石 潔，朱 飛，周 靜，霍立茹*

1 徐州醫(yī)科大學(xué)，徐州 221000；2 南京濟(jì)群醫(yī)藥科技股份有限公司，南京 211112

復(fù)方電解質(zhì)注射液是一種含有果糖、乳酸鈉、氯化鉀、氯化鈉等組分的滅菌水溶液，可以有效調(diào)節(jié)體液容量、滲透壓，提供能量。一方面，果糖和乳酸鈉作為上述注射液的主要組分，可有效維持體內(nèi)的酸堿平衡，并為人體提供能量，另外，果糖與葡萄糖相比，更具有快速代謝和迅速轉(zhuǎn)化為能量的作用，且代謝不依賴胰島素，對血糖影響小，尤其適合糖尿病患者和肝病患者使用，而當(dāng)這兩種組分的含量不足時，藥效將會顯著下降，且國內(nèi)研究表明，過量使用果糖有可能引起危及生命的乳酸性酸中毒[1]。另一方面，為有效克服果糖易在高溫滅菌過程中發(fā)生氧化分解的缺陷，常在該注射液制備過程中加入抗氧化劑亞硫酸氫鈉，以提升其藥物穩(wěn)定性；但該品自身易氧化分解，在樣品貯藏過程中會逐漸消耗。當(dāng)亞硫酸氫鈉攝入過量時，也可誘發(fā)消化系統(tǒng)疾病、神經(jīng)細(xì)胞死亡和抑制尿激酶纖溶蛋白活性等不良反應(yīng)[2-5]。因此，應(yīng)對復(fù)方電解質(zhì)注射液中果糖、乳酸鈉、亞硫酸氫鈉等的含量進(jìn)行合理測定和有效控制，以確保該藥物有效性和安全性。

據(jù)2020 版《中國藥典》收載，果糖的含量測定方法主要是采用旋光法；乳酸鈉含量測定方法主要是陽離子交換樹脂法；而亞硫酸氫鈉作為藥用輔料，《中國藥典》中多采用滴定法測定。上述方法專屬性較差，費(fèi)時，實際檢測中不易控制。目前，研究多采用HPLC 法單獨(dú)測定果糖[6，7]、乳酸鈉[8，9]和亞硫酸氫鈉[10，11]的含量，也有文獻(xiàn)報道[12]，采用離子色譜柱結(jié)合紫外檢測器同時測定果糖和乳酸鈉的含量；但這些方法仍有可改進(jìn)之處，如單次分析成分?jǐn)?shù)量較少，方法靈敏度低等。這些方法都可能影響含量的檢測效率和準(zhǔn)確性，且尚未見采用離子色譜法同時測定果糖、乳酸鈉和亞硫酸氫鈉含量的報道。為此，本研究通過優(yōu)化色譜條件，建立了用離子排斥色譜柱結(jié)合紫外檢測器同時測定果糖、乳酸鈉和抗氧劑亞硫酸氫鈉含量的離子色譜法。該方法不僅可以大大降低工作量，縮短分析周期，也為后期復(fù)方電解質(zhì)注射液的質(zhì)量控制提供有力支撐。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

液相色譜儀（U3000 型，美國賽默飛公司）；萬分之一天平（BSA124S，德國賽多利斯公司）；十萬分之一天平（MSE125P-1CE-DU，德國賽多利斯公司）。

1.2 藥品與試劑

復(fù)方電解質(zhì)注射液:（自制，批號：210801、210802、210803，南京濟(jì)群醫(yī)藥科技股份有限公司）。氯化鈉對照品（純度100%，批號：100376-201703）、氯化鉀對照品（純度100%，批號：100708-20112）、果糖（純度99.9%，批號：100231-202008）、乳酸鈉（純度99.7%，批號：100911-202003），均購自中國食品藥品檢定研究院；亞硫酸氫鈉對照品（純度99.9%，批號：S818007，上海麥克林生化科技有限公司）；硫酸、乙腈為分析純；水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

取對照品果糖、乳酸鈉與亞硫酸氫鈉適量，精密稱定，加水溶解并稀釋制成每1 mL 約含果糖2 mg、乳酸鈉0.3 mg、亞硫酸氫鈉0.05 mg 的溶液作為系統(tǒng)適用性溶液。

采用磺酸型聚苯乙烯苯乙烯二乙烯基苯共聚體陽離子交換樹脂H 型（Aminex HPX-87H，300 mm×7.8 mm，9 μm）為色譜柱；柱溫為40 ℃；流動相為0.005 mol·L-1硫酸-乙腈（85∶15）；流速為0.6 mL·min-1；檢測波長為200 nm；進(jìn)樣量為20 μL。在上述條件下，各峰之間分離度良好（Rs＞1.5），出峰順序依次為果糖、乳酸鈉、亞硫酸氫鈉。見表1、見圖1。

表1 系統(tǒng)適用性結(jié)果

圖1 復(fù)方電解質(zhì)注射液系統(tǒng)適用性色譜圖

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液取對照品果糖、乳酸鈉與亞硫酸氫鈉適量，精密稱定，加水溶解并稀釋制成每1 mL約含果糖2 mg、乳酸鈉0.3 mg、亞硫酸氫鈉0.05 mg的溶液。

2.2.2 供試品溶液精密量取供試品5 mL，置25 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，混勻。

2.3 專屬性考察

取處方中不含3 種成分的其他成分，稀釋成與供試品、對照品相同倍數(shù)的空白溶液，與供試品溶液和對照品溶液一并分析。結(jié)果表明，對照品溶液與供試品溶液中各成分色譜峰之間分離度均大于1.5，而空白溶液對測定無干擾。見圖2。

圖2 復(fù)方電解質(zhì)注射液HPLC 色譜圖

2.4 定量限和檢測限確定

取“2.2.1”項下對照品溶液進(jìn)行逐級稀釋，并按照“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，以信噪比（S/N）約為10 作為定量限濃度，信噪比（S/N）約為3 作為檢測限濃度。亞硫酸氫鈉定量限為0.25 μg·mL-1，檢測限為0.10 μg·mL-1。

2.5 進(jìn)樣精密度試驗

取“2.2.1”項下對照品溶液20 μL，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 針，記錄峰面積，果糖、乳酸鈉和亞硫酸氫鈉的峰面積RSD 分別為0.33%、0.46%和0.62%，表明該方法精密度良好。

2.6 溶液穩(wěn)定性試驗

取對照品溶液及供試溶液各1 份，按照“2.1”項下色譜條件分別于0、1、2、3、5、7、9、12、18 h 進(jìn)樣測定。結(jié)果表明，果糖與乳酸鈉的供試溶液與對照品溶液在室溫條件下18 h 內(nèi)穩(wěn)定，而亞硫酸氫鈉的供試溶液與對照品溶液在室溫下放置5 h 內(nèi)含量均下降約5%，溶液穩(wěn)定性略差，故應(yīng)臨用新配。

2.7 線性范圍

2.7.1 果糖與乳酸鈉取果糖對照品約200 mg，乳酸鈉對照品約30 mg，精密稱定，置于同一20 mL 量瓶中，加水溶解并定容，搖勻，作為儲備液。精密量取儲備液1.6、1.8、2.0、2.2、2.4 mL，分別置于10 mL量瓶中，加水稀釋定容，制成一系列質(zhì)量濃度的供試溶液，分別進(jìn)樣。以質(zhì)量濃度（X，mg·mL-1）為橫坐軸，峰面積（Y）為縱坐軸進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。結(jié)果表明，果糖和乳酸鈉在相應(yīng)范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。見表2。

表2 3 種成分的線性關(guān)系

2.7.2 亞硫酸氫鈉取亞硫酸氫鈉對照品約25 mg，精密稱定，置50 mL 量瓶中，加水溶解并定容，搖勻，作為儲備液。精密量取儲備液0.5、0.8、1.0、1.2、1.5mL，分別置于10 mL 量瓶中，用水稀釋制成一系列質(zhì)量濃度的溶液，同時，將亞硫酸氫鈉儲備液逐級稀釋配得定量限溶液，按照“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定。以質(zhì)量濃度（X，mg·mL-1）為橫坐軸，峰面積（Y）為縱坐軸，得其線性回歸方程。結(jié)果表明，亞硫酸氫鈉在其濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。見表2。

2.8 重復(fù)性試驗

取同一批號樣品，照“2.2.2”項下方法平行配制6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果果糖、乳酸鈉和亞硫酸氫鈉含量的RSD 分別為0.43%、0.21%和1.27%（n=6），表明三者的重復(fù)性均良好。

2.9 回收率試驗

2.9.1 果糖和乳酸鈉①按復(fù)方電解質(zhì)注射液處方比例，除果糖和乳酸鈉外，稱取其他各組分及亞硫酸氫鈉，置100 mL 量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，混勻后作為陰性空白溶液。

②取乳酸鈉對照品約60 mg，精密稱定，置于20 mL 量瓶中，用水溶解并定容至刻度，搖勻，作為乳酸鈉儲備液。精密稱定果糖對照品16、20、24 mg，分別置10 mL 量瓶中，先用適量水將其溶解，再依次加入0.8、1、1.2 mL 的乳酸鈉儲備液和1 mL 的陰性空白溶液，并用溶劑稀釋定容至刻度，搖勻，制成果糖和乳酸鈉濃度分別相當(dāng)于供試品溶液濃度80%、100%、120%的溶液，每個濃度平行3 份，共9份，按“2.1”項下的色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，以外標(biāo)法計算各成分的測得量，并用測得量除以對照品加入量，計算其回收率。結(jié)果表明，果糖和乳酸鈉的平均回收率分別為99.28%（n=9）和99.75%（n=9），RSD 分別為0.66%和0.69%。

2.9.2 亞硫酸氫鈉①按復(fù)方電解質(zhì)注射液處方比例，除亞硫酸氫鈉外，稱取該注射液中各組分，置100 mL 量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，混勻后作為陰性空白溶液。

②精密量取“2.7.2”項下亞硫酸氫鈉儲備液0.4、1、2、3 mL，分別置于預(yù)先加入陰性空白溶液2 mL 的20 mL 量瓶中，加水制成亞硫酸氫鈉濃度相當(dāng)于理論濃度20%、50%、100%和150%的供試溶液，每個濃度平行制備3 份。按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，以外標(biāo)法計算亞硫酸氫鈉的測得量，并用測得量除以對照品加入量，計算其回收率。結(jié)果表明，亞硫酸氫鈉的平均回收率為99.63%，RSD 為1.20%（n=12）。

2.10 含量測定

按照“2.2.2”項下方法制備3 個批號供試品溶液，平行制備3 份，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并用外標(biāo)法計算各成分的含量，結(jié)果見表3。

表3 供試品含量測定結(jié)果（n=3）

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化

3.1.1 色譜柱的選擇果糖、乳酸鈉、亞硫酸氫鈉均為極性較大的化合物，一般色譜系統(tǒng)難以較好分離。本研究選擇了磺酸型聚苯乙烯苯乙烯二乙烯基苯共聚體H+陽離子交換樹脂為固定相的離子排斥色譜，該色譜保留機(jī)理[13]主要有Donnan 排斥、空間位阻排斥和疏水性吸附作用等。基于其保留機(jī)理對果糖、乳酸鈉、亞硫酸氫鈉分離進(jìn)行考察，結(jié)果三者在該色譜系統(tǒng)中得到較好分離。同時比較兩支不同廠家色譜柱，月旭科技（Xtimate?sugar-H）和伯樂生命醫(yī)學(xué)（Aminex HPX-87H），以三者的峰的分離度和峰形等因素作為判斷依據(jù)，結(jié)果兩廠家色譜柱在分離度和峰形上無明顯差異，說明該方法耐用性較好。

3.1.2 流動相的選擇比較了不同濃度硫酸水溶液和不同比例乙腈-硫酸水溶液兩個流動相系統(tǒng)，當(dāng)選擇0.005～0.02 mol·L-1硫酸水溶液作為流動相時，各峰保留時間穩(wěn)定，無明顯變化，表明該濃度范圍內(nèi)乳酸及亞硫酸氫鈉的電離均被有效抑制，從對色譜柱保護(hù)的考慮，優(yōu)選0.005 mol·L-1硫酸水溶液。

為使乳酸與焦亞硫酸的峰可完全分離，通過向流動相中加入一定量的有機(jī)相（乙腈），一定程度地阻塞固定相的吸附位點(diǎn)，減少乳酸與固定相的相互作用，從而縮短乳酸保留時間。本研究比較了5%、10%、15%和20% 4 種不同的有機(jī)相比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著乙腈比例增加，果糖和亞硫酸氫鈉的峰保留時間基本不變，乳酸鈉的保留時間逐漸縮短。當(dāng)乙腈比例為15%時，果糖、乳酸鈉和亞硫酸氫鈉之間分離度最優(yōu)。因此，綜合考慮峰型、分離度、基線平穩(wěn)及色譜柱常規(guī)沖洗和保存等因素，最終選擇0.005 mol·L-1硫酸水溶液-乙腈（85∶15）為流動相體系。

3.1.3 檢測波長選擇在3 個組分結(jié)構(gòu)中均無長共軛結(jié)構(gòu)或較強(qiáng)的發(fā)色團(tuán)，根據(jù)高效液相色譜二極管陣列檢測器掃描的紫外吸收圖譜，3 個組分均在紫外光末端吸收位置200 nm 附近有吸收，且均有較大響應(yīng)值，表明溶劑對其測定無干擾，故選定200 nm作為測定波長。

3.2 其他

因亞硫酸氫鈉本身易氧化分解，需臨用新配，且亞硫酸氫鈉作為抗氧劑，在樣品貯藏過程中會逐漸消耗，故對復(fù)方電解質(zhì)注射液中亞硫酸氫鈉的定量限及范圍等進(jìn)行了單獨(dú)驗證。

4 小 結(jié)

本研究首次建立了離子色譜法同時測定復(fù)方電解質(zhì)注射液中果糖、乳酸鈉、亞硫酸氫鈉的含量，該方法專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高，可用于復(fù)方電解質(zhì)注射液及其相關(guān)制劑的質(zhì)量控制與評價。