杜玉婷，張 婧，黃 鶯，張 晶

上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，細(xì)胞分化與凋亡教育部重點實驗室，上海 200025

骨骼肌是人體第二大可塑性組織，僅次于神經(jīng)組織［1］，對呼吸、代謝、運動、體溫保持等基本生命活動具有重要的調(diào)控作用。運動、疾病、創(chuàng)傷等會導(dǎo)致骨骼肌不同程度的損傷［2］。骨骼肌再生是骨骼肌對損傷或肌病做出反應(yīng)并進(jìn)行修復(fù)的生理過程［3］。肌肉急性損傷誘導(dǎo)骨骼肌再生的模型應(yīng)用廣泛、功能強(qiáng)大，其病理生理過程涉及多種細(xì)胞的協(xié)同作用，受到復(fù)雜、精細(xì)的調(diào)控，以保證再生過程的有序進(jìn)行［4］。心臟毒素（cardiotoxin，CTX）可通過肌肉注射導(dǎo)致肌肉損傷，常被用于肌肉損傷模型的構(gòu)建［5］。CTX 注射后的第3日中性粒細(xì)胞開始積聚，而巨噬細(xì)胞在3 d后開始積聚［6］。

骨骼肌在損傷后具有顯著的再生能力，肌肉再生是一個高度協(xié)調(diào)的過程。研究表明，肌肉修復(fù)通常從肌纖維變性開始，形態(tài)學(xué)上類似于壞死。在病理情況下，過度的壞死性凋亡（necroptosis），由于其促炎反應(yīng)，通常會給機(jī)體帶來危害。最近，有研究［7］表明壞死性凋亡能夠通過促進(jìn)固生蛋白（tenascin-c，TNC）的釋放進(jìn)而促進(jìn)肌肉再生。然而到目前為止，肌纖維其他的壞死方式對肌肉損傷修復(fù)的影響并不清楚。

鐵死亡（ferroptosis）是近年來報道的一種新型的細(xì)胞死亡方式［8］，其具體機(jī)制是由于鐵過載而導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化（lipid peroxidation）從而引起細(xì)胞死亡［9］。鐵死亡誘導(dǎo)劑可以誘導(dǎo)細(xì)胞脂質(zhì)過氧化或死亡，其中，?；o酶A 合成酶長鏈家族成員4（acyl-CoA synthetase long-chain family member 4，ACSL4）在游離脂肪酸結(jié)合到磷脂過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［10-11］。研究［12-14］表明，鐵死亡與多種細(xì)胞過程有關(guān)，如鐵穩(wěn)態(tài)、氧化還原穩(wěn)態(tài)和脂質(zhì)代謝；另一方面，谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase 4，GPX4）是哺乳動物細(xì)胞中一種專門消除脂質(zhì)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的酶，可防止鐵死亡的發(fā)生。作為小分子的ferrostatin-1 （Fer-1） 具有中和脂質(zhì)ROS 的能力，去鐵胺（deferoxamine，DFO）具有螯合鐵離子的能力，因此它們被認(rèn)為是鐵死亡的有效抑制劑［8，12］。從Fer-1衍生的新型抑制劑UAMC-3203具有更好的溶解性，抑制鐵死亡的能力與DFO 比較表現(xiàn)出更強(qiáng)的效果，在小鼠體內(nèi)顯示對多種器官的損傷具有良好的保護(hù)作用［15］。在過去的幾年中，越來越多的證據(jù)［12，16-17］表明，鐵死亡與多種病理學(xué)改變有關(guān)，如組織缺血再灌注損傷、神經(jīng)退行性變、腦卒中和癌癥。因此，了解鐵死亡是否與其他形式的細(xì)胞死亡一樣，參與其他生理和病理過程是很重要的。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8 周齡SPF 級的C57BL/6J 雄性小鼠60 只（靈暢生物提供），體質(zhì)量20～25 g。實驗小鼠飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物科學(xué)部，12 h明暗交替，動物房溫度18～26 ℃，相對濕度40%～60%。動物使用許可證號SYXK （滬） 2018-0002，生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）2018-0007。實驗符合上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗倫理標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器

TRⅠzol（Thermo Fisher，美國），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（諾唯贊，中國），Genious 2×SYBR Green Fast實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）Mix（ABclonal，中國武漢），DFO（Sigma，美國），CTX（Merck，美國），UAMC-3203（Selleck，美國），生理鹽水（Servicebio，中國武漢），異氟烷（瑞沃德生命科技有限公司），脫脂牛奶（雅酶生物醫(yī)藥，中國上海），ACSL4 抗體（Santa Cruz，美國），血紅素加氧 酶 1 （heme oxygenase-1， HMOX-1） 抗 體（Proteintech，美國），成肌分化抗原（myogenic differentiation antigen，MYOD） 抗體（ABclonal），甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH） 抗體（Proteintech， 美國），鼠熒光二抗（1∶15 000，LⅠ-COR），兔熒光二抗（1∶20 000，LⅠ-COR），cocktail（APE×BⅠO），二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒（Thermo Fisher，美國）。

組織研磨儀（上海凈信），研磨珠（Servicebio，中國武漢），脫水機(jī)（Diapath，Donatello），包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司，JB-P5），病理切片機(jī)（上海萊卡儀器有限公司，RM2016），冷凍臺（武漢俊杰電子有限公司，JB-L5），組織切片機(jī)（浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司），染色機(jī)（Diapath），烤箱（天津市萊博瑞儀器設(shè)備有限公司），載玻片（Servicebio），正置光學(xué)顯微鏡（日本尼康），1 mL注射器（康德萊），倒置顯微成像系統(tǒng)（Olympus）。

1.3 研究方法

1.3.1 肌肉損傷再生模型構(gòu)建 CTX 誘導(dǎo)的急性肌肉損傷模型能夠維持基底膜和微血管的基本結(jié)構(gòu)，有充足的血液供應(yīng)，通常用于研究肌肉損傷再生。將CTX 溶于生理鹽水配置成濃度為10 μmol/L 的母液。取15 只C57BL/6J 小鼠，刮去腿毛。使用麻醉機(jī)用異氟烷對小鼠進(jìn)行麻醉，分別在脛骨前?。╰ibialis anterior，TA）上、中、下選取3 個點注射CTX，每個點注射30 μL。CTX 注射后，分別在第0、3、7 日取5 只小鼠的TA 組織，3 個時間點分別代表肌肉損傷、再生和修復(fù)的不同階段。本研究通過檢測這3 個關(guān)鍵節(jié)點的肌肉組織形態(tài)學(xué)變化及相關(guān)分子通路，探究再生過程中生理病理機(jī)制。

1.3.2 分組及預(yù)處理 將45只8周齡的C57BL/6J雄性小鼠隨機(jī)分為生理鹽水組、鐵離子螯合劑DFO組、鐵死亡抑制劑UAMC-3203 組，每組15 只。生理鹽水組和DFO組連續(xù)7 d分別腹腔注射生理鹽水和DFO，注射劑量為100 mg/kg。UAMC-3203組在注射CTX前1 d腹腔注射，劑量為10 mg/kg。

1.3.3 小鼠TA 肌肉取樣及病理學(xué)觀察 分別在注射CTX后第0、3、7日取樣。取TA組織放入4%多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）固定液中固定，再將組織塊包埋于石蠟后做蘇木精-伊紅染色（hematoxylin and eosin staining，H-E染色），在顯微鏡下觀察拍片。

1.3.4 RNA 抽提、反轉(zhuǎn)錄及qPCR 肌肉組織用TRⅠzol 進(jìn)行裂解，實驗前盡量確保樣品處于無RNA酶污染的環(huán)境，定量后去除基因組DNA 后反轉(zhuǎn)錄成cDNA 用于后續(xù)qPCR。 采用Genious 2×SYBER Green Fast qPCR Mix熒光定量試劑盒，設(shè)計特異熒光定量引物（primer bank），引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，引物序列見表1。每個待測樣品設(shè)置3個復(fù)孔，內(nèi)參使用小鼠Gapdh。

表1 qPCR引物序列（5′→3′）Tab 1 Primer sequences for qPCR（5′→3′）

1.3.5 蛋白質(zhì)印跡法 根據(jù)TA 組織質(zhì)量加入RⅠPA裂解液裂解，同時加入蛋白酶抑制劑cocktail。預(yù)冷組織研磨儀至4 ℃后向樣品中加入研磨珠對組織進(jìn)行研磨，頻率為70 Hz，30 s/次，共3 次。12 000×g離心取上清液，BCA 蛋白定量后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），用5%的脫脂牛奶封閉0.5 h 后用HMOX-1 抗體（1∶3 000），ACSL4 抗體（1∶300），MYOD 抗體（1∶2 000），GAPDH 抗體（1∶8 000），4 ℃過夜孵育。回收一抗后洗膜孵育二抗，室溫1 h，洗膜顯影。

1.3.6 肌肉組織RNA 測序 分別從生理鹽水組和UAMC-3203組隨機(jī)選取3只小鼠的TA組織進(jìn)行RNA測序（RNA sequencing，RNA-Seq），測序?qū)嶒炗芍Z禾公司完成。對cDNA 進(jìn)行文庫的構(gòu)建和質(zhì)檢后使用Qubit2.0 Fluorometer 進(jìn)行初步定量，符合預(yù)期后上機(jī)測序。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法及差異表達(dá)分析

1.4.1 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Microsoft Excel 和Graphpad Prism 8 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學(xué)分析。2 組比較采用Student'st檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4.2 差異表達(dá)分析 使用DESeq 2 軟件（1.16.1）分別對第0 日及第3 日生理鹽水組和UAMC-3203 組進(jìn)行差異表達(dá)分析（每個組2 個生物學(xué)重復(fù)）。DESeq 2 提供了統(tǒng)計程序，用于使用基于負(fù)二項式分布的模型來確定數(shù)字基因表達(dá)數(shù)據(jù)中的差異表達(dá)。使用Benjamini 和Hochberg 的方法來調(diào)整所得P值以控制錯誤發(fā)現(xiàn)率。通過DESeq 2 發(fā)現(xiàn)調(diào)整的P＜0.05 的基因被分配為差異表達(dá)基因（對于沒有生物學(xué)重復(fù)的采用edgeR）。在進(jìn)行差異基因表達(dá)分析之前，對于每個測序文庫，通過一個比例歸一化因子使用edgeR 程序包調(diào)整讀取計數(shù)。2 個條件的差異表達(dá)分析使用edgeR 軟件包（3.18.1）進(jìn)行。使用Benjamini 和Hochberg 的方法調(diào)整P值。校正后的P值以及|log2foldchange|作為顯著差異表達(dá)的閾值。

1.4.3 差異基因富集分析 通過clusterProfiler（3.4.4）軟件實現(xiàn)差異表達(dá)基因的基因本體數(shù)據(jù)庫（Gene Ontology，GO）富集分析，其中修正了基因長度偏差?？紤]具有小于0.05 的校正P值的GO term通過差異表達(dá)基因富集。京都基因與基因組數(shù)據(jù)庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）是一個數(shù)據(jù)庫資源，用于從分子水平的信息，特別是基因組測序產(chǎn)生的大規(guī)模分子數(shù)據(jù)集和其他高通量數(shù)據(jù)庫中了解生物系統(tǒng)的高級功能和效用，如細(xì)胞、生物體和生態(tài)系統(tǒng)等。我們使用clusterProfiler（3.4.4）軟件分析KEGG 通路中差異表達(dá)基因的富集統(tǒng)計。

2 結(jié)果

2.1 CTX注射后肌肉損傷再生相關(guān)指標(biāo)的檢測

TA 組織注射CTX 后，為了驗證CTX 注射誘導(dǎo)的肌肉損傷模型是否構(gòu)建成功，本研究通過對肌肉組織進(jìn)行H-E 染色來觀察肌肉損傷再生情況。H-E 染色如圖1A 所示：CTX 注射后第3 日損傷較為嚴(yán)重，出現(xiàn)單核細(xì)胞的浸潤，中性粒細(xì)胞的大量積聚；第7 日肌肉組織形態(tài)基本恢復(fù)。為檢測此過程是否有肌肉再生，本研究分別檢測肌肉再生關(guān)鍵基因Myod、肌細(xì)胞生成素（myogenin，Myog）和Tnc。Myod表達(dá)于肌肉細(xì)胞及其前體細(xì)胞中，促進(jìn)成肌細(xì)胞向肌肉細(xì)胞分化［18］。Myog基因是生肌調(diào)節(jié)因子Myod家族中的一員，該基因在肌肉的生長發(fā)育、肌肉萎縮以及肌肉再生中具有重要作用［19］。Tnc能促進(jìn)成肌細(xì)胞的增殖［20］，這個過程由損傷肌肉組織中壞死性凋亡來調(diào)控［7］。如圖1B所示，肌肉再生相關(guān)標(biāo)志基因RNA水平的表達(dá)在第3 日明顯升高（均P＜0.05）。同時，我們也從蛋白水平檢測MYOD的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)同樣在第3日升高（圖1C），此趨勢與RNA 結(jié)果一致，說明肌肉損傷再生模型構(gòu)建成功。

圖1 CTX注射誘導(dǎo)肌肉組織損傷后再生Fig 1 Muscle injury and regeneration induced by CTX

2.2 CTX注射后鐵死亡相關(guān)指標(biāo)的檢測

在15 只C57BL/6J 小鼠的TA 注射CTX 后，分別于第0、3、7 日取TA 組織，從RNA 和蛋白水平檢測鐵死亡相關(guān)指標(biāo)。由圖2 可知，注射CTX 后第3 日鐵死亡相關(guān)指標(biāo)Acsl4、Hmox-1在RNA 和蛋白水平上有明顯升高趨勢，第7 日有所恢復(fù)（均P＜0.05）。結(jié)果表明，CTX 引起的肌肉損傷過程中有鐵死亡的發(fā)生。

圖2 CTX注射后鐵死亡相關(guān)指標(biāo)RNA和蛋白的表達(dá)Fig 2 RNA and protein expression of ferroptosis-related indicators after CTX injection

2.3 鐵死亡抑制劑對肌肉損傷再生的轉(zhuǎn)錄組調(diào)控

為了探究鐵死亡對小鼠肌肉損傷再生過程中轉(zhuǎn)錄組表達(dá)水平的影響，我們隨機(jī)從生理鹽水組和UAMC-3203 組中選取3 只小鼠的TA 組織進(jìn)行RNAseq。 以log2（CTX+ 生理鹽水）/（CTX+UAMC-3203）或者log2（CTX+UAMC-3203）/（CTX+生理鹽水）≥1.5，以及t檢驗P＜0.05 為條件，共篩選出顯著差異表達(dá)基因531 個，其中UAMC-3203 組顯著升高的基因有489 個（圖3A 的紅色部分），顯著降低的基因42 個（圖3A 的綠色部分）。通過對RNA-seq 差異基因的GO 分子功能通路分析發(fā)現(xiàn)，UAMC-3203組中性粒細(xì)胞的脫顆?；琑OS 的生成，以及吞噬作用中的磷脂等信號通路發(fā)生了明顯的改變（圖3B）。在RNA-seq 顯著變化的基因中，我們注意到組織蛋白酶S（cathepsin S，Ctss）基因表達(dá)的顯著升高。如圖3C 所示，CTX 注射后第3 日，與生理鹽水組比較，UAMC-3203 組和DFO 組Ctss基因的表達(dá)都顯著增強(qiáng)（均P＜0.05）。

圖3 鐵死亡抑制劑UAMC-3203預(yù)處理之后的轉(zhuǎn)錄組分析Fig 3 Effect of ferroptosis inhibitors UAMC-3203 on CTX-induced skeletal muscle regeneration at transcriptome level

2.4 鐵死亡抑制劑預(yù)處理后對肌肉再生的影響

H-E 染色由圖4A 所示，注射CTX 后第3 日肌肉損傷較為嚴(yán)重，出現(xiàn)單核細(xì)胞的浸潤，第7 日肌肉組織形態(tài)基本恢復(fù)。DFO 組和UAMC-3203 組損傷程度較生理鹽水組更為嚴(yán)重。我們檢測了CTX 注射后不同組別MYOD 的表達(dá)水平，結(jié)果如圖4B 所示，CTX 注射3 d 后，MYOD 蛋白的表達(dá)顯著升高，而DFO 組和UAMC-3203 組中MYOD 蛋白的升高被明顯抑制。同時，如圖4C 所示，CTX 注射后第3 日，肌肉再生標(biāo)志基因Myod、Tnc和Myog的RNA 表達(dá)在生理鹽水組也顯著升高，而鐵死亡抑制劑組肌肉再生相關(guān)基因的表達(dá)明顯低于生理鹽水組（均P＜0.05）。第7 日肌肉再生標(biāo)志基因Myod、Tnc和Myog的RNA 表達(dá)水平均較第3 日呈現(xiàn)下降趨勢（均P＜0.05）。這些結(jié)果提示鐵死亡至少部分參與了肌肉再生。

圖4 鐵死亡抑制劑預(yù)處理后對肌肉再生能力的抑制作用Fig 4 Ⅰnhibitory effect of ferroptosis inhibitor on the regeneration ability of skeletal muscle

3 討論

骨骼肌的生長和再生依賴于從中胚層發(fā)育而來的成人干細(xì)胞亞型，即衛(wèi)星細(xì)胞（satellite cells）。衛(wèi)星細(xì)胞可以在外部刺激和肌肉損傷的情況下重新進(jìn)入細(xì)胞周期，在MYOD 和MYOG 等因子的調(diào)節(jié)下產(chǎn)生成肌細(xì)胞，參與肌纖維的重建或修復(fù)。肌肉損傷再生模型常用于分析肌肉再生過程中相關(guān)分子所起的作用。鐵死亡作為一種新型的細(xì)胞死亡方式，是否影響肌肉損傷后再生仍是未知。作為一種病理性的細(xì)胞死亡，鐵死亡已被證實與多種組織損傷和疾病相關(guān)，包括缺血再灌注損傷和神經(jīng)退行性疾病等。本研究旨在探究鐵死亡對肌肉再生的影響。我們首先構(gòu)建了CTX 肌肉損傷再生模型，通過H-E染色發(fā)現(xiàn)有炎癥細(xì)胞的浸潤，并在RNA 及蛋白水平上發(fā)現(xiàn)Myod等指標(biāo)在第3日水平升高，驗證了肌肉損傷再生模型構(gòu)建成功。接下來，我們檢測在肌肉損傷修復(fù)過程中是否有鐵死亡的發(fā)生，發(fā)現(xiàn)在CTX 注射后第3 日鐵死亡相關(guān)指標(biāo)Acsl4和Hmox-1在RNA 和蛋白水平上有明顯上升趨勢，提示在CTX 誘導(dǎo)的肌肉損傷模型中有鐵死亡的發(fā)生。

接下來我們通過RNA-seq實驗探究鐵死亡在損傷過程中發(fā)揮怎樣的作用。實驗結(jié)果顯示中性粒細(xì)胞的脫顆?；?，以及吞噬作用中的磷脂等信號通路發(fā)生了明顯的改變。有意思的是，我們發(fā)現(xiàn)在顯著變化的基因中Ctss的表達(dá)有明顯升高趨勢。CTSS 屬于溶酶體半胱氨酸蛋白酶家族，在巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中被鑒定為一種主要的內(nèi)蛋白酶；在小鼠中，Ctss基因的缺失并不影響其生存能力。在組織損傷和炎癥中分泌的CTSS，參與細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的重塑和組織愈合［21］。除了在抗原加工中的作用，CTSS還參與組織重構(gòu)過程中ECM 的構(gòu)建。之前已有文獻(xiàn)［22］報道急性肌肉損傷及mdx 小鼠［進(jìn)行性假肥大性肌營養(yǎng)不良（Duchenne's muscular dystrophy，DMD）模型］的肌肉中，CTSS 蛋白表達(dá)水平和蛋白水解活性顯著提高。Ctss基因的缺失會增加肌纖維肌膜的穩(wěn)定性、 提高整合素和β-dystroglycan 的表達(dá)以及膜定位的準(zhǔn)確性，從而維持骨骼肌結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性［21，23］。我們推測，抑制鐵死亡后Ctss基因的表達(dá)升高導(dǎo)致肌纖維壞死增加，從而表現(xiàn)出肌肉組織病理學(xué)功能缺陷，以及肌肉損傷后再生過程的延緩。但CTSS 具體參與鐵死亡哪一條通路仍是未知，還需進(jìn)一步探究。

接下來我們想知道鐵死亡在肌肉再生的過程中是否起主要作用，于是通過用鐵死亡抑制劑DFO 和UAMC-3203腹腔注射預(yù)處理后建立肌肉損傷模型，從RNA和蛋白水平檢測肌肉再生相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)。結(jié)果顯示注射鐵死亡抑制劑組相較于生理鹽水組肌肉生長因子的表達(dá)水平明顯下降。到第7 日無論是生理鹽水組還是鐵死亡抑制劑組肌肉壞死水平都有所恢復(fù)，但鐵死亡抑制劑組較生理鹽水組相比恢復(fù)得較慢，仍能看到部分損傷。本研究取樣截止時間點選在第7日，肌肉損傷后再生完全恢復(fù)時間還有待于進(jìn)一步探究和摸索。最近，有學(xué)者［7］證明，細(xì)胞壞死性凋亡能通過促進(jìn)TNC的釋放促進(jìn)肌肉再生，其意義在于探究細(xì)胞壞死在生理過程中發(fā)揮積極的作用。另一方面，在慢性肌肉疾病（如DMD）中，肌纖維是否發(fā)生壞死仍有爭議［22-23］。此外，有研究［23］觀察到CTX急性損傷再生模型中，野生型小鼠的肌肉干細(xì)胞并未發(fā)生壞死，而在mdx小鼠中有一群非競爭的肌肉干細(xì)胞有壞死的癥狀。這些結(jié)果表明，鐵死亡可能參與急性和慢性肌肉再生，但扮演著不同的角色。

綜上所述，本研究顯示了經(jīng)DFO 和UAMC-3203處理后肌肉再生能力有所下降，提示鐵死亡的發(fā)生可能幫助了肌肉的再生，這將為我們拓展對鐵死亡的病理功能的認(rèn)識提供新思路。