-解吸過程，不同聚合度的褐藻膠寡糖對同一吸附劑的吸附能力不同，根據(jù)比移值（Rf）與適宜的對照物按同法所得的色譜圖的比移值（Rf）作對比，從而分析褐藻膠寡糖的聚合度[54]。

Zhu等[74]利用1-丁醇:乙酸:水（3:2:2, v/v）的溶劑體系對褐藻膠寡糖進行薄層色譜分析，得到了三個組分的寡糖，寡糖的聚合度為5～7。Zhu等[75]以1-丁醇:乙酸:水（3:2:3，v/v）作為溶劑體系，采用薄層色譜法對酶降解制備的褐藻膠寡糖進行分析測定，得到了聚合度為2～4的褐藻膠寡糖。Zhuang等[76]使用1-丁醇:甲酸:水（4:6:1，v/v）的溶劑體系對褐藻膠裂解酶降解制備的褐藻膠寡糖進行薄層色譜分析，發(fā)現(xiàn)褐藻膠裂解酶AlyAa降解制備的褐藻膠寡糖為二糖、三糖、四糖，其中三糖是主要產(chǎn)物；褐藻膠裂解酶AlyAb降解制備的褐藻膠寡糖主要為三糖、四糖和五糖。薄層色譜法還可以通過測定褐藻膠中還原糖含量的變化，作為褐藻膠在降解過程中是否完全降解的參考[77]。

薄層色譜分析法操作簡單、分析速度快、成本低，適用于寡糖的快速分析。但是定量分析時誤差較大，通常只用做定性分析。

3.2.2 紅外吸收光譜法（Infrared Absorption Spectroscopy，F(xiàn)TIR） 紅外吸收光譜是根據(jù)不同結(jié)構(gòu)的官能團吸收不同波長的紅外射線，而對物質(zhì)組分進行分析和鑒定的一種方法。紅外吸收光譜法主要鑒定寡糖中糖環(huán)骨架和官能團，一般用于褐藻膠寡糖結(jié)構(gòu)的初步表征[54]。

王瑩等[72]采用紅外吸收光譜法對褐藻膠寡糖進行分析，發(fā)現(xiàn)在950 cm?1出現(xiàn)的吸收峰對應于吡喃糖環(huán)的非對稱伸縮振動，在1613 cm?1和1416 cm?1的吸收峰分別對應于羧基的非對稱和對稱的伸縮振動，證明寡糖結(jié)構(gòu)中含有糖醛酸單元。Chandia等[33]利用紅外吸收光譜分析酸降解制備的聚古洛糖醛酸片段和聚甘露糖醛酸片段，發(fā)現(xiàn)在947、903、813、780 cm?1處有古洛糖醛酸糖環(huán)的特征吸收峰；在893、822 cm?1處有甘露糖醛酸糖環(huán)的特征吸收峰。Xu等[78]利用紅外吸收光譜測定酶降解制備的褐藻膠寡糖，分別在789和821 cm?1處出現(xiàn)特征吸收峰，表明寡糖中含有古洛糖醛酸糖環(huán)和甘露糖醛酸糖環(huán)。Falkeborg等[79]利用紅外吸收光譜對褐藻膠寡糖的結(jié)構(gòu)進行表征，發(fā)現(xiàn)在1700 cm?1處存在C=O的不對稱伸縮振動，比羧酸的振動頻率大，證實一些羧基仍以羧酸鹽的形式存在。褐藻膠寡糖的特征紅外吸收峰總結(jié)見表4。

表4 紅外吸收光譜對褐藻膠寡糖的表征Table 4 Characterization of alginate oligosaccharides by infrared absorption spectroscopy

紅外吸收光譜可用于不同組成褐藻膠寡糖結(jié)構(gòu)的初步分析和表征，儀器操作簡單、測量精度高、分析速度快。但是水中的羥基會干擾測定，不適合測定水分含量高的樣品。定量分析時誤差較大，一般用于褐藻膠寡糖的定性分析。

3.2.3 圓二色譜法（Circular Dichroism，CD） 圓二色譜是根據(jù)光學活性物質(zhì)對偏振光的吸收率不同，來推斷物質(zhì)非對稱分子構(gòu)象的一種旋光光譜。圓二色譜一般用于測定褐藻膠寡糖分子的M/G[54]。

Morris等[80]采用圓二色譜法對聚古洛糖醛酸和聚甘露糖醛酸的結(jié)構(gòu)進行測定，通過分析波譜中的分子橢圓度，得到樣品中M/G值為29:71。Sim等[81]利用圓二色譜對酸降解制備的、沉淀分離后的褐藻膠寡糖進行分析，通過波譜的橢圓率計算各嵌段的長度，得到褐藻膠寡糖M/G值為9:8。

圓二色譜法操作簡單，測定速度快，靈敏度高，是糖類化合物進行結(jié)構(gòu)鑒定常用的一種方法。但是光吸收雜質(zhì)的存在會干擾圓二色譜的測定，所以測定樣品需要保證一定的純度。

3.2.4 質(zhì)譜法（Mass Spectroscopy，MS） 質(zhì)譜法是根據(jù)不同物質(zhì)組分的質(zhì)荷比不同，而對樣品結(jié)構(gòu)進行分析和測定的一種方法。質(zhì)譜法一般用于測定褐藻膠寡糖的糖鏈結(jié)構(gòu)和分子量，是寡糖結(jié)構(gòu)鑒定的重要方法之一[54]。

Falkeborg等[79]采用質(zhì)譜法對酶降解制備的褐藻膠寡糖進行分析，寡糖通過沉淀分離后，經(jīng)ESITOF-MS測定，結(jié)果顯示寡糖的聚合度為2～4，非還原末端由4-脫氧-erythro-hex-4-烯醇式吡喃糖醛酸鹽組成。Peng等[66]采用ESI-MS法對離子交換色譜分離得到的聚合度為2～5的4個寡糖組分進行分析，發(fā)現(xiàn)4個組分寡糖的結(jié)構(gòu)組成分別是G 、?MG、（寡糖結(jié)構(gòu)片段）。Zhu等[82]對酶降解制備的褐藻膠寡糖進行測定，寡糖經(jīng)沉淀分離后，通過ESI-MS分析測得制備褐藻膠寡糖聚合度為2～4，并發(fā)現(xiàn)GGGG是能被褐藻膠裂解酶FsAlgB識別和切割的最短底物。Fischer等[83]對酶降解制備的褐藻膠寡糖進行測定，寡糖經(jīng)離子交換色譜分離后，通過AXP-MS進行測定，發(fā)現(xiàn)寡糖中只含有不飽和古洛糖醛酸片段，證明褐藻膠裂解酶CaAIy1為聚古洛糖醛酸特異性裂解酶。Pei等[84]采用MS分析凝膠滲透色譜分離的褐藻膠寡糖，測定得到寡糖的重均分子量分別為352、528、704、880、1056 Da。

質(zhì)譜法測定速度快，靈敏度高，樣品用量少。通常采用串聯(lián)質(zhì)譜法以提高分析的精度和準確度[85]。

3.2.5 核磁共振波譜法（Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy，NMR） 核磁共振波譜法是利用特定的原子核在給定的磁場中，只吸收特定射頻輻射形成核磁共振信號，從而進行結(jié)構(gòu)鑒定[86]。通過糖殘基中各位點元素的化學位移產(chǎn)生的信號可以獲得褐藻膠寡糖的結(jié)構(gòu)信息，通過信號峰面積的積分可得到殘基的相對含量[54]。

Penman等[87]分析酸降解制備的、經(jīng)沉淀分離后的褐藻膠寡糖，利用1H-NMR光譜測定寡糖中的甘露糖醛酸和古洛糖醛酸嵌段，通過計算各嵌段峰面積，得到古洛糖醛酸片段和甘露糖醛酸片段的比值為0.32，且褐藻膠寡糖中均聚的甘露糖醛酸片段與雜聚片段大致相等。Liu等[3]通過酶降解制備褐藻膠寡糖，經(jīng)離子交換色譜分離純化后得到2個組分，通過分析13C-NMR波譜中元素化學位移產(chǎn)生的信號，與已知分子量的樣本波譜對比，測得寡糖的重均分子量分別為396和594 Da。Guo等[88]利用1H-NMR光譜測定經(jīng)凝膠滲透色譜分離的褐藻膠寡糖，得到甘露糖醛酸片段與古洛糖醛酸片段的比值是1:2.6。Sun等[89]利用1H-NMR光譜測定經(jīng)凝膠滲透色譜分離后的褐藻膠寡糖，通過比較寡糖和標準樣品的嵌段峰，計算得到褐藻膠寡糖的平均聚合度為10。Chen等[90]通過酶降解制備的褐藻膠寡糖，經(jīng)凝膠滲透色譜分離后得到4個組分，通過分析1H-NMR光譜在JHH=8.6 Hz和JHH=8.4 Hz出現(xiàn)的單峰，發(fā)現(xiàn)組分1只含?G寡糖片段，組分2含?GG和?MG兩種寡糖片段，組分3含?GGG、?GMG、?MGG和?MMG四種寡糖片段。

核磁共振波譜法測定消耗樣品量少，且不會破壞樣品，可回收樣品，是一項發(fā)展較成熟的結(jié)構(gòu)測定技術(shù)。但是核磁共振波譜需要純度較高的分析物才能得到確定的光譜，并且需要較高濃度的褐藻膠寡糖才能進行明確的結(jié)構(gòu)分析[3]。

褐藻膠寡糖表征方法的優(yōu)缺點總結(jié)見表5。

表5 褐藻膠寡糖的表征方法Table 5 Characterization methods of alginate

4 結(jié)語與展望

褐藻膠寡糖的組成和結(jié)構(gòu)直接影響著其生物活性，而通過不同制備方法可生成不同結(jié)構(gòu)的褐藻膠寡糖。目前褐藻膠寡糖可以通過物理、化學、酶降解、發(fā)酵等方法制備，其中酶降解法得到的褐藻膠寡糖是C4和C5處具有雙鍵的不飽和寡糖，且產(chǎn)物得率高、綠色無污染，是現(xiàn)在研究和應用較為廣泛的一種制備褐藻膠寡糖的方法，未來發(fā)展方向為可定向制備特定結(jié)構(gòu)褐藻膠寡糖高活力酶的研發(fā)。褐藻膠寡糖混合物可以通過沉降分離法、膜分離法、色譜分離法等方法分離。色譜分離法靈敏度高、分離效率高、易于實現(xiàn)自動化，是實驗室研究較為廣泛的一種方法，未來可應用于工業(yè)自動化分離。褐藻膠寡糖的純度、分子量、M/G及其連接方式等特征可以通過熒光輔助糖電泳法、凝膠滲透色譜法、薄層色譜法、紅外吸收光譜、圓二色譜、質(zhì)譜、核磁共振等方法進行表征。各種結(jié)構(gòu)表征方法各有優(yōu)缺點，未來發(fā)展趨勢是多種方法聯(lián)用，實現(xiàn)更高效、快速的表征褐藻膠寡糖。

褐藻膠寡糖的制備方法、分離技術(shù)和表征方法的發(fā)展，對褐藻膠寡糖的合理應用有著深遠的意義。相信未來可以實現(xiàn)褐藻膠寡糖的定向制備、高效精準分離和表征，使其在食品、醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域發(fā)揮更加重要的作用。