董 婷，尹小琴，李 妍，李 嬪

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院，上海市兒童醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 200062

在個(gè)體從幼年到成熟的過(guò)程中，下丘腦-垂體-性腺（hypothalamic-pituitary-gonadal，HPG）軸發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。其中，下丘腦促性腺激素釋放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH） 神經(jīng)元通過(guò)脈沖方式釋放GnRH，該激素可作用垂體并刺激其合成、分泌黃體生成素（luteinizing hormone，LH）和卵泡刺激素，而后2 種激素可再與性腺受體結(jié)合，促進(jìn)性腺發(fā)育。對(duì)人類(lèi)個(gè)人而言，乳房發(fā)育、睪丸增大等第二性征的發(fā)育預(yù)示著其青春期的啟動(dòng)；對(duì)雌性大鼠而言，陰門(mén)開(kāi)放則是其青春期啟動(dòng)的標(biāo)志。有研究［1］發(fā)現(xiàn)，GnRH 神經(jīng)元被認(rèn)為是調(diào)節(jié)青春期啟動(dòng)的關(guān)鍵神經(jīng)元。該神經(jīng)元起源于嗅覺(jué)上皮細(xì)胞，其胞體主要位于下丘腦的視前區(qū)、內(nèi)側(cè)隔區(qū)-斜角帶，其神經(jīng)纖維隨犁鼻神經(jīng)尾側(cè)遷移入下丘腦，最終到達(dá)終板血管器和正中隆起。在人體中，GnRH 神經(jīng)元約有2 000 個(gè)，嚙齒動(dòng)物約有800 個(gè)［2-3］。在嬰兒時(shí)期，該神經(jīng)元表現(xiàn)較為活躍，之后會(huì)變得相對(duì)平靜；而當(dāng)青春期開(kāi)始時(shí)，其又被“重新激活”。相關(guān)研究［4-5］發(fā)現(xiàn)，影響GnRH 神經(jīng)元脈沖式釋放的因素較多，包括遺傳、環(huán)境條件、營(yíng)養(yǎng)代謝、心理狀態(tài)和疾病等，但具體機(jī)制尚未被明確。

SPERGEL［6］研究發(fā)現(xiàn)，小鼠來(lái)源的永生化GnRH 神經(jīng)元（GT1-7）細(xì)胞可表達(dá)5-HT1A、5-HT2C、5-HT4和5-HT7受體。CAMPBELL 等［7］向成年雌性GnRH-Cre 轉(zhuǎn)基因小鼠的下丘腦喙側(cè)視前區(qū)注射Ba2001（一種狂犬病毒），分析GnRH 神經(jīng)元的傳入神經(jīng)元分布以及類(lèi)型，結(jié)果顯示位于中縫核的5-HT能神經(jīng)元是GnRH 神經(jīng)元的上級(jí)神經(jīng)元之一，表明存在5-HT 對(duì)GnRH 神經(jīng)元調(diào)節(jié)的解剖基礎(chǔ)。在哺乳動(dòng)物中，5-HT 由必需氨基酸色氨酸在限速酶——色氨酸羥化酶（tryptophan hydroxylase，TPH）的作用下轉(zhuǎn)化得到，是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)。且有研究［8］發(fā)現(xiàn)，在上述過(guò)程中，TPH 可被氯苯丙氨酸（parachlorophenylalanine，PCPA）競(jìng)爭(zhēng)性抑制，從而減少5-HT 的合成。當(dāng)前發(fā)現(xiàn)，TPH 存在2 種亞型，即TPH1和TPH2。前者主要由腸道嗜鉻細(xì)胞和其他非神經(jīng)元類(lèi)細(xì)胞（如脂肪細(xì)胞）表達(dá)；后者主要由中縫核的5-HT 能神經(jīng)元表達(dá)［9］。目前，有關(guān)單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)5-HT 對(duì)GnRH 合成和釋放影響的研究多以成年動(dòng)物為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，且有關(guān)5-HT 對(duì)GnRH 神經(jīng)元的調(diào)控作用尚無(wú)一致結(jié)論?；诖?，本研究以21 日齡雌性大鼠為研究對(duì)象，通過(guò)腹腔注射5-HT 合成抑制劑——PCPA或生理鹽水，檢測(cè)大鼠性發(fā)育的相關(guān)指標(biāo)，初步評(píng)估青春發(fā)育期5-HT 合成減少對(duì)大鼠青春期啟動(dòng)的影響。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

21日齡清潔級(jí)健康雌性SD 大鼠72只，體質(zhì)量為45～50 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0011。實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司上海分公司，使用許可證號(hào)：SYXK（滬）2017-0014。飼養(yǎng)環(huán)境為平均溫度（21±2）℃，相對(duì)濕度（55±10）%，12 h明暗周期，自由攝食、飲水。動(dòng)物飼養(yǎng)條件符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》，所有動(dòng)物操作均遵循國(guó)家及上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理及倫理委員會(huì)規(guī)定的相關(guān)條例。

將上述大鼠隨機(jī)分為2 組，即PCPA 組和生理鹽水組（對(duì)照組），每組36 只。每日，向PCPA 組大鼠腹腔注射PCPA（按100 mg/kg 的劑量，構(gòu)建5-HT 合成下降模型）［9］，向?qū)φ战M大鼠注射等量生理鹽水，持續(xù)至大鼠被處死的前1 d。設(shè)置28 日齡、35 日齡和42日齡為每組大鼠的處死時(shí)間點(diǎn)。

1.2 主要試劑及儀器

氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），PCPA（上海源葉生物科技有限公司），酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELⅠSA） 試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司），TRⅠzol 試劑（Ⅰnvitrogen，美國(guó)），RNA 引物［生工生物工程（上海）股份有限公司］，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）試劑盒（TaKaRa，日本），超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司），紫外分光光度儀（Thermo Fisher，美國(guó)），實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Roche，瑞士），低溫高速離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)）等。

1.3 組織分離及qPCR檢測(cè)

分別于28 日齡、35 日齡和42 日齡處死大鼠，隨后用眼科剪剪開(kāi)顱骨，分離下丘腦組織。

用TRⅠzol法提取下丘腦總RNA，并用紫外分光光度計(jì)探測(cè)RNA的濃度和純度。取1μg RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件為：37 ℃15 min，85 ℃5 s；以cDNA 為模板進(jìn)行PCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95 ℃3 min，95 ℃10 s、56 ℃30 s、72℃30 s（共45 個(gè)循環(huán)）。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 qPCR引物序列Tab 1 Primer sequences for qPCR

1.4 ELISA檢測(cè)

1.4.1 下丘腦組織勻漿制備 向裝有下丘腦組織的離心管加入1×磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS），于超聲下制備組織勻漿，即每500 μL PBS中含有50 mg腦組織。而后，于4 ℃、1 500×g條件下離心20 min，收集上清液并存儲(chǔ)在-80 ℃，用于后續(xù)ELⅠSA分析。

1.4.2 血清提取 將大鼠麻醉后，打開(kāi)胸腔，用2 mL 注射器進(jìn)行心臟采血。采集的全血于4 ℃、1 500×g條件下離心20 min，收集上清液并儲(chǔ)存在-80 ℃，用于后續(xù)ELⅠSA分析。

1.4.3 GnRH、5-HT 及LH 含量測(cè)定 按照ELⅠSA 試劑盒的說(shuō)明步驟，對(duì)下丘腦組織中的GnRH 含量、5-HT含量以及血清中LH 水平進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。GnRH 的檢測(cè)范圍是2.5～80 ng/mL，5-HT 的檢測(cè)范圍是0.75～24 ng/mL，LH 的檢測(cè)范圍是1.5～48 ng/mL。

1.5 陰門(mén)開(kāi)放觀(guān)察

從大鼠28 日齡起，每日上午9：00～10：00 觀(guān)察并記錄2 組大鼠的陰門(mén)開(kāi)放情況，直至陰門(mén)開(kāi)放全部完成。以陰門(mén)呈“隧道”狀作為陰門(mén)開(kāi)放的標(biāo)志。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。定量資料以±s表示，采用Student'st檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCPA對(duì)大鼠下丘腦中5-HT含量的影響

通過(guò)對(duì)28 日齡、35 日齡、42 日齡大鼠下丘腦中5-HT 含量進(jìn)行ELⅠSA 分析，結(jié)果（圖1）顯示：2 組大鼠的5-HT 含量均隨日齡的增大而增加；與對(duì)照組相比較，PCPA 組大鼠下丘腦中5-HT 含量在3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有下降（均P＜0.05）。

圖1 2組大鼠下丘腦中5-HT含量分析Fig 1 Analysis of 5-HT content in the hypothalamus of the two groups

2.2 PCPA對(duì)大鼠下丘腦中GnRH表達(dá)的影響

通過(guò)對(duì)28 日齡、35 日齡、42 日齡大鼠下丘腦中GnRH基因表達(dá)進(jìn)行qPCR 分析，結(jié)果（圖2A）顯示，與對(duì)照組相比較，PCPA 組大鼠的GnRHmRNA表達(dá)量有所下降（均P＜0.05）；且對(duì)該3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的GnRH 蛋白含量進(jìn)行ELⅠSA 分析，結(jié)果（圖2B）顯示，PCPA 組大鼠下丘腦中GnRH 含量亦均低于對(duì)照組（均P＜0.05）。

圖2 2組大鼠下丘腦中GnRH mRNA及GnRH蛋白的表達(dá)Fig 2 Expression of GnRH mRNA and GnRH protein in the hypothalamus of the two groups

2.3 PCPA對(duì)大鼠血清LH水平的影響

通過(guò)對(duì)28 日齡、35 日齡、42 日齡大鼠血清LH水平進(jìn)行ELⅠSA 分析，結(jié)果（圖3）顯示：2 組大鼠的LH 水平均隨日齡的增加而升高；其中，與對(duì)照組相比較，PCPA 組大鼠的LH 水平在28 日齡和35 日齡有所下降且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

圖3 2組大鼠的血清LH水平分析Fig 3 Analysis of LH levels in serum of the two groups

2.4 PCPA對(duì)大鼠陰門(mén)開(kāi)放時(shí)間的影響

對(duì)大鼠陰門(mén)開(kāi)放時(shí)間進(jìn)行觀(guān)察，結(jié)果（圖4）顯示，當(dāng)出現(xiàn)5-HT長(zhǎng)期合成下降時(shí)，PCPA組大鼠的陰門(mén)開(kāi)放時(shí)間為（33.17±2.48）d，對(duì)照組大鼠為（31.33±1.37）d，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.035）。

圖4 2組大鼠陰門(mén)開(kāi)放時(shí)間分析Fig 4 Analysis of vaginal opening time in the two groups

3 討論

本研究通過(guò)向SD 大鼠腹腔注射PCPA 構(gòu)建5-HT合成下降模型，檢測(cè)大鼠下丘腦組織GnRHmRNA及GnRH 蛋白表達(dá)、血清LH 水平，并觀(guān)察陰門(mén)開(kāi)放時(shí)間。結(jié)果顯示，5-HT 的合成下降對(duì)GnRH基因表達(dá)及生物合成均產(chǎn)生了抑制作用，降低了血清LH 水平，并延遲了陰門(mén)開(kāi)放時(shí)間；繼而初步評(píng)價(jià)了雌鼠5-HT合成下降對(duì)青春期啟動(dòng)的影響。

青春期是由幼年期向性成熟期過(guò)渡的階段，是生殖功能完善的重要環(huán)節(jié)。HPG 軸的激活和調(diào)控對(duì)青春期啟動(dòng)至關(guān)重要［10］。作為一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，5-HT 在調(diào)節(jié)情緒、睡眠以及食欲中發(fā)揮了重要作用［11］，且近年來(lái)在生殖內(nèi)分泌領(lǐng)域也備受關(guān)注。研究［12］發(fā)現(xiàn)，PCPA 給藥后的妊娠大鼠的5-HT 合成受到抑制，胚胎前腦GnRH 神經(jīng)元的數(shù)量多于下丘腦。另有研究［13］發(fā)現(xiàn)，雞胚嗅板區(qū)5-HT1A受體在發(fā)育過(guò)程中表達(dá)遞增，當(dāng)使用5-HT1A抑制劑后GnRH神經(jīng)元遷移受阻。因此，5-HT 水平或?qū)?duì)GnRH 神經(jīng)元的起源、分化和遷移發(fā)揮調(diào)控作用。MAHMOUDⅠ等［14］向雄性大鼠第3腦室注射5-HT后發(fā)現(xiàn)，大鼠血清LH 水平出現(xiàn)了升高。而在本研究中，抑制下丘腦5-HT的合成，可導(dǎo)致血清LH 水平下降，這與先前的研究結(jié)果相一致。BARBOSA 等［15］發(fā)現(xiàn)，在母鼠懷孕及哺乳期間給予其氟西?。ㄒ环N提高突觸間隙5-HT 含量的試劑）處理，子代雌鼠的陰門(mén)開(kāi)放時(shí)間無(wú)差異。分析其原因，可能是因?yàn)椋孩儆资箅m可通過(guò)胎盤(pán)屏障和乳汁攝入藥物，但藥物進(jìn)入下丘腦的濃度無(wú)法保證，同時(shí)該實(shí)驗(yàn)也未檢測(cè)用藥后幼鼠下丘腦5-HT 含量，因此無(wú)法確定藥物的作用效果。②幼鼠在斷奶后，即停止了藥物的攝入，其下丘腦組織5-HT 含量可能恢復(fù)了正常。因此，在本研究中，為保證藥物攝入的有效性及持續(xù)性，我們選擇直接對(duì)大鼠用藥且持續(xù)至處死前1 d，以確保5-HT 合成長(zhǎng)期受到影響，從而獲得了與上述研究不一樣的結(jié)果。SOGA 等［16］利用社會(huì)隔離雄性大鼠建立下丘腦5-HT合成下降模型，發(fā)現(xiàn)大鼠的GnRHmRNA合成有所下降，性發(fā)育延遲。在本研究中，我們給予PCPA 處理后抑制了大鼠5-HT 合成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)下丘腦GnRH基因表達(dá)下降，陰門(mén)開(kāi)放延遲，意味著雌鼠青春期啟動(dòng)延遲，這與先前研究結(jié)論相一致。

綜上，本研究初步表明青春發(fā)育期5-HT 合成減少可延遲SD 雌鼠正常的青春期發(fā)育，這種效應(yīng)可通過(guò)減少下丘腦GnRH合成、降低血清LH水平來(lái)實(shí)現(xiàn)。該結(jié)果為5-HT 在青春期啟動(dòng)中的作用提供了理論基礎(chǔ)，然而，對(duì)于5-HT 調(diào)控GnRH 神經(jīng)元的具體機(jī)制將有待更進(jìn)一步的探討。