張夢(mèng)吉，黃 琳，李 崢，馬卓然，魏 霖，袁安彩，胡劉華，張 薇，錢 昆，2，3，卜 軍

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200127；2.上海交通大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，上海 200030；3.上海交通大學(xué)醫(yī)療機(jī)器人研究院，上海 200240；4.上海市胸科醫(yī)院/上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200030

據(jù)國家心血管病中心［1］估計(jì)，心腦血管疾病占我國居民總死亡原因的首位。目前我國心血管疾病患者約3.3 億，且由于飲食不健康、運(yùn)動(dòng)不足、飲酒、吸煙等危險(xiǎn)因素呈現(xiàn)普遍化態(tài)勢(shì)，我國患有心血管疾病的人數(shù)仍在持續(xù)升高。因此，研究心腦血管疾病發(fā)病的分子機(jī)制對(duì)降低心腦血管疾病相關(guān)死亡率具有重要意義。分子組學(xué)為心腦血管疾病發(fā)病機(jī)制研究提供了新的契機(jī)，有助于闡明機(jī)制并尋找新的藥物作用靶點(diǎn)；其中代謝組研究可以通過對(duì)代謝物及其差異調(diào)控代謝通路展開分析，探尋心腦血管疾病及其危險(xiǎn)因素相關(guān)的代謝生物標(biāo)志物（以下簡(jiǎn)稱為標(biāo)志物）。從代謝角度闡釋心腦血管疾病發(fā)病造成的代謝途徑改變有助于實(shí)現(xiàn)疾病管理，從而降低心腦血管疾病風(fēng)險(xiǎn)，減輕心腦血管疾病負(fù)擔(dān)。

心腦血管疾病涉及多因素參與的復(fù)雜病理過程，基于單一代謝標(biāo)志物難以實(shí)現(xiàn)疾病分子圖景的精準(zhǔn)描述，通過代謝指紋相關(guān)作用關(guān)系有助于疾病整體分析。本研究依托于科技部重大慢性非傳染性疾病防控專項(xiàng)“心腦血管疾病協(xié)防共管創(chuàng)新管理模式的開發(fā)和應(yīng)用”，基于課題組建立的上海市浦東新區(qū)自然人群隊(duì)列（臨床試驗(yàn)號(hào)NCT04517513），用于建立基于大數(shù)據(jù)平臺(tái)的心腦血管疾病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)新模型。本研究重點(diǎn)關(guān)注心腦血管疾病相關(guān)的高危人群。研究通過納米材料增強(qiáng)激光解吸電離質(zhì)譜技術(shù)（nano-enhanced laser desorption ionization-mass spectrometry，NELDⅠ-MS）提取約14 000 例血漿代謝指紋圖譜（plasma metabolic fingerprints，PMFs），并利用統(tǒng)計(jì)分析方法確定了與對(duì)照組相比，冠心?。╟oronary heart disease，CHD）單患組、腦卒中單患組、心腦血管疾病共患組（冠心病+腦卒中）中具有顯著差異性調(diào)控的6 個(gè)代謝標(biāo)志物，有望對(duì)心腦血管疾病發(fā)病機(jī)制提供代謝層面線索。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)列人群與樣本收集

本研究隊(duì)列人群納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥35 歲。②上海戶籍居民或在上海居住5年以上并參加上海市社會(huì)保障的人群。③無嚴(yán)重肢體殘疾、可以正常溝通的人群。排除標(biāo)準(zhǔn)：①臨時(shí)居民和流動(dòng)人口。②不愿接受項(xiàng)目后續(xù)檢查的人群。③病史采集不全、血樣不合格的人群。2019 年2—8 月期間，共納入14 419 例隊(duì)列成員，根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)分為4 組：對(duì)照組為自述無冠心病、無腦卒中病史的，共12 205例；腦卒中單患組為自述無冠心病、有腦卒中病史的患者，共461 例；冠心病組為自述有冠心病、無腦卒中病史的患者，共1 608 例；心腦血管疾病共患組為自述同時(shí)有冠心病、腦卒中病史的患者，共145 例。收集隊(duì)列成員的體檢資料作為基線資料，包括性別、年齡、身高、體質(zhì)量、體脂率，是否有高血壓、糖尿病、高脂血癥。研究嚴(yán)格遵循《赫爾辛基宣言》，并獲得了上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院和上海交通大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（KY2019-101）。所有對(duì)象均簽署了知情同意書。

血漿采集按照標(biāo)準(zhǔn)流程，使用5 mL 的EDTA 抗凝分離管采集隊(duì)列成員的空腹血4～5 mL。所有血樣都通過靜脈穿刺抽取獲得，并在室溫下靜置40 min至血液凝固。在5 100×g轉(zhuǎn)速下離心10 min 獲得血漿樣品。離心后棄去沉淀，將血漿樣本立即保存在-80°C的環(huán)境中。

1.2 試劑與儀器

葡萄糖（99.5%）、絲氨酸（99%）、組氨酸（99%）、氯化鈉（99.5%）和牛血清白蛋白（98%）購自美國密蘇里州圣路易斯的Sigma-Aldrich 公司。上述試劑將被用于質(zhì)譜譜峰校準(zhǔn)。氯化鉀（99.5%）購自國藥化學(xué)試劑北京有限公司。實(shí)驗(yàn)中使用的所有水溶液均由去離子水配制而成，純水儀購自法國莫爾塞姆的Millipore 公司。AutoFlex TOF/TOF 質(zhì)譜儀購自德國的布魯克公司，其內(nèi)置配有激發(fā)波長(zhǎng)在355 nm的Nd：YAG激光器。

1.3 NELDI-MS實(shí)驗(yàn)

1.3.1 樣品制備 取10 μL血漿樣品加入適量有機(jī)溶劑以進(jìn)行蛋白沉淀，后點(diǎn)樣于微陣列靶板。待干燥后，將1 μL的鐵納米顆粒分散液（1 mg/mL）覆蓋在干燥后的斑點(diǎn)上，以作為后續(xù)質(zhì)譜檢測(cè)的增強(qiáng)基質(zhì)。此方法系根據(jù)前期研究報(bào)道［2-4］而展開。標(biāo)準(zhǔn)品混合液由前述試劑組成，其濃度均設(shè)置為1 mg/mL。

1.3.2 質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集 將干燥后的血漿-基質(zhì)共結(jié)晶樣品送至AutoFlex TOF/TOF 質(zhì)譜儀內(nèi)，以標(biāo)準(zhǔn)品混合液進(jìn)行質(zhì)譜校準(zhǔn)，同時(shí)在反射模式下進(jìn)行PMFs 采集和分析。檢測(cè)質(zhì)荷比（mass-to-charge ratio，m/z）范圍100～1 000。采集時(shí)設(shè)置儀器參數(shù)分別為離子源加速電壓20 kV，激光發(fā)射次數(shù)2 000 次，脈沖頻率1 000 Hz，延遲時(shí)間優(yōu)化為200 ns。所有質(zhì)譜譜圖均在正離子模式下采集。

1.4 質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理

對(duì)原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)的預(yù)處理采用Python 3.7 軟件，主要包括譜峰平滑、譜峰重采樣、基線校正和峰提取4 個(gè)步驟。譜峰平滑：采用高斯濾波對(duì)原始質(zhì)譜譜圖進(jìn)行平滑，以去除背景噪聲。譜峰重采樣：采用數(shù)據(jù)分箱，降低原始質(zhì)譜譜圖的復(fù)雜度。基線校正：采用數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)方法去除背景基線。峰提取：采用檢測(cè)譜圖的局部極大值，提取信號(hào)峰。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Python 3.7 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。定量資料采用單因素方差分析進(jìn)行多組組間差異檢驗(yàn)；采用Shapiro-Wilk test 進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，則用±s表示，2 組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；若不符合正態(tài)分布，則用M（最小值～最大值）表示，2 組間比較采用Wilcoxon rank-sum 檢驗(yàn)。定性資料用n（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析。檢驗(yàn)水平均為α=0.05。質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析過程包含代謝峰顯著性篩選（依據(jù)P≤0.05 準(zhǔn)則）以及質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度篩選，其中顯著性篩選依據(jù)上述統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)完成，質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度篩選設(shè)置納入閾值為質(zhì)譜譜峰相對(duì)強(qiáng)度＞1‰。協(xié)變量分析基于Logistic 回歸計(jì)算加入?yún)f(xié)變量前后自變量的比值比（odds ratio，OR）變化。其中，OR定義為L(zhǎng)ogistic回歸式中自變量系數(shù)的自然指數(shù)。

1.6 代謝通路分析

根據(jù)模型篩選特征m/z值，通過精準(zhǔn)分子量比對(duì)、 數(shù)據(jù)庫檢索（human metabolome database，https：//hmdb.ca）鑒定相關(guān)代謝標(biāo)志物。進(jìn)一步通過MetaboAnalyst （http：//www.metaboanalyst.ca/） 中的通路拓?fù)浞治鲅芯繚撛诟淖兊拇x途徑。

2 結(jié)果

2.1 隊(duì)列人群的基線特征

隊(duì)列人群的基線特征如表1 所示，各組在性別、年齡、身高、體脂率及是否存在高血壓、糖尿病、高脂血癥疾病上的差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；在體質(zhì)量上的差異，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.206）。

2.2 PMFs分析

圖1 為經(jīng)NELDⅠ-MS 提取的隊(duì)列人群血漿原始代謝質(zhì)譜譜圖（m/z為100～500），不同人群的典型質(zhì)譜圖顯示了一定差異，特別是m/z為100～300。經(jīng)數(shù)據(jù)預(yù)處理后，共提取到345 個(gè)代謝信號(hào)峰，并將此峰作為PMFs用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

圖1 心腦血管疾病的血漿質(zhì)譜圖Fig 1 Typical mass spectra of cardiovascular and cerebrovascular diseases

2.3 心腦血管疾病相關(guān)特征代謝標(biāo)志物篩選

首先利用方差分析進(jìn)行多組間差異檢驗(yàn)分析，依據(jù)P≤0.05 準(zhǔn)則，在345 個(gè)代謝峰中篩選得到85 個(gè)在多組間具有顯著性差異的代謝峰。其次再依據(jù)相對(duì)質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度大于1‰、兩兩比較t檢驗(yàn)顯著性P≤0.05的準(zhǔn)則，篩選出6 個(gè)m/z變量作為差異代謝標(biāo)志物。通過Human Metabolome Database 數(shù)據(jù)庫搜索及精確一級(jí)分子質(zhì)量比對(duì)，對(duì)篩選得到的特征m/z變量進(jìn)行了初步的物質(zhì)指認(rèn)。最終確定的差異調(diào)控代謝物分別為氨基磺酸（m/z：119.95［M+Na］+）、乙酰乙酸（m/z：124.95［M+Na］+）、甲基丙二酸（m/z：140.95［M+Na］+）、葡萄糖（m/z：202.95［M+Na］+）、半乳糖醛酸（m/z：217.05［M+Na］+）、α-亞麻酸（m/z：301.25［M+Na］+）。另外，由于在本研究隊(duì)列中，年齡、體脂率、身高等基線指標(biāo)在多組統(tǒng)計(jì)分析中具有顯著性差異（表1），且本研究隊(duì)列人群年齡集中分布［95%置信區(qū)間（confidence interval，CI）］在59～81歲，臨床上該年齡段人群常伴有血糖、血脂代謝異常等其他相關(guān)代謝疾病。為進(jìn)一步研究臨床基線和其他代謝疾病對(duì)篩選得到的心腦血管標(biāo)志物的影響，我們將年齡、身高、體脂率這3種臨床基線指標(biāo)和高血壓、糖尿病、高脂血癥這3種疾病作為協(xié)變量納入回歸分析。由表2可見，代謝標(biāo)志物的OR在加入各協(xié)變量前后幾乎無變化，證明上述臨床基線指標(biāo)和代謝疾病與本研究篩選出的6個(gè)代謝標(biāo)志物關(guān)聯(lián)較小。

表1 隊(duì)列人群的基線特征Tab 1 Baseline characteristics of the study cohort

表2 臨床基線指標(biāo)和代謝疾病對(duì)標(biāo)志物影響的評(píng)估Tab 2 Assessment of clinical baseline indicators and comorbidity metabolic diseases impact on selected biomarkers

上述代謝物在隊(duì)列人群中顯示出2 種不同的集群趨勢(shì)（圖2A），證明了經(jīng)篩選得到的差異代謝物可能作為提示心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的潛在代謝標(biāo)志物。進(jìn)一步地，6 個(gè)差異代謝物可以歸為“酮體代謝因子”“脂肪酸代謝因子”2 大集群?！巴w代謝因子”集群中，冠心病單患組血漿中氨基磺酸、乙酰乙酸、甲基丙二酸的強(qiáng)度顯著增加，而在腦卒中單患組、心腦血管共患組中三者顯著下降（圖2B）；其中，冠心病單患組、心腦血管共患組的氨基磺酸變化差異最大（下調(diào)10.36%）?！爸舅岽x因子”集群中，冠心病單患組、心腦血管共患組中葡萄糖、半乳糖醛酸、α-亞麻酸的強(qiáng)度顯著降低，而在腦卒中單患組中三者顯著增加（圖2C）。

圖2 篩選出的代謝標(biāo)志物Fig 2 Screened metabolic biomarkers

2.4 差異代謝通路分析

依據(jù)以上鑒定出的代謝標(biāo)志物，按照P＜0.05 篩選出相關(guān)的代謝通路。對(duì)心腦血管共患組、腦卒中單患組、對(duì)照組、冠心病單患組中呈遞增趨勢(shì)的氨基磺酸、乙酰乙酸、甲基丙二酸，鑒定出3 種相關(guān)代謝通路（圖3A），分別為：①代謝分解始于肌肉細(xì)胞，同ATP 合成密切相關(guān)的纈氨酸/亮氨酸/異亮氨酸的降解通路（P=0.000）。②同心臟和大腦供能密切相關(guān)的酮體合成與降解通路（P=0.006）。③同酮體合成、短鏈脂質(zhì)合成、檸檬酸循環(huán)、糖酵解、谷氨酸合成密切相關(guān)的丁酸甲酯代謝通路（P=0.019）。對(duì)心腦血管共患組、冠心病單患組、對(duì)照組、腦卒中單患組中呈遞增趨勢(shì)的葡萄糖、半乳糖醛酸、α-亞麻酸，鑒定出2 種相關(guān)代謝通路（圖3B），分別為：①同不飽和脂肪酸合成密切相關(guān)的亞麻酸代謝通路（P=0.024）。②同葡萄糖分解、ATP 合成密切相關(guān)的糖酵解通路/非碳水化合物碳底物合成葡萄糖密切相關(guān)的糖異生通路（P=0.049）。

圖3 代謝通路分析Fig 3 Metabolic pathway analysis

3 討論

本研究探討了新型NELDⅠ-MS快速提取心腦血管疾病大隊(duì)列人群PMFs 的可能性。代謝分析的研究工具主要為核磁共振技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)。受制于只能鑒定原子種類，核磁共振在臨床生物樣本代謝分析的物質(zhì)鑒定受到掣肘［5］。而現(xiàn)行主流液相/氣相質(zhì)譜技術(shù)中嚴(yán)格的樣本預(yù)處理步驟，如色譜的樣本衍生化和純化［6-7］，導(dǎo)致其分析速度慢（0.25～1.5 h/樣本）、樣本消耗量大（20～400 μL/樣本）、通量低（≈100 個(gè)樣本/d），不利于大隊(duì)列代謝分析?；跓o機(jī)納米材料的尺寸選擇效應(yīng)及表面化學(xué)選擇性，我們課題組前期開發(fā)了NELDⅠ-MS，采集了如血清、尿液、血漿等生物體液樣本的PMFs［3-4，8-10］。通過該技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了快速（1 min內(nèi)完成檢測(cè)）、高通量（日均檢測(cè)約1 500個(gè)樣本）、低消耗（僅需1 μL 血漿樣本）的代謝指紋采集。相關(guān)代謝指紋具有高維度的數(shù)據(jù)空間特點(diǎn)（單樣本可提取345 個(gè)代謝信號(hào)峰），基于NELDⅠ-MS 有望實(shí)現(xiàn)大隊(duì)列代謝分析，可用于后續(xù)挖掘PMFs 與心腦血管疾病間的內(nèi)在聯(lián)系，為臨床決策支持提供精準(zhǔn)、個(gè)性化的指導(dǎo)意見。

分子組學(xué)為心腦血管疾病發(fā)病機(jī)制研究提供了新的契機(jī)，有助于闡明機(jī)制并尋找新的藥物作用靶點(diǎn)，其中主要包括基因組學(xué)、蛋白組學(xué)以及代謝組學(xué)等。在基因?qū)用?，鑒于大多數(shù)心血管疾病已被證實(shí)與遺傳高度相關(guān)，相關(guān)研究主要集中在遺傳相關(guān)基因以及特定DNA 序列變異［11-12］。如LACAZE 等［13］對(duì)25 個(gè)遺傳性心血管疾病的基因進(jìn)行靶向測(cè)序，發(fā)現(xiàn)變異KCNQ1和SCN5A同心臟驟停相關(guān)。在蛋白層面，以定義新潛在標(biāo)志物為目標(biāo)的蛋白質(zhì)組學(xué)已取得顯著進(jìn)展，研究［14］發(fā)現(xiàn)了同心腦血管疾病相關(guān)的蛋白標(biāo)志物在炎癥、傷口愈合、蛋白水解、胞外基質(zhì)組織中起重要作用。在代謝層面，代謝組研究通過對(duì)代謝物及其差異調(diào)控代謝通路展開分析，確定同心腦血管疾病或危險(xiǎn)因素相關(guān)的代謝標(biāo)志物。代謝組測(cè)量生物通路中的下游產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)其作為基因調(diào)控和蛋白表達(dá)的結(jié)果與疾病表型關(guān)系密切。如KHAN 等［15］在400 例隊(duì)列人群的血清樣本中發(fā)現(xiàn)，同健康對(duì)照組相比，腦卒中組血清中L-色氨酸、3-甲氧基酪胺、甲硫氨酸、同型半胱氨酸、異亮氨酸、肉堿、精氨酸、亞油酸和鞘氨醇特異性升高；任繁棟等［16］在88例隊(duì)列人群的血漿樣本中發(fā)現(xiàn)，氨基酸代謝在冠心病組的生理代謝過程中發(fā)揮重要作用。

本研究篩選確認(rèn)了2 大心腦血管疾病相關(guān)的代謝風(fēng)險(xiǎn)集群，其在不同組別人群中有完全不同的代謝差異。相關(guān)代謝物主要涉及2 條代謝通路的改變：酮體代謝異常及脂肪酸代謝異常。在長(zhǎng)時(shí)間禁食，嚴(yán)格限制碳水化合物期間或非常劇烈的運(yùn)動(dòng)等極端條件下，脂肪酸轉(zhuǎn)化為酮體為身體供能［17-19］。成人健康心臟中，心臟的首選底物是乙酰輔酶A（脂肪酸的主要代謝物），其供能比例達(dá)40%～60%。在結(jié)構(gòu)性心臟病早期，脂肪酸氧化減少，引起心臟適應(yīng)性代謝過程重新編程，增加對(duì)酮體供能的依賴?？傮w而言，本研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖、乙酰乙酸等心臟關(guān)鍵供能物質(zhì)在腦卒中單患組、冠心病單患組、心腦血管共患組和對(duì)照組中的強(qiáng)度分布差異，能為葡萄糖和乙酰乙酸作為心臟細(xì)胞中競(jìng)爭(zhēng)性供能物質(zhì)提供一定參考線索［20-21］。因此，研究證實(shí)酮體、脂肪酸、糖酵解/糖原異生等相關(guān)代謝通路對(duì)心腦血管發(fā)生、進(jìn)展高度相關(guān)，疾病進(jìn)展過程中或伴隨著相關(guān)代謝通路的差異調(diào)控［22-23］。

已開發(fā)的心腦血管疾病標(biāo)志物包括上游的核酸/蛋白標(biāo)志物和下游的代謝標(biāo)志物。核酸等遺傳標(biāo)志物為主的遺傳信號(hào)有助于探索底層生物學(xué)機(jī)制，蛋白等標(biāo)志物有助于在功能執(zhí)行層面進(jìn)行深入探究。下游的代謝相關(guān)標(biāo)志物則可以通過建立分子組與表型間聯(lián)系，在分子結(jié)果層面實(shí)現(xiàn)對(duì)患者疾病狀態(tài)和治療進(jìn)展的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，因此有助于疾病的治療干預(yù)。另外，作為一項(xiàng)大隊(duì)列代謝分析的工作，我們的研究存在以下局限：未考慮藥物服用對(duì)血漿代謝組學(xué)研究的影響；未將PMFs 和臨床生化實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)共同結(jié)合做整合，分析心腦血管疾病發(fā)生機(jī)制。

綜上所述，本研究利用新型質(zhì)譜技術(shù)，提取了14 419 例隊(duì)列人群的PMFs，并聯(lián)合代謝調(diào)控差異、代謝調(diào)控表達(dá)篩選出酮體代謝異常、脂肪酸代謝異常等2 組在心腦血管疾病中表達(dá)趨勢(shì)不同的代謝標(biāo)志物，有望為心腦血管疾病發(fā)病機(jī)制提供一定的代謝解釋。更重要的是，本研究所提出的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路也將為其他疾病的大隊(duì)列代謝分析提供一定參考。