夏星雅, 韓承剛, 鄭 楓

他達(dá)拉非是環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷特異性磷酸二酯酶5(PDE5)的選擇性可逆抑制劑[1-2], 可用于治療男性勃起功能障礙(Erectile Dysfunction, 簡(jiǎn)稱ED)和肺動(dòng)脈高壓等疾病[3-4]。 當(dāng)性刺激導(dǎo)致局部釋放一氧化氮時(shí), PDE5 受到他達(dá)拉非抑制, 使陰莖海綿體內(nèi)環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷(cGMP)水平提高, 可導(dǎo)致平滑肌松弛, 血液流入陰莖組織, 產(chǎn)生勃起[5-7]。 此外, 他達(dá)拉非也可通過(guò)減少cGMP 的降解而舒張肺動(dòng)脈血管平滑肌, 降低肺血管阻力[8]。 他達(dá)拉非作為目前世界上公認(rèn)的最有效的ED 治療特效藥之一, 在治療ED 人群中的表現(xiàn)已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其他同類型的藥物, 具有很強(qiáng)的市場(chǎng)優(yōu)勢(shì)。 調(diào)查顯示, 該產(chǎn)品化合物專利于2015 年到期, ED 適應(yīng)癥專利2020 年到期, 工藝專利將于2023 年到期[4,9], 所以研發(fā)突破專利的新工藝成為目前仿制藥的研究熱點(diǎn), 這對(duì)于他達(dá)拉非仿制藥盡快在中國(guó)上市具有重要的價(jià)值, 因此, 在他達(dá)拉非合成工藝中對(duì)其的質(zhì)量控制與雜質(zhì)研究也是不可或缺。

D-色氨酸甲酯鹽酸鹽作為合成他達(dá)拉非原料藥的起始物料之一(常用合成路線見(jiàn)圖1), 在制備過(guò)程中, 會(huì)引入其左旋異構(gòu)體雜質(zhì)L-色氨酸甲酯鹽酸鹽[10-12](結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖2), 且會(huì)伴隨合成工藝路線存在而產(chǎn)生影響他達(dá)拉非質(zhì)量的副產(chǎn)物。 藥物中異構(gòu)體雜質(zhì)如果控制不當(dāng), 可能會(huì)產(chǎn)生臨床隱患[13], 因此,在藥物的生產(chǎn)過(guò)程中, 采用合適的分析方法對(duì)異構(gòu)體雜質(zhì)進(jìn)行控制非常重要[14]。 目前作者未見(jiàn)D-色氨酸甲酯鹽酸鹽與其左旋異構(gòu)體分離與分析的相關(guān)報(bào)道, 本文建立了一種手性高效液相色譜方法對(duì)D-色氨酸甲酯鹽酸鹽中L-色氨酸甲酯鹽酸鹽進(jìn)行分離與檢測(cè), 該方法具有良好的分離效果及重現(xiàn)性, 能從源頭上對(duì)他達(dá)拉非的質(zhì)量進(jìn)行控制。

圖1 他達(dá)拉非常用合成路線Fig.1 Common synthetic route of Tadalafil

圖2 D-色氨酸甲酯鹽酸鹽及其左旋異構(gòu)體的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.2 Structure of D-tryptophan methyl ester hydrochloride and its L-isomer

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

LC-20AT 高效液相色譜儀(SPD-M20A 紫外檢測(cè)器、LabSolutions 色譜工作站), 日本島津有限公司; SQP 電子分析天平(d=0.01 mg), 德國(guó)賽多利斯公司。

1.2 試 藥

D-色氨酸甲酯鹽酸鹽對(duì)照品(批號(hào): 5ARP981, 純度:98.00%), 加拿大TRC; L-色氨酸甲酯鹽酸鹽對(duì)照品(批號(hào):13ABY1521, 純度: 99.27%), 加拿大TRC; D-色氨酸甲酯鹽酸鹽供試品(批號(hào): 010327-2020011201), 四川同晟生物醫(yī)藥有限公司; 正己烷(批號(hào): 20210406, 純度: 色譜純), 永華化學(xué)股份有限公司; 無(wú)水乙醇(批號(hào): E2107166, 純度: 色譜純), 阿拉丁; 二乙胺(批號(hào): L17005094, 純度: 色譜純), 阿拉丁。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱: EnantioPak Y5 色譜柱(4.6×250 mm, 5 μm); 流動(dòng)相: 正己烷(含0.1%二乙胺): 無(wú)水乙醇=80∶20(V/V);流速: 1.0 mL·min-1; 檢測(cè)波長(zhǎng): 280 nm; 柱溫: 25 ℃; 進(jìn)樣量: 10 μL。

2.2 溶液配制

2.2.1 D-色氨酸甲酯鹽酸鹽儲(chǔ)備液

精密稱取D-色氨酸甲酯鹽酸鹽對(duì)照品10 mg, 置于10 mL量瓶中, 加乙醇溶解并稀釋至刻度, 搖勻, 即得濃度約為1.0 mg·mL-1的D-色氨酸甲酯鹽酸鹽儲(chǔ)備液。

2.2.2 L-色氨酸甲酯鹽酸鹽儲(chǔ)備液

精密稱取L-色氨酸甲酯鹽酸鹽對(duì)照品10 mg, 置于10 mL量瓶中, 加乙醇溶解并稀釋至刻度, 搖勻, 即得濃度約為1.0 mg·mL-1的L-色氨酸甲酯鹽酸鹽儲(chǔ)備液。

2.2.3 L-色氨酸甲酯鹽酸鹽工作溶液

精密移取 “2.2.2” 項(xiàng)下L-色氨酸甲酯鹽酸鹽儲(chǔ)備液2.5 mL, 置于50 mL 量瓶中, 加乙醇稀釋至刻度, 搖勻, 即得濃度約為50 μg·mL-1的L-色氨酸甲酯鹽酸鹽工作溶液。

2.2.4 混合對(duì)照工作溶液

精密移取“2.2.1” 和“2.2.2” 項(xiàng)下D-色氨酸甲酯鹽酸鹽與L-色氨酸甲酯鹽酸鹽儲(chǔ)備液各2.5 mL 至同一50 mL 量瓶中, 加乙醇稀釋至刻度, 搖勻, 即得濃度約為50 μg·mL-1的混合對(duì)照工作溶液。

2.2.5 L-色氨酸甲酯鹽酸鹽對(duì)照溶液

精密移取“2.2.3” 項(xiàng)下L-色氨酸甲酯鹽酸鹽工作溶液1.0 mL, 置于10 mL 量瓶中, 加乙醇稀釋至刻度, 搖勻, 即得濃度約為5.0 μg·mL-1的L-色氨酸甲酯鹽酸鹽對(duì)照溶液。

2.2.6 混合對(duì)照溶液

精密移取“2.2.4” 項(xiàng)下混合對(duì)照工作溶液1.0 mL, 置于10 mL 量瓶中, 加乙醇稀釋至刻度, 搖勻, 即得濃度約為5.0 μg·mL-1的混合對(duì)照溶液。

2.2.7 D-色氨酸甲酯鹽酸鹽供試品溶液

精密稱取D-色氨酸甲酯鹽酸鹽供試品(批號(hào): 010327-2020011201)10 mg, 置于10 mL 量瓶中, 加乙醇溶解并稀釋至刻度, 搖勻, 即得濃度約為1.0 mg·mL-1的D-色氨酸甲酯鹽酸鹽供試品溶液。

2.2.8 系統(tǒng)適用性溶液(供試品加樣溶液)

精密稱取D-色氨酸甲酯鹽酸鹽供試品(批號(hào): 010327-2020011201)10 mg, 置于10 mL 量瓶中, 精密移取“2.2.3”項(xiàng)下L-色氨酸甲酯鹽酸鹽工作溶液1.0 mL, 加乙醇溶解并稀釋至刻度, 搖勻, 即得系統(tǒng)適用性溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性和專屬性

取空白溶劑(乙醇)、 L-色氨酸甲酯鹽酸鹽對(duì)照溶液、 混合對(duì)照溶液, 供試品溶液和系統(tǒng)適用性溶液各10 μL 依次進(jìn)樣分析, 記錄色譜圖, 結(jié)果見(jiàn)圖3。 空白溶劑和D-色氨酸甲酯鹽酸鹽供試品均不干擾L-色氨酸甲酯鹽酸鹽的測(cè)定; 各色譜圖中D-色氨酸甲酯鹽酸鹽色譜峰與L-色氨酸甲酯鹽酸鹽的分離度均大于1.5, 符合要求。

圖3 系統(tǒng)適用性和專屬性HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of system suitability and specificity test

2.4 檢測(cè)限和定量限試驗(yàn)

取“2.2.4” 項(xiàng)下混合對(duì)照工作溶液逐級(jí)稀釋后進(jìn)樣分析,以信噪比約為3∶1 和10∶1 的溶液濃度作為D-色氨酸甲酯鹽酸鹽及其左旋異構(gòu)體的檢測(cè)限與定量限。 結(jié)果得L-色氨酸甲酯鹽酸鹽的檢測(cè)限濃度為0.4964 μg·mL-1(0.05%), 定量限濃度為0.9927 μg·mL-1(0.1%),D-色氨酸甲酯鹽酸鹽的檢測(cè)限濃度為0.4920 μg·mL-1(0.05%), 定量限濃度為0.9839 μg·mL-1(0.1%)。 取定量限對(duì)應(yīng)濃度溶液連續(xù)進(jìn)樣6 針, L-色氨酸甲酯鹽酸鹽峰面積RSD 為3.45%, D-色氨酸甲酯鹽酸鹽峰面積RSD 為3.40%。

2.5 線性試驗(yàn)

精密移取 “2.2.4” 項(xiàng)下混合對(duì)照工作溶液0.2、 0.5、0.8、 1.0、 1.5 和3.0 mL, 分別置于六個(gè)10 mL 量瓶中, 加乙醇稀釋至刻度, 得系列濃度混合對(duì)照溶液, 取上述線性測(cè)試溶液各10 μL 依次進(jìn)樣分析, 記錄色譜圖, 以峰面積為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 進(jìn)行線性回歸, 結(jié)果見(jiàn)表1。 同時(shí)計(jì)算得出L-色氨酸甲酯鹽酸鹽得校正因子為1.03, 在0.9 ～1.1 范圍內(nèi)。

表1 線性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of linearity test

2.6 進(jìn)樣精密度與重復(fù)性試驗(yàn)

按“2.2.6” 項(xiàng)下方法配制濃度約為5.0 μg·mL-1混合對(duì)照溶液。 取上述溶液10 μL 連續(xù)進(jìn)樣6 次, L-色氨酸甲酯鹽酸鹽和D-色氨酸甲酯鹽酸鹽峰面積的RSD 分別為1.25%、1.41%; 保留時(shí)間的RSD 分別為0.07%和0.07%, 進(jìn)樣精密度良好。 另按“2.2.8” 項(xiàng)下方法平行配制六份含雜質(zhì)L-色氨酸甲酯鹽酸鹽約5 μg·mL-1的D-色氨酸甲酯鹽酸鹽供試品加樣溶液, 取上述溶液各10 μL 進(jìn)樣分析, 得L-色氨酸甲酯鹽酸鹽含量的RSD 為1.42%(n=6), 表明方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按“2.2.5”、 “2.2.7” 和“2.2.8” 項(xiàng)下方法分別配制L-色氨酸甲酯鹽酸鹽對(duì)照溶液、 D-色氨酸甲酯鹽酸鹽供試品溶液和供試品加樣溶液, 于室溫放置0 h、 2 h、 4 h、 6 h、 8 h 和12 h 后, 分別進(jìn)樣分析, 對(duì)照溶液中L-色氨酸甲酯鹽酸鹽峰面積變化率低于3.64%(＜10.0%); 供試品和供試品加樣溶液中L-色氨酸甲酯鹽酸鹽含量的變化率分別低于7.04% 和2.33%(＜10.0%), 表明上述各溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

取D-色氨酸甲酯鹽酸鹽供試品9 份, 每份約10 mg, 置于10 mL 量瓶中, 用適量乙醇溶解, 分為三組, 每組分別加入0.2、 1.0 和1.5 mL “2.2.3” 項(xiàng)下L-色氨酸甲酯鹽酸鹽工作溶液, 乙醇稀釋至刻度, 搖勻即得每組三份的定量限準(zhǔn)確度、100%準(zhǔn)確度和150%準(zhǔn)確度溶液; 另按“2.2.5” 項(xiàng)下方法配制L-色氨酸甲酯鹽酸鹽對(duì)照溶液, 按“2.2.7” 項(xiàng)下方法平行配制兩份D-色氨酸甲酯鹽酸鹽供試品溶液。 取上述溶液10 μL分別進(jìn)樣分析, 結(jié)果見(jiàn)表2, 該方法準(zhǔn)確度良好。

表2 準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of recovery test

2.9 耐用性考察試驗(yàn)

在柱溫(±2 ℃)、 流速(±0.1 mL·min-1)、 流動(dòng)相比例(±2%)的范圍內(nèi)變動(dòng)色譜條件, 按“2.2.5” 和“2.2.8” 項(xiàng)下配制L-色氨酸甲酯鹽酸鹽對(duì)照溶液與系統(tǒng)適用性溶液, 分別在不同條件下進(jìn)樣分析, 結(jié)果表明, 各組分色譜峰與相鄰峰之間的分離度符合要求(＞1.5), 系統(tǒng)適用性溶液中L-色氨酸甲酯鹽酸鹽的含量在不同條件下與原條件相比變化率低于2.54%(＜10.0%), 該方法耐用性良好。

2.10 樣品檢測(cè)

取D - 色氨酸甲酯鹽酸鹽供試品(批號(hào): 010327 -2020011201), 按“2.2.7” 項(xiàng)下方法配制供試品溶液, 另按“2.2.5” 項(xiàng)下配制L-色氨酸甲酯鹽酸鹽對(duì)照溶液。 取上述溶液10 μL 分別進(jìn)樣分析, 結(jié)果表明D-色氨酸甲酯鹽酸鹽供試品(批號(hào): 010327-2020011201)中含有0.17% L-色氨酸甲酯鹽酸鹽異構(gòu)體雜質(zhì), 未超過(guò)0.5%限度。

3 討 論

3.1 色譜柱的篩選

采用多糖衍生物正相涂敷型CHIRALPAK AD-H 手性色譜柱、 鍵合型CHIRAL ART Cellulose-SZ 手性色譜柱和多糖衍生物反相涂敷型CHIRALCEL OJ-RH 手性色譜柱, 不同流動(dòng)相及配比, 均未能達(dá)到D-色氨酸甲酯鹽酸鹽與其左旋異構(gòu)體的分離。 但EnantioPak Y5(硅膠表面涂敷有纖維素-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯))手性色譜柱可以有效分離分析D-色氨酸甲酯鹽酸鹽中的L-色氨酸甲酯鹽酸鹽, 故選用EnantioPak Y5色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)為本實(shí)驗(yàn)的手性分析柱。

3.2 溶劑的選擇

色氨酸甲酯鹽酸鹽在正己烷、 異丙醇及乙腈中均不溶, 而在水、 甲醇和乙醇中有較好的溶解度。 由于在正相手性色譜柱上進(jìn)行分離, 水和甲醇不適用于該體系, 故經(jīng)過(guò)優(yōu)化后選用乙醇作為溶劑。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

本實(shí)驗(yàn)采用DAD 檢測(cè)器對(duì)D-色氨酸甲酯鹽酸鹽和L-色氨酸甲酯鹽酸鹽在190 ～800 nm 波長(zhǎng)進(jìn)行紫外光譜掃描, 結(jié)果表明待測(cè)物在222 nm 和280 nm 左右具有最大吸收。 由于在222 nm 波長(zhǎng)下, 基線不平穩(wěn)影響測(cè)定, 故選擇280 nm 為最終檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.4 流動(dòng)相的選擇

由于色氨酸甲酯鹽酸鹽結(jié)構(gòu)中含有氨基, 可以加入少量胺類添加劑二乙胺進(jìn)行調(diào)節(jié)。 當(dāng)流動(dòng)相僅為正己烷-乙醇而無(wú)堿性調(diào)節(jié)劑時(shí), 兩對(duì)映體難以洗脫分離, 因此最終選擇正己烷-乙醇-二乙胺流動(dòng)相體系, 可有效改善待測(cè)物峰形及分離度。

4 結(jié) 論

本文建立了一種測(cè)定D-色氨酸甲酯鹽酸鹽中L-色氨酸甲酯鹽酸鹽的手性高效液相色譜法。 該方法分離度、 靈敏度和耐用性良好; 經(jīng)過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證, 表明該方法可以用于他達(dá)拉非起始物料D-色氨酸甲酯鹽酸鹽中左旋異構(gòu)體雜質(zhì)的質(zhì)量研究。