張 洋，譚韻湘，高譽珊，楊曉坤，栗晨璐，薛衛(wèi)國

(北京中醫(yī)藥大學,北京 100029)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種原因不明并且起病隱匿的漸進性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以記憶力和認知能力障礙為主要臨床表現(xiàn)。細胞外β-淀粉樣蛋白(β-Amyloid，Aβ)沉積所形成的老年斑(Senile plaques，SP)以及細胞內的神經(jīng)原纖維纏結是其兩大主要的病理特征。Aβ級聯(lián)假說認為Aβ處于AD發(fā)病的核心位置，Aβ產生或者清除失衡會造成大量Aβ堆積，產生神經(jīng)毒性、誘導神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應以及導致神經(jīng)元凋亡等一系列的AD病理特征[1-2]。神經(jīng)元內Aβ一直是AD發(fā)病機制及治療的熱點，目前認為神經(jīng)元內Aβ可能是造成突觸功能及認知功能損害的主要原因[3-4]。有研究發(fā)現(xiàn)，細胞內內體-自噬溶酶體途徑同時是重要的Aβ產生及清除途徑。細胞內Aβ被自噬囊泡包裹形成自噬小體，由線粒體提供能量，動力蛋白(Dynein)將其逆向轉運至胞體,然后與溶酶體結合形成自噬溶酶體，在溶酶體各種蛋白水解酶的作用下降解。Nixon等[5]研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)營養(yǎng)不良性突起及神經(jīng)元內存在大量自噬體和自噬溶酶體，說明AD患者自噬功能障礙，Aβ逆向轉運和降解受阻，同時自噬體、自噬溶酶體的大量存在導致細胞內Aβ大量產生及細胞外分泌。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，針刺干預可以降低APP/PS1雙轉基因小鼠海馬Aβ水平[6-9]，改善小鼠空間學習和記憶能力，其機制可能是通過自噬溶酶體途徑[10-13]。但是針刺降低小鼠海馬Aβ水平相關機制并不明確。本實驗選取AD病理初期的6月齡APP/PS1雙轉基因小鼠作為動物模型，針刺“百會”“涌泉”二穴，觀察研究逆向轉運動力蛋白Dynein和自噬溶酶體的降解相關蛋白組織蛋白酶D(Cathepsin D, CTSD)變化水平以及電針對其表達水平的影響，旨在闡明針刺是否通過調節(jié)機體的自噬水平而改善AD患者的學習和記憶能力，以期為臨床電針治療AD患者提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物模型與分組

1.1.1 實驗動物 6月齡健康SPF級雄性APP/PS1雙轉基因小鼠20只，購于北京華阜康生物科技股份有限公司[動物許可證號：SCXK(京)2019-0008]；同月齡雄性健康野生型C57BL/6小鼠10只，購于斯貝福(北京)生物技術有限公司[動物許可證號：SCXK(京)2019-0010]。小鼠均飼養(yǎng)在北京中醫(yī)藥大學動物中心，采用自然節(jié)律光照，自由進食、飲水，溫度(23±1)℃，濕度40%～70%。本實驗經(jīng)北京中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準。

1.1.2 實驗分組 轉基因小鼠滿6月齡時稱重排序，體質量約為(28.10±1.58)g，利用隨機數(shù)法將轉基因小鼠分為模型組(M)和電針組(E)，10 只/組，野生C57BL/6小鼠10只為空白對照組(C)，體質量約為(29.05±2.27)g。

1.2 干預方法

1.2.1 電針組 將小鼠用自制鼠袋俯臥位固定于實驗操作臺上，“百會”“涌泉”二穴參照第9版《實驗針灸學》及比較解剖學取穴定位。75%酒精常規(guī)消毒后，針刺深度為2～3 mm，“百會”穴行手針平刺留針，雙“涌泉”穴直刺后接入韓式電針儀，采用疏密波，頻率1/50 Hz，強度1 mA，以小鼠保持安靜不掙扎嘶叫為度。留針15 min/次，隔日1次。共治療6周。

1.2.2 模型組、空白對照組 以相同方法固定于實驗操作臺上，15 min/次，隔日1次，共束縛6周。

1.3 主要試劑與儀器

1.3.1 試劑 兔源Dynein抗體(美國，Abcam，ab171964);兔源Cathepsin D抗體(美國，Abcam，ab75852);Aβ(4G8)(美國，Biolegend，800701);鼠源GAPDH(proteintech，60004-1)；鼠源辣根過氧化物標記生物素(北京中杉金橋，ZB-2305);羊源辣根過氧化物標記生物素(proteintech，SA00001-2);山羊抗小鼠熒光二抗(美國，Abcam，ab150115);山羊抗兔熒光二抗(美國，Abcam，ab150077)；BCA蛋白定量試劑盒(北京普利萊有限公司)。

1.3.2 儀器 一次性針灸針(北京中研太和醫(yī)藥公司，0.25 mm×13 mm);LH202H型韓氏電針儀(北京華衛(wèi)產業(yè)開發(fā)公司);冰凍切片機(德國，Leica);酶標儀(美國，Bio-Rad);電泳儀、垂直電泳槽、轉膜儀(美國，Bio-Rad);曝光機(美國，Bio-Rad)。

1.4 觀察指標及取材、檢測方法

1.4.1 Morris水迷宮檢測小鼠空間學習記憶能力 各組小鼠干預6周后進行Morris水迷宮行為學檢測。Morris水迷宮為一圓形水池，池壁內有不同幾何圖形，分為4個不同象限，平臺置于第3象限中央，水溫在22 ℃左右，接入圖像采集系統(tǒng)記錄小鼠到達平臺時間和游泳路徑。實驗前1 d小鼠進行適應性訓練。

1.4.1.1 定位航行實驗 注水高于平臺1 cm，并倒入奶粉隱藏平臺，于1、2、4象限水池中點隨機面壁放入小鼠，若小鼠在60 s內找到并爬上平臺，記錄其實際時間并在平臺上停留15 s；若小鼠60 s內未找到平臺，引導小鼠至平臺上，并停留15 s，記錄小鼠找到平臺時間為60 s。每天訓練3次，每次間隔20 min，連續(xù)訓練4 d,記錄逃避潛伏期及游泳軌跡。

1.4.1.2 空間探索實驗 實驗第5天，撤掉平臺，第1象限中點面壁放入小鼠，記錄60 s內小鼠穿越原平臺次數(shù)以及在第3象限游泳路程。

1.4.2 取材方法 小鼠滿8月齡時取材，用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉。兩只小鼠用2%多聚甲醛+2.5%戊二醛心臟灌注后斷頭取腦，并置于2%多聚甲醛+2.5%戊二醛溶液中，4 ℃固定48 h，用于透射電鏡觀察。3只小鼠用4%多聚甲醛心臟灌注后斷頭取腦，4%多聚甲醛4 ℃固定72 h，梯度蔗糖脫水，OCT包埋，冠狀位冰凍切片，厚度為10 μm，-20 ℃冰箱保存，用于免疫熒光實驗。剩余5只小鼠斷頭取腦后，于冰上剝離小鼠海馬組織并迅速置于凍存管中，-80 ℃冰箱保存，用于Western blot檢測。

1.4.3 透射電鏡觀察海馬中自噬體、自噬溶酶體情況 取海馬CA1區(qū)大小約1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，梯度丙酮脫水，純樹脂包埋，切片，2%醋酸雙氧鈾染色，2%檸檬酸鉛染色5～6 min，蒸餾水洗凈；H-7560型透射電鏡觀察自噬體及自噬溶酶體情況并拍照。

1.4.4 海馬Aβ及CTSD免疫熒光雙標 取出冰凍切片，室溫復溫30 min;PBS沖洗;枸櫞酸鹽緩沖液熱修復15 min;PBS沖洗;山羊血清室溫封閉10 min;甩掉山羊血清封閉液，加入一抗(CTSD和4G8抗體等體積混勻)，4 ℃孵育過夜；次日，PBS沖洗；加入熒光二抗，室溫避光孵育1 h；PBS沖洗；DAPI封片。激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.4.5 Western blot檢測小鼠海馬CTSD與Dynein蛋白的相對表達量 稱取小鼠海馬組織，加入RIPA 裂解液和PMSF(RIPA：PMSF=100∶1)，于冰上用超聲儀充分研磨，4 ℃，12 000 r/min，離心20 min，提取上清液，BCA法測定蛋白濃度。加入上樣Buffer,95 ℃加熱5 min，每孔上樣量為2.5 μL，SDS-PAGE分離電泳完成后，轉膜至0.45 μM PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST清洗，裁膜，加入一抗(CTSD，1∶10 000；DIC,1∶2 000；GAPDH，1∶50 000)，4 ℃孵育過夜，TBST清洗，加入二抗(山羊抗兔HRP-IgG，1∶5 000；山羊抗鼠HRP-IgG，1∶50 000)，室溫下置于搖床孵育1 h，TBST清洗后滴加ECL發(fā)光液顯色，曝光，顯影。用Image J軟件分析各個條帶的灰度值，以GAPDH的灰度值為基準線計算出各目標條帶的相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 各組小鼠Morris水迷宮空間學習記憶能力比較

采用Morris水迷宮實驗檢測小鼠空間學習記憶能力，各組小鼠的空間學習記憶能力代表性路線軌跡圖如圖1所示。在定位航行實驗中，與空白對照組小鼠比較，模型組小鼠平均逃避潛伏期增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組小鼠比較，電針組小鼠平均逃避潛伏期減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。如圖2、表1所示。在空間探索實驗中，與空白對照組比較，模型組小鼠平均穿越平臺次數(shù)及平臺象限游泳路程減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組小鼠比較，電針組小鼠平均穿越平臺次數(shù)及平臺象限游泳路程增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。如表2所示。

表1 各組小鼠Morris水迷宮定位航行實驗逃避潛伏期時間比較

表2 各組小鼠Morris水迷宮空間探索實驗穿越平臺次數(shù)、平臺象限游泳路程比較

2.2 各組小鼠海馬自噬體、自噬溶酶體比較

采用透射電鏡觀察各組小鼠海馬自噬體、自噬溶酶體情況，如圖3所示：空白對照組小鼠海馬中可觀察到少量的自噬溶酶體，未觀察到明顯營養(yǎng)不良性突起(圖A、B)；模型組APP/PS1雙轉基因小鼠海馬中有大量的自噬體堆積，主要是在神經(jīng)元軸突末端(營養(yǎng)不良性突起)(圖D)，胞漿內可見許多自噬溶酶體(圖C)；電針組小鼠海馬神經(jīng)元軸突中也可以觀察到部分自噬體堆積，但明顯少于模型組(圖F)，胞體核周可見部分自噬溶酶體(圖E)。

2.3 CTSD和Aβ在小鼠海馬的免疫熒光共表達比較

自噬作為Aβ的一種重要降解方式，自噬泡包裹Aβ形成的自噬體，只有與溶酶體結合之后形成自噬溶酶體，在溶酶體中各種蛋白酶的作用下，才能發(fā)揮其生物學功能。CTSD作為溶酶體中一種重要的蛋白水解酶，在Aβ的降解中發(fā)揮著重要的作用。為了進一步說明CTSD和Aβ的相關情況，筆者標記了二者在海馬中共表達情況，如圖4所示。CTSD為綠色熒光標記，主要在核周(胞質)中表達；Aβ為紅色熒光標記，表達位置并不局限于核周(胞質)，并且二者存在共表達關系，說明被轉運至溶酶體的Aβ，可能是通過CTSD進行降解。

2.4 各組小鼠海馬逆行軸突轉運動力蛋白中間鏈(DIC)及CTSD表達量比較

在神經(jīng)元自噬過程中，軸突末端形成的自噬體在動力蛋白的協(xié)助下沿微管逆行轉運至胞體，然后與溶酶體結合形成自噬溶酶體，在溶酶體中各種水解酶的作用下發(fā)生降解?？梢妱恿Φ鞍缀徒M織蛋白酶(組織蛋白酶D)在神經(jīng)元自噬過程中發(fā)揮著重要的作用。所以檢測了動力蛋白中間鏈(DIC)和CTSD(組織蛋白酶D)的表達水平，以反映自噬流的運輸及降解狀態(tài),見圖5。Western Blot檢測顯示：與空白對照組比較，模型組DIC表達量降低，CTSD表達量增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，電針組DIC表達量增加，CTSD表達量降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組小鼠海馬DIC和CTSD相對表達量比較

3 討論

作為AD的典型病理特征之一，老年斑由腦神經(jīng)細胞外的β淀粉樣蛋白沉積所形成。Aβ級聯(lián)假說認為Aβ在AD的致病級聯(lián)反應中處于核心位置,機體生成的Aβ如果不能及時有效地清除，具有神經(jīng)毒性作用的Aβ就可能造成神經(jīng)元及突觸損傷，從而造成AD患者認知功能障礙。APP/PS1雙轉基因小鼠腦內Aβ生成、聚集以及認知功能障礙，能在一定程度上模擬AD患者的病理發(fā)展過程，是目前國際上較為公認的研究Aβ水平變化及機制的有效AD評價模型[14]。6月齡APP/PS1雙轉基因小鼠腦內已出現(xiàn)老年斑，并出現(xiàn)自噬溶酶體功能紊亂，所以本實驗采用6月齡APP/PS1雙轉基因小鼠為研究對象，從自噬溶酶體途徑角度探討電針降低AD患者腦內Aβ水平的可能機制。

自噬通常被認為是機體的一種自我保護機制，自噬可以清除機體錯誤的蛋白質，維持神經(jīng)元細胞結構的內穩(wěn)態(tài)[15]。在AD患者腦中，自噬可以清除機體產生過多的Aβ，但同時自噬可能是一把雙刃劍[16]。在AD早期，自噬功能的增強會加快Aβ的清除，防止其毒性作用，保護神經(jīng)元，但隨著毒性蛋白的不斷增加，機體自噬溶酶體系統(tǒng)被破壞，增強機體自噬功能不但不能加快Aβ清除，反而可能會產生更多的Aβ，促使神經(jīng)元變性。自噬溶酶體途徑又稱為自噬流，包括自噬啟動、自噬形成、自噬體溶酶體融合以及蛋白質降解4個階段，其中任何一個階段出現(xiàn)問題都會使Aβ不能被有效地清除，造成Aβ的堆積。神經(jīng)元突起中存在驅動蛋白(kinesin)介導的順向運輸以及動力蛋白(Dynein)介導的逆向運輸，并且動力蛋白作為自噬體沿微管系統(tǒng)逆向轉運至胞體的唯一蛋白，動力蛋白中間鏈(Dynein intermediate chain, DIC)作為動力蛋白的重要組成部分，參與自噬底物的結合，并且對于自噬體與溶酶體的結合也有著非常重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)[17]，Aβ參與Dynein競爭性結合，從而減少Dynein與自噬體結合，導致自噬體不能被及時轉運至胞體完成降解。與正常人比較，AD患者腦內DIC表達量同樣下降[18]。對于AD患者而言，本就不足的Dynein，還有部分自噬體不能與其有效結合，造成神經(jīng)元突起中大量自噬體堆積。而作為溶酶體中重要水解酶的CTSD，參與機體錯誤蛋白質的降解，有研究發(fā)現(xiàn)，CTSD參與神經(jīng)元中許多蛋白質(包括APP)降解[19-20]，所以對于自噬-溶酶體系統(tǒng)，CTSD同樣非常重要。

本實驗選取6月齡APP/PS1雙轉基因小鼠電針干預6周，8月齡時取材。此時，APP/PS1雙轉基因小鼠腦內已經(jīng)有大量老年斑，小鼠的空間學習和記憶能力下降，機體的自噬功能處于紊亂狀態(tài)，造成部分Aβ堆積形成老年斑。Morris水迷宮結果顯示模型組小鼠空間學習和記憶能力下降。本研究關注的是細胞內Aβ及自噬轉運、降解狀態(tài)。透射電鏡觀察到其海馬中有大量的自噬體堆積，主要是在神經(jīng)元軸突末端，以及胞體許多自噬溶酶體堆積，說明雙轉基因小鼠自噬體逆向轉運、自噬體溶酶體融合以及蛋白質降解發(fā)生障礙。免疫熒光結果顯示CTSD和Aβ在小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元胞體存在共表達，說明CTSD作為溶酶體中一種重要的水解酶可能參與細胞內Aβ降解；由于自噬是Aβ一種重要的降解途徑，被自噬泡包裹的Aβ(突起上)經(jīng)動力蛋白逆向轉運到胞體完成降解。Western Blot結果表明，與空白對照組比較，模型組動力蛋白中間鏈(DIC)表達量降低，進一步驗證了雙轉基因小鼠自噬體逆向轉運障礙的觀點；由于過多的自噬體在神經(jīng)元軸突末端堆積，機體為了加快自噬體的降解而產生更多的組織蛋白酶助其降解，故較空白對照組，模型組CTSD表達量反而增加，形成胞體的許多自噬溶酶體堆積。所以，在AD病理中期，可以通過調節(jié)機體紊亂的自噬狀態(tài)，以達到保護機體治療AD患者的目的。

針對AD患者“腎氣虧虛，痰濁蒙竅”的病機特點，筆者選用“百會”“涌泉”二穴“益腎祛濁，開竅醒神”。Morris水迷宮結果顯示，電針組逃避潛伏期和目標象限游泳路程優(yōu)于模型組，說明電針可有效改善APP/PS1轉基因鼠的空間學習記憶能力。電針作為非藥物療法，可能通過調節(jié)自噬，降解細胞內代謝產物，防治有害蛋白的體內堆積，保持神經(jīng)系統(tǒng)的功能。自噬體的運輸以及自噬溶酶體的降解作為自噬的重要組成部分，同樣也應該受到電針的影響。本實驗Western Blot結果表明：雙轉基因小鼠海馬區(qū)中Dynein表達量降低，CTSD表達量升高；而電針能升高Dynein水平，降低CTSD表達量，表明針刺“百會”“涌泉”二穴治療AD的生物學機制可能是提高海馬神經(jīng)元逆向轉運能力，平衡溶酶體中CTSD的水平，從而達到調整機體紊亂的自噬狀態(tài)，降低AD患者腦內Aβ等有害蛋白的堆積，改善其學習和記憶能力，達到預防和治療AD的目的。但電針調節(jié)機體自噬的確切機制尚需要進一步研究，以明確其確切的途徑及作用靶點，為臨床應用提供基礎研究證據(jù)。