基于高通量測(cè)序探討參附桃紅承氣湯對(duì)膿毒癥大鼠心肌抑制的影響

潘振亞　　王艷鵬　　趙娜　　鄧旻

[摘要] 目的 基于高通量測(cè)序探討參附桃紅承氣湯對(duì)膿毒癥大鼠心肌抑制的影響。方法 30只Wistar大鼠隨機(jī)分為模型組、實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組，每組各10只。模型組及實(shí)驗(yàn)組大鼠采用腹腔注射脂多糖的方法建立膿毒癥模型，實(shí)驗(yàn)組大鼠造模前3 d至處死前給予參附桃紅承氣湯灌胃，模型組和對(duì)照組給予相同量的生理鹽水灌胃。造模成功后12 h觀察各組大鼠一般情況及死亡率，采用超聲檢測(cè)大鼠心功能，采用ELISA方法檢測(cè)大鼠血清CK-MB、cTNI水平，電鏡下觀察大鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)，采用16S rDNA測(cè)序分析腸道菌群變化。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組大鼠死亡率（20%）低于模型組（30%）;實(shí)驗(yàn)組大鼠CK-MB及cTNI低于模型組（P<0.05），但均高于對(duì)照組（P<0.05）;在心臟超聲結(jié)果方面，實(shí)驗(yàn)組大鼠LVEF及CO值高于模型組（P<0.05），均低于對(duì)照組（P<0.05）;電鏡下實(shí)驗(yàn)組見(jiàn)少許線粒體損傷，脊線斷裂較少;模型組線粒體可見(jiàn)較多脊斷裂、模糊，并且見(jiàn)空泡化;在腸道菌群豐度方面，厚壁菌門表達(dá)水平模型組<實(shí)驗(yàn)組<對(duì)照組（P<0.05），實(shí)驗(yàn)組和模型組大腸桿菌-志賀菌表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，中藥干預(yù)后，實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量小于模型組。結(jié)論 參附桃紅承氣湯可以減輕膿毒癥大鼠心肌損傷，改善心功能，調(diào)整腸道菌群結(jié)構(gòu)。

[關(guān)鍵詞] 參附桃紅承氣湯;膿毒癥;大鼠;心肌抑制

[中圖分類號(hào)] R285.5? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2022）07-0025-06

Investigation on the effect of Shenfu Taohong Chengqi Decoction on myocardial inhibition in septic rats based on high-throughput sequencing

PAN Zhenya? WANG Yanpeng? ZHAO Na? DENG Min

Department of Emergency Medicine， Hangzhou Red Cross Hospital， Hangzhou? 310003， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of Shenfu Taohong Chengqi Decoction on myocardial inhibition in septic rats based on high-throughput sequencing. Methods A total of 30 Wistar rats were randomly divided into the model group， the experimental group and the control group， with 10 rats in each group. The sepsis models were established by intraperitoneal injection of lipopolysaccharide in rats from the model group and the experimental group. The rats in the experimental group were given Shenfu Taohong Chengqi Decoction by gavage from 3 days before modeling to termination， and the model group and the control group were given the same amount of normal saline by gavage. During 12 hours upon successful modeling， the general conditions and mortality of rats in each group were observed. The cardiac function of rats was detected by ultrasound， the levels of serum CK-MB and cTnI in rats were measured by ELISA， the structure of rat cardiomyocytes was observed under electron microscope， and the changes of intestinal flora were analyzed by 16S rDNA sequencing. Results The mortality of rats in the experimental group （20%） was lower than that in the model group （30%）. CK-MB and cTnI in the experimental group were lower than those in the model group （P<0.05）， but higher than those in the control group （P<0.05）. In terms of cardiac ultrasound results， the values of left ventricular ejection fraction （LVEF） and cardiac output （CO） in the experimental group were higher than those in the model group （P<0.05） and lower than those in the control group （P<0.05）. Under electron microscope， a little mitochondrial damage and fewer broken ridges were observed in the experimental group. In the model group， there were many broken and fuzzy ridges and vacuolization seen in mitochondria. In terms of intestinal flora abundance， the expression level of Firmicutes in the model group was successively less than that in the experimental group and the control group （P<0.05）， the expression level of Escherichia coli and Shigella spp. in the experimental group and the model group was significantly higher than that in the control group， and the expression level in the experimental group was less than that in the model group after the intervention of traditional Chinese medicine. Conclusion Shenfu Taohong Chengqi Decoction can reduce myocardial injury， improve cardiac function and adjust the structure of intestinal flora in septic rats.

[Key words] Shenfu Taohong Chengqi Decoction; Sepsis; Rats; Myocardial inhibition

膿毒癥是一種由感染引起機(jī)體反應(yīng)失調(diào)而造成威脅生命的器官功能障礙[1]。約40%～50%的嚴(yán)重膿毒癥患者會(huì)出現(xiàn)不同程度的心肌抑制[2]。研究表明，微循環(huán)障礙、心肌細(xì)胞線粒體損傷及氧化應(yīng)激、促炎細(xì)胞因子、心肌細(xì)胞凋亡等因素參與心肌抑制的過(guò)程[3-7]。膿毒癥發(fā)生時(shí)，原有腸道菌群多樣性及豐度出現(xiàn)顯著變化，而腸道菌群的改變與促炎細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激、能量代謝等存在密切相關(guān)性，從多方面參與心肌損傷的過(guò)程[8]。因此，通過(guò)高通量測(cè)序來(lái)探討膿毒癥心肌損傷機(jī)制成為新的思路和途徑。

在前期的研究中證實(shí)，參附桃紅承氣湯可有效保護(hù)膿毒癥大鼠的腸屏障功能[9]。因此本研究在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)高通量測(cè)序探討參附桃紅承氣湯對(duì)膿毒癥心肌損傷的療效及其作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SPF級(jí)WISTAR雌、雄大鼠各15只，體重180～220 g，通過(guò)浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心訂購(gòu)[許可證號(hào)SYXK（浙）2018-0012]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心倫理審查（批準(zhǔn)編號(hào)：IACUC-20190805-07）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）購(gòu)自于Sigma公司，肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme，CKMB）及肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）ELISA試劑盒購(gòu)自于Elabscience公司;小動(dòng)物超聲系統(tǒng);離心機(jī);電子顯微鏡。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物

參附桃紅承氣湯（太子參20 g，制附子10 g，桂枝10 g，桃仁10 g，紅花10 g，生大黃10 g，芒硝10 g，枳實(shí)10 g，厚樸10 g，甘草10 g）由杭州市紅十字會(huì)醫(yī)院藥劑科提供，濃煎至8 g/ml，過(guò)濾除菌分裝4℃保存。

1.4 動(dòng)物造模及分組

將30只Wistar大鼠隨機(jī)分成模型組、實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組，每組各10只，各組大鼠之間體重比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。實(shí)驗(yàn)組及模型組大鼠采用腹腔注射脂多糖（10 mg/kg）方法建立大鼠膿毒癥模型。對(duì)照組大鼠腹腔注射同等量生理鹽水。

1.5 給藥方法

造模前3 d開(kāi)始給藥，實(shí)驗(yàn)組給予中藥1 ml灌胃，生藥劑量為8 g/只，2次/d;模型組和對(duì)照組均予以0.9%氯化鈉注射液1 ml灌胃，2次/d;在造模后12 h，檢測(cè)大鼠各項(xiàng)指標(biāo)后處死大鼠。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 大鼠一般情況觀察? 觀察各組大鼠皮毛色澤、食欲、活動(dòng)度、死亡情況，并做記錄。

1.6.2 心功能測(cè)定? 使用超聲在處死前分別檢測(cè)大鼠的心功能指標(biāo)，如左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fractions，LVEF）、心輸出量（cardiac output，CO）等。

1.6.3 大鼠血清CK-MB、cTNI測(cè)定? 大鼠在麻醉后經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，采用3000 r/min進(jìn)行離心15 min，取上清液，釆用ELISA試劑盒測(cè)定，按照檢測(cè)試劑盒說(shuō)明使用方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.6.4 心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察? 各組大鼠處死后摘取心臟，取左心室約5 mm厚心肌組織，使用4%戊二醛灌注固定，再經(jīng)過(guò)洗滌、固定、脫水及包埋等處理，最后經(jīng)染色后在電鏡下觀察大鼠心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

1.6.5 高通量測(cè)序分析? 取大鼠糞便標(biāo)本，利用Illumina公司Miseq平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組數(shù)據(jù)組間比較采用方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1大鼠一般情況

實(shí)驗(yàn)組大鼠出現(xiàn)活動(dòng)減少，反應(yīng)減慢;模型組大鼠拱背聳毛明顯，皮毛無(wú)光澤，反應(yīng)明顯遲鈍;空白組大鼠皮毛有光澤，動(dòng)作靈敏，進(jìn)食正常，二便正常?？瞻捉M大鼠無(wú)死亡，實(shí)驗(yàn)組大鼠死亡2只，對(duì)照組大鼠死亡3只。見(jiàn)表1。

2.2各組大鼠心臟超聲指標(biāo)情況

與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組與模型組LVEF及CO均出現(xiàn)顯著下降（P<0.05），說(shuō)明造模后大鼠均出現(xiàn)心功能減退;與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠LVEF值及CO值均明顯升高（P<0.05）。見(jiàn)表2、圖1。

2.3各組大鼠CK-MB、cTNI情況

與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組和模型組CK-MB及cTNI均增高，說(shuō)明造模后大鼠出現(xiàn)心肌抑制情況。與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠CK-MB及cTNI均明顯減低（P<0.05）。見(jiàn)表3。

2.4 各組大鼠電鏡情況

對(duì)照組線粒體結(jié)構(gòu)完整，脊線完好無(wú)損，肌原纖維排列緊密，未見(jiàn)腫脹及空泡變等損害;模型組線粒體損傷較大，可見(jiàn)較多脊斷裂、模糊，肌原纖維排列疏松，并且見(jiàn)空泡化;實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)少許線粒體損傷，脊線斷裂較少，肌原纖維排列稍顯疏松。見(jiàn)封三圖2。

2.5 各組大鼠腸道菌群比較

對(duì)各組大鼠的腸道菌群組成情況進(jìn)行高通量測(cè)序，共得到649個(gè)OUT、12個(gè)門、19個(gè)綱、27個(gè)目、53個(gè)科、142個(gè)屬、249個(gè)種。厚壁菌門（firmicutes）包括葡萄球菌屬、腸球菌屬、乳球菌屬、乳桿菌屬等。在腸道菌群豐度方面，在門水平上可以發(fā)現(xiàn)厚壁菌門表達(dá)水平模型組<實(shí)驗(yàn)組<對(duì)照組（P<0.05）。見(jiàn)圖2、表4。在屬水平上來(lái)看，大腸桿菌-志賀菌（Escherichia-Shigella）表達(dá)量在實(shí)驗(yàn)組和模型組明顯高于對(duì)照組，可能為膿毒癥大鼠特異致病菌。見(jiàn)圖3。

3 討論

對(duì)于膿毒癥患者來(lái)說(shuō)，心肌損傷是常見(jiàn)的一種器官功能障礙，當(dāng)出現(xiàn)心肌損傷時(shí)死亡率亦會(huì)明顯增高[10]。亦有研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥以心肌細(xì)胞功能受到抑制為主，同時(shí)這種抑制是可逆的[11]。由此可以看出，在疾病早期應(yīng)積極防治心肌損傷的出現(xiàn)。膿毒癥所致心肌損傷機(jī)制較為復(fù)雜，其中炎癥反應(yīng)是主導(dǎo)機(jī)制之一，是導(dǎo)致死亡率升高的重要原因。有研究表明，膿毒癥時(shí)腸道優(yōu)勢(shì)菌群數(shù)目減少、菌群多樣性降低與全身炎癥反應(yīng)綜合征、多器官功能障礙綜合征患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)[12]。傳統(tǒng)中醫(yī)雖然沒(méi)有膿毒癥的概念，但中醫(yī)在治療外感熱病、溫病等方面具有豐富的臨床用藥經(jīng)驗(yàn)，且現(xiàn)代醫(yī)學(xué)亦證實(shí)中醫(yī)藥能夠通過(guò)多環(huán)節(jié)、多層次、多靶點(diǎn)的整合調(diào)節(jié)作用治療膿毒癥等疾病[13]。

參附桃紅承氣湯是基于大承氣湯加減化裁而來(lái)，由太子參、制附子、桃仁、紅花、生大黃、芒硝、枳實(shí)、厚樸、桂枝、甘草等10味中藥組成，具有益氣補(bǔ)虛、化瘀行氣、通腑瀉下之功效，正好切中膿毒癥心肌損傷的發(fā)病病機(jī)[14]。方中大黃苦寒通降、泄熱通便、化瘀活血，芒硝咸寒潤(rùn)峻、瀉熱通便，二者相須為用。研究表明，大黃能抑制機(jī)體炎性細(xì)胞因子釋放，阻止腸道內(nèi)細(xì)菌和內(nèi)毒素移位[15]，芒硝主要成分為硫酸鈉，可促進(jìn)腸蠕動(dòng)，產(chǎn)生瀉下通便的功能[16];桃仁、紅花用于活血化瘀，可擴(kuò)張血管，增加血流量，改善血液循環(huán)[17];厚樸、枳實(shí)破氣消積，研究表明和厚樸酚可抑制線粒體氧化應(yīng)激及其誘導(dǎo)的心肌凋亡，能夠顯著改善膿毒癥心肌損傷[18];太子參補(bǔ)氣生津，具有抗應(yīng)激、抗炎、促進(jìn)氧自由基清除等作用，可減少心肌損傷[19];桂枝溫通心陽(yáng)、助陽(yáng)化氣;附子回陽(yáng)救逆、溫中補(bǔ)虛，具有抑制心肌氧化反應(yīng)和超氧陰離子自由基產(chǎn)生的作用[20]。

本研究立足于傳統(tǒng)中醫(yī)理論，并結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的相關(guān)技術(shù)手段，以腸道菌群為切入點(diǎn)，著力于探討參附桃紅承氣湯治療膿毒癥心肌損傷的療效及其機(jī)制。研究認(rèn)為，腸道菌群可通過(guò)調(diào)節(jié)能量代謝、機(jī)體氧化應(yīng)激和炎癥等方式導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生[21]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在門水平上，厚壁菌門的表達(dá)量在實(shí)驗(yàn)組和模型組較對(duì)照組下降明顯;而在屬水平上大腸桿菌-志賀菌在模型組及實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)量較對(duì)照組明顯增高，同時(shí)在整個(gè)菌群中的豐度也顯著增高，說(shuō)明膿毒癥時(shí)大鼠腸道菌群多樣性及豐度均發(fā)生了明顯變化。同時(shí)，與空白組相比，模型組及實(shí)驗(yàn)組CK-MB、cTNI值均顯著增加，心臟超聲提示LVEF及CO值顯著降低，說(shuō)明造模后模型組與實(shí)驗(yàn)組均出現(xiàn)了明顯的心肌損傷。研究顯示，脂多糖被認(rèn)為是大腸桿菌細(xì)胞壁成分中最有效的免疫刺激劑，能夠被TLR4識(shí)別引起下游信號(hào)通路激活[22]。在TLR4通路激活后，通過(guò)MyD88依賴和非依賴的途徑誘導(dǎo)炎癥活化，最終產(chǎn)生大量的炎癥因子，從而顯著加重心肌損傷[23]。另一方面，在膿毒癥時(shí)大鼠腸屏障功能會(huì)受損，腸道菌群及其代謝產(chǎn)物亦出現(xiàn)明顯改變，而菌群代謝產(chǎn)物與心肌能量代謝、線粒體功能及炎癥反應(yīng)存在密切的相關(guān)性，膿毒癥會(huì)進(jìn)一步加重心肌的損傷[24]。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)參附桃紅承氣湯干預(yù)后，實(shí)驗(yàn)組大鼠CK-MB、cTNI值降低，同時(shí)LVEF及CO值較模型組明顯升高，并且電鏡下可以觀察到心肌細(xì)胞線粒體損傷減少，說(shuō)明參附桃紅承氣湯可顯著減輕心肌損傷，改善心功能;在菌群調(diào)節(jié)方面，可發(fā)現(xiàn)經(jīng)中藥干預(yù)后，Escherichia-Shigella在實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量低于模型組。

綜上所述，參附桃紅承氣湯可以有效減輕膿毒癥大鼠的心肌損傷，改善大鼠心功能，調(diào)節(jié)腸道菌群。

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（收稿日期：2021-10-13）