周 健 ，曹婷婷 ，2，曹俊新 ，趙云翔 ，2＊

（1.廣西貴港秀博基因科技股份有限公司，廣西 貴港 537100；2.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山528000）

1 前言

隨著養(yǎng)豬業(yè)的不斷發(fā)展，人工授精技術(shù)在養(yǎng)豬業(yè)中不斷推廣和應(yīng)用，很大程度上提升了生產(chǎn)效率和公豬利用率，增加了養(yǎng)殖效益，并在一定程度上降低了某些疾病的傳播風(fēng)險(xiǎn)，深受養(yǎng)豬企業(yè)喜歡。然而，人工授精技術(shù)的充分發(fā)展與精液是否能長(zhǎng)期有效保存關(guān)系十分密切。豬精液冷凍保存技術(shù)可以解決豬精不能長(zhǎng)期保存的困擾，目前公豬精液冷凍技術(shù)國(guó)內(nèi)外均有研究，雖然均取得了一定突破，但操作難度大、且在受胎率、產(chǎn)仔數(shù)方面都低于鮮精，這也是制約凍精推廣的主要因素。當(dāng)前非洲豬瘟肆意傳播，豬場(chǎng)防控形勢(shì)非常嚴(yán)峻，引種難度加大，使用凍精引種可以多環(huán)節(jié)多層次進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)，大大降低疾病帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)，并且可以保存優(yōu)秀公豬基因，在保種方面具有很大的優(yōu)越性。1956年，Polge等首次成功進(jìn)行豬精液的冷凍和保存，并利用人工授精技術(shù)獲得仔豬，之后各國(guó)學(xué)者在豬精冷凍上開(kāi)始了大量的研究，目前豬精冷凍方式主要分為程序冷凍和熏蒸冷凍兩種，本研究通過(guò)比較兩種冷凍方式對(duì)豬精的冷凍效果，以期待在保證冷凍效果的前提下利用程序冷凍儀代替?zhèn)鹘y(tǒng)熏蒸冷凍，來(lái)進(jìn)行大規(guī)模公豬凍精批量化生產(chǎn)；當(dāng)前豬凍精規(guī)格多數(shù)采用0.5 mL/支，雖然小規(guī)格有利于凍精生產(chǎn)和復(fù)蘇，但在豬場(chǎng)實(shí)際應(yīng)用較為不方便，尤其是單支解凍不利于豬場(chǎng)實(shí)際配種操作，目前尚未見(jiàn)到批量解凍凍精的報(bào)道，所以本文批量解凍實(shí)驗(yàn)希望能夠提高凍精實(shí)際應(yīng)用效率，以便更有利于凍精的推廣應(yīng)用。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)精液

沈陽(yáng)秀博種豬繁育科技有限公司成年純種公豬24頭，體質(zhì)健壯，性欲旺盛。原精要求：精子活力≥90%，精子密度≥2億/mL，精子畸形率≤10%。

2.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

TurboFreezerM程序冷凍儀（米尼圖），HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州澳華），EasyCoder2.0色帶打印機(jī)（米尼圖），KDC-2046低速冷凍離心機(jī)（安徽中科），冷凍精子平衡柜（米尼圖），精子檢測(cè)分析儀（IVOS-II，IMV），單頭灌裝機(jī)MPPUno（米尼圖）、0.5 mL凍精細(xì)管（米尼圖）、熏蒸架（田園奧瑞），自制批量解凍器。甘油（Sigma），乳化劑Equex-Paste（米尼圖），基礎(chǔ)稀釋粉Androstar?CryoPlus，新鮮卵黃。

2.3 冷凍保護(hù)液配制

首先在1 000 mL的燒杯中準(zhǔn)確倒入770 mL超純水，在磁力攪拌器上攪拌并加熱至34℃，此時(shí)緩緩倒入Androstar?CryoPlus基礎(chǔ)稀釋粉，充分?jǐn)嚢枞芙猓芤簆H穩(wěn)定后加200 mL新鮮卵黃并充分?jǐn)嚢枞芙?，取?00 mL作為冷卻液；向剩余溶液中添加30 mL甘油和5 g乳化劑Equex-Paste，充分?jǐn)嚢枞芙夂笞鳛槔鋬鲆骸?/p>

2.4 精液冷凍處理

本實(shí)驗(yàn)主要采用熏蒸冷凍和程序冷凍來(lái)進(jìn)行凍精實(shí)驗(yàn)，熏蒸冷凍條件為液氮面距離凍精細(xì)管橫截面中心3 cm，密閉熏蒸8 min；程序冷凍采用表1的冷凍曲線進(jìn)行操作。檢測(cè)合格的原精使用常溫保存稀釋液進(jìn)行1～2倍等溫稀釋，梯度降溫至17℃，在此溫度下900 g離心20 min，抽棄上清液后添加冷卻液，充分懸浮后放置5℃平衡柜中平衡3 h，待精液溫度降至5℃后添加冷凍液，調(diào)整精液濃度為8億/mL，充分懸浮后進(jìn)行灌裝，之后分別進(jìn)行熏蒸冷凍和程序冷凍。

表1 精液冷凍降溫程序

2.5 解凍與檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)采用50℃水浴16 s進(jìn)行解凍，批量解凍實(shí)驗(yàn)共分為9個(gè)實(shí)驗(yàn)組，即單支解凍組（T1）、雙支解凍組（T2），3支解凍組（T3），4支解凍組（T4），5支解凍組（T5），6支解凍組（T6），7支解凍組（T7），8支解凍組（T8），9支解凍組（T9），使用自制的批量解凍器依次解凍9個(gè)實(shí)驗(yàn)組凍精，每次解凍后需擦干批量解凍器，方可進(jìn)行下一批次解凍，不可留有水滴，若有水滴會(huì)影響解凍效果。解凍后使用精液分析儀（IVOS-II）檢測(cè)精子活力和前向精子。

3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)先使用 Excel處理，再使用 SAS 9.2軟件進(jìn)行單因素方差檢驗(yàn)，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差“表示，P＜0.05表示差異顯著。

4 結(jié)果與分析

不同冷凍方法對(duì)凍精活力和前向精子的影響，詳見(jiàn)表2。由表2可知，熏蒸冷凍組解凍后精子活力（65.961±7.733）與程序冷凍組（70.100±8.755）差異不顯著（P＞0.05）；解凍后前向精子占比兩組之間也沒(méi)有顯著差異（P＞0.05），但程序冷凍組在數(shù)值上偏高。

表2 不同冷凍方法對(duì)凍精活力和前向精子的影響

批量解凍不同數(shù)量?jī)鼍?xì)管，精子活力和前向精子結(jié)果如表3。由表3可知，解凍后精子活力方面，T3組精子活力（70.038±14.458）顯著高于T9組（57.485±9.321）（P＜0.05），但是T3組和T9組分別與其余各組在解凍后精子活力上差異不顯著（P＞0.05）；解凍后前向精子方面，T1組（36.062±11.326）、T3組（38.308±11.547）、T5組（36.600±10.204）均顯著高于T9組（23.738±7.689）（P＜0.05），但與其余組之間均沒(méi)有顯著差異（P＞0.05），T9組與T2、T4、T6、T7、T8組之間差異不顯著（P＞0.05）。

表3 0.5 mL凍精細(xì)管批量解凍后精子活力和前向精子檢測(cè)結(jié)果

5 討論

5.1 熏蒸冷凍與程序冷凍對(duì)復(fù)蘇后精子活力和前向精子的影響

目前國(guó)內(nèi)外精液冷凍主要采取兩種方法，即熏蒸法和程序冷凍法，兩種方法在不同動(dòng)物上均已廣泛使用。眾所周知，精子在冷凍過(guò)程中面臨著冰晶、滲透壓及活性氧（ROS）的威脅，以一定的降溫速率來(lái)冷凍精子，使其安全通過(guò)危險(xiǎn)區(qū)對(duì)精子冷凍至關(guān)重要。研究表明，冷凍過(guò)程中水分子玻璃化狀態(tài)下最有利于精子保存，對(duì)精子的理化損傷最小。熏蒸法冷凍雖然也取得了一些良好的冷凍效果，但由于其客觀因素影響較大，其對(duì)降溫速率主觀干預(yù)性較差，而程序冷凍可以做到對(duì)冷凍曲線實(shí)時(shí)監(jiān)控，人為主觀調(diào)控力強(qiáng)，使實(shí)際降溫速率最大限度地按照設(shè)定的速率進(jìn)行，保證降溫速率穩(wěn)定進(jìn)行，理論上可以增加不同批次間冷凍效果的穩(wěn)定性。雖然實(shí)驗(yàn)1復(fù)蘇后的精子活力和前向精子占比在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著差異，但在數(shù)值上程序冷凍要優(yōu)于熏蒸冷凍，目前很多學(xué)者都進(jìn)行過(guò)精液不同方法的冷凍研究。熏蒸時(shí)間研究方面，如高俊鋒等研究發(fā)現(xiàn)0.25 mL 細(xì)管在液氮面3 cm處熏蒸10 min再投入液氮獲得最佳的冷凍效果；章嘯君等對(duì)金華豬精液進(jìn)行液氮熏蒸冷凍，也得出液氮熏蒸10 min再投入液氮有較好的冷凍效果。在凍精細(xì)管熏蒸高度研究上也有很多探索，張偉研究發(fā)現(xiàn)凍精細(xì)管距液氮面4 cm冷凍解凍后精子活力、運(yùn)動(dòng)速率和質(zhì)膜完整性均達(dá)到最佳狀態(tài)，而楊凱的研究結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)凍精細(xì)管距液氮5 cm的冷凍效果優(yōu)于4 cm；周煜研究表明，凍精細(xì)管距液氮5 cm冷凍頂體完整率高于2 cm，而距液氮面9 cm熏蒸冷凍效果最差，劉莉的研究與周煜的一致，這些研究結(jié)果的差異可能是由于實(shí)驗(yàn)條件差異所致。Juarez等人使用程序冷凍儀進(jìn)行公豬精液冷凍也取得了不錯(cuò)的冷凍效果。

5.2 批量解凍與單支解凍對(duì)復(fù)蘇后精子活力和前向精子的影響

眾所周知，凍精解凍過(guò)程中的冷凍損傷是不可避免的，如何更好地優(yōu)化解凍程序，增加解凍后精子的存活率是目前凍精應(yīng)用研究的方向之一。根據(jù)豬場(chǎng)實(shí)際需求，方便豬凍精在人工授精中的操作性，提高使用效率，特進(jìn)行了0.5 mL凍精的批量解凍實(shí)驗(yàn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，同時(shí)解凍8支0.5 mL公豬凍精與單支解凍后在精子活力和前向精子占比上均沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）；當(dāng)同時(shí)解凍9支時(shí)，解凍后精子活力和前向精子占比顯著低于單支解凍（P＜0.05），其原因可能是由于放入水浴中的冷源過(guò)多，超過(guò)最佳升溫速率的上限，無(wú)法快速通過(guò)-30℃～70℃危險(xiǎn)區(qū)，造成精子損傷比例偏大所致。對(duì)于凍精解凍，許多學(xué)者也進(jìn)行過(guò)探索，郭堂玉等研究表明，采用50℃解凍的豬冷凍精液，精子活率、質(zhì)膜完整率均優(yōu)于37℃和70℃解凍溫度組。Roca等研究采用37℃水浴20 s解凍凍精取得了不錯(cuò)的效果，與Juare等人的解凍程序相同。Juare等人的研究中重點(diǎn)是冷凍前（17℃～5℃）精液的降溫速率對(duì)冷凍效果的影響，其結(jié)果表明冷凍前精液的冷卻降溫速率對(duì)解凍后精子總活力沒(méi)有影響。據(jù)相關(guān)報(bào)道，精子的凍融彈性因其品種品系、精子大小形狀及脂質(zhì)含量等特性而有所不同，所以導(dǎo)致冷凍和解凍程序也不盡相同。Córdova-Izquierdo等人使用不同解凍程序解凍5 mL凍精，其研究結(jié)果表明50℃水浴40 s解凍后精子的運(yùn)動(dòng)性高于42℃水浴40 s解凍組。本批量解凍實(shí)驗(yàn)與Córdova-Izquierdo的5 mL解凍實(shí)驗(yàn)在某種程度上可以說(shuō)明解凍速率對(duì)精子復(fù)蘇后的運(yùn)動(dòng)性影響較大，在解凍時(shí)升溫速率不要超出精子承受的最大限度，在水浴溫度、時(shí)間不變的情況下加入過(guò)多冷源（0.5 mL凍精細(xì)管）會(huì)影響精子復(fù)蘇效率，在冷源和解凍時(shí)間相同時(shí)，降低水浴溫度會(huì)影響精子復(fù)蘇效果。Córdova等人研究表明，使用不同程序解凍0.5 mL和5 mL公豬凍精細(xì)管解凍后兩者在精子活力上沒(méi)有顯著差異，但5 mL解凍后染色質(zhì)穩(wěn)定性顯著高于0.5 mL實(shí)驗(yàn)組。Pei Y等的研究采用37℃水浴45 s進(jìn)行解凍也取得了比較滿意的效果。無(wú)獨(dú)有偶，在牛凍精研究中也進(jìn)行了相似的研究，使用0.25 mL和0.5 mL凍精細(xì)管進(jìn)行冷凍對(duì)比，Kang等人的研究表明，0.25 mL公牛凍精解凍后快速運(yùn)動(dòng)精子占比（Fast progressive（%））、直線運(yùn)動(dòng)速率（VSL （μm/s））、平均速率（VAP （μm/s））顯著高于0.5 mL細(xì)管組。Nomura等人使用不同容積冷凍管對(duì)日本鰻魚(yú)精子進(jìn)行冷凍研究，研究表明，5 mL細(xì)管冷凍日本鰻魚(yú)精子與0.25 mL細(xì)管相比不會(huì)降低精子的運(yùn)動(dòng)性。研究人員在眾多物種上都在進(jìn)行冷凍精子的研究，解凍的程序也不盡相同，本次0.5 mL批量解凍實(shí)驗(yàn)可以為優(yōu)化公豬凍精推廣使用方案提供一定的數(shù)據(jù)支持，有利于當(dāng)前環(huán)境下優(yōu)秀公豬基因的傳播。

6 結(jié)論

結(jié)論1：使用熏蒸冷凍（距液氮面3 cm，熏蒸8 min）和程序冷凍（使用本文降溫曲線進(jìn)行冷凍）公豬精液在解凍后精子活力和前向精子占比兩個(gè)指標(biāo)上沒(méi)有顯著差異。

結(jié)論2：50℃16 s水浴一次性批量解凍8支以內(nèi)（含8支）0.5 mL凍精細(xì)管，解凍后精子活力和前向精子占比與單支解凍均沒(méi)有顯著差異，本實(shí)驗(yàn)對(duì)豬凍精解凍方法的研究，可為優(yōu)化凍精在豬場(chǎng)應(yīng)用提供一定的數(shù)據(jù)支撐。