艾灸對(duì)癌性疲勞小鼠JAK-STAT信號(hào)通路的影響

李丹 胡凱文 韓麗 趙百孝

癌因性疲勞(Cancer related fatigue，CRF)是一種由腫瘤或者腫瘤治療引起的與患者體力不成正比，不能通過(guò)休息緩解的慢性主觀(guān)性疲勞。研究表明，在積極治療階段，30%～60%癌癥患者會(huì)經(jīng)歷中度或重度疲勞，而在治療后一年內(nèi)30%的患者會(huì)經(jīng)歷重度疲勞，在治療十年后仍有20%患者遺留重度疲勞[1-3]。目前CRF的治療主要針對(duì)貧血、睡眠障礙等的中西藥治療和運(yùn)動(dòng)、行為、心理社會(huì)干預(yù)，尚無(wú)確切療效的藥物緩解這一現(xiàn)狀[4]。CRF的發(fā)病機(jī)制尚不明確[5]，炎癥假說(shuō)認(rèn)為長(zhǎng)期存在的炎癥環(huán)境，特別是如白介素-1(interleukin-1，IL-1)、白介素-6(interleukin-1，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)等促炎性細(xì)胞因子可誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)熱，在CRF中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6-7]。而IL-6等細(xì)胞因子可激活Janus激酶—信號(hào)傳導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(Janus kinase-signal transducers and activators of transcription，JAK-STAT)信號(hào)通路從而加重炎癥反應(yīng)或促進(jìn)腫瘤的生成導(dǎo)致CRF的惡化[8]。前期研究表明，艾灸可降低IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子以改善癌性疲勞的狀態(tài)[9-11]。為了進(jìn)一步發(fā)掘艾灸治療CRF的作用因素及內(nèi)在機(jī)制，本研究通過(guò)觀(guān)察艾灸及同波長(zhǎng)紅外線(xiàn)對(duì)CRF模型小鼠疲勞跑臺(tái)實(shí)驗(yàn)及懸尾實(shí)驗(yàn)等行為學(xué)、炎性因子及JAK-STAT信號(hào)通路上相關(guān)指標(biāo)的影響，探究艾灸的作用機(jī)制及靶點(diǎn)，以期為CRF的中醫(yī)藥防治方案提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與細(xì)胞

SPF級(jí)7周齡雌性Balb/c小鼠：體質(zhì)量(20～30) g。由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，SPF/VAF級(jí)。許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006。所有小鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物室，室溫20～25℃，相對(duì)濕度60%～80%，保持通風(fēng)，定時(shí)換氣，每日光照12小時(shí)。4T1小鼠乳腺癌細(xì)胞：由中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)提供。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(編號(hào)：BUCM-2021031104-1071)。

1.2 試劑與儀器

Total RNA Extraction Kit(批號(hào)：GPQ1801，GenePool)；mRNA/lncRNA qPCR Kit (批號(hào)：GPQ1808，GenePool)；Jak1 antibody(批號(hào)：133666，CST)；Phospho-Jak1 antibody(批號(hào)：bs-3238R，Bioss)；STAT3 antibody(批號(hào)：ab31370，Abcam)；Phospho-STAT3 antibody(批號(hào)：ab76315，Abcam)；Actin antibody(批號(hào)：ab6276，Abcam)；艾條(16 mm×130 mm，北京國(guó)醫(yī)研醫(yī)藥技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)。

超凈工作臺(tái)FLC-3型(哈爾濱市東聯(lián))；離心機(jī)Centrifuge 5415D(Eppendorf)；熒光定量PCR儀9600Plus型(中國(guó)Bioer Technology)；溫控?fù)u床TS-2000A(中國(guó)其林貝爾)；電泳儀PP-1150(中國(guó)CAVOY)；紅外陶瓷/石墨烯智能灸療儀BXM-02型(北京德源博匯科技有限公司)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)、分組、造模及干預(yù)

4T1小鼠乳腺癌細(xì)胞，用含10%胎牛血清，100 U/mL青/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中飽和濕度下進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，2～3天換液傳代，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

待小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，隨機(jī)將其分為空白組、模型組、艾灸組、紅外組。除空白外，參照歐陽(yáng)明子等[12]方法，選擇1×107個(gè)/mL 4T1乳腺癌細(xì)胞懸液于小鼠左腋下種植0.1 mL，一周后等到腫瘤大小達(dá)到50～100 mm3后，向小鼠腹腔注射順鉑(5 mg/kg)一次，復(fù)制CRF小鼠模型。

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并按人與動(dòng)物等效劑量換算法，分別算得艾灸干預(yù)劑量、時(shí)間及頻率，即艾灸組在模型組基礎(chǔ)上艾灸關(guān)元穴；紅外組在小鼠關(guān)元穴距離5 cm處垂直發(fā)射紅外光源，輸出功率8 W, 紅外波長(zhǎng)3.9 μm, 輻照面積12.5 cm2進(jìn)行干預(yù)治療，兩組每次干預(yù)20分鐘，1次/日，一周6次，干預(yù)4周。

1.4 行為學(xué)檢測(cè)

1.4.1 疲勞跑臺(tái)實(shí)驗(yàn) 干預(yù)完24小時(shí)，采用YLS-10B小鼠轉(zhuǎn)輪式疲勞儀研究各組小鼠間疲勞狀態(tài)，記錄小鼠每次實(shí)驗(yàn)的奔跑時(shí)間、奔跑距離及電擊次數(shù)。

1.4.2 懸尾實(shí)驗(yàn) 將小鼠尾部后1/3處用膠帶懸掛于支架上，頭部距離臺(tái)面15 cm，計(jì)時(shí)6分鐘，觀(guān)察小鼠后四分鐘(3～6分鐘)的不動(dòng)時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.5 組織取材

各組小鼠行為學(xué)檢測(cè)后立即取材。2%戊巴比妥鈉(0.2 mL/100 g)腹腔注射麻醉后，摘除眼球取血，置于干凈的EP管中，室溫靜置2小時(shí)，3500 r/分鐘離心15分鐘，取血清置-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。剝離瘤塊，勻漿保存于-80 ℃冰箱備用檢測(cè)。

1.6 指標(biāo)檢測(cè)

1.6.1 血清學(xué)指標(biāo) 采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)血清IL-6、TNF-α相關(guān)炎性因子濃度。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，分別設(shè)置不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白孔和樣本孔，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體，37℃恒溫箱溫育60分鐘，棄去液體，重復(fù)洗版5次，加入底物，37℃避光孵育15分鐘，各孔加入終止液，15分鐘內(nèi)在450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品直線(xiàn)回歸計(jì)算出濃度相對(duì)值。

1.6.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)Jak1、STAT3及IL-6 mRNA表達(dá) 按Total RNA Extraction Kit(DNaseⅠ)試劑盒說(shuō)明提取腫瘤細(xì)胞樣本中總RNA并定量，1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，檢測(cè)RNA的完整性。按mRNA cDNA Synthesis Kit試劑盒說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆?。按mRNA/lncRNA qPCR Kit試劑盒說(shuō)明進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 30秒，(95℃ 5秒，60℃ 30秒)×45個(gè)循環(huán)，同時(shí)在60～95℃進(jìn)行融解曲線(xiàn)分析，采用2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度，所有樣本均設(shè)6個(gè)重復(fù)。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.6.3 Western blot法檢測(cè)Jak1、Phospho-Jak1、STAT3、Phospho-STAT3蛋白表達(dá) 按Protein Extraction Kit(GenePool/GPP1815)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行瘤體組織BCA法蛋白定量，依照電泳上樣量需要用SDS-PAGE Loading Buffer(5×)調(diào)整蛋白濃度，100℃煮沸變性10分鐘備用。配制12%的分離膠，5%濃縮膠。算得待檢測(cè)蛋白樣品上樣量，濃縮膠恒壓80V，約20分鐘；分離膠恒壓120V，電泳至溴酚藍(lán)到凝膠底部。2小時(shí)恒流300mA轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%BSA室溫封閉1小時(shí)。將PVDF膜置于雜交袋中，分別加入配制好的一抗4℃孵育過(guò)夜。TBST緩沖液洗膜3次，每次10分鐘，加入相應(yīng)二抗，室溫孵育1小時(shí)。TBST緩沖液洗膜3次，每次10分鐘。按ECL Plus Western Blot Kit試劑盒說(shuō)明暗室中曝光，顯影并定影。條帶灰度值采用Quantity One v.4.6.2軟件進(jìn)行讀取，除以?xún)?nèi)參Actin灰度值，即得樣品中目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量，所有樣本均設(shè)6個(gè)重復(fù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Balb/c小鼠行為學(xué)檢測(cè)

Balb/c小鼠干預(yù)4周后通過(guò)檢測(cè)疲勞跑臺(tái)實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證機(jī)體和精神兩方面疲勞，如下表所示，與空白組相比，模型組小鼠跑臺(tái)時(shí)間、距離均顯著降低(P<0.01)，電擊次數(shù)和懸尾不動(dòng)時(shí)間顯著增加(P<0.01)，證明癌性疲勞小鼠模型復(fù)制成功。與模型組比較，艾灸組、紅外組均增加了小鼠的跑臺(tái)時(shí)間、距離(P<0.05)，降低了小鼠跑臺(tái)的電擊次數(shù)和懸尾不動(dòng)時(shí)間(P<0.05)。與紅外組比較，艾灸組小鼠的跑臺(tái)疲勞時(shí)間、距離有增加趨勢(shì)，電擊次數(shù)減少(P>0.05)，懸尾不動(dòng)時(shí)間減少(P<0.05)，說(shuō)明模型組造模成功，艾灸及紅外治療能緩解CRF小鼠的疲勞狀態(tài)。見(jiàn)表2、3。

表2 各組小鼠疲勞跑臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

表3 各組小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較分鐘)

2.2 ELISA法檢測(cè)IL-6、TNF-α含量

如下圖所示，ELISA 提示小鼠血清中IL-6及TNF-α 含量較空白組顯著上升，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；經(jīng)艾灸及紅外灸療儀干預(yù)治療后小鼠血清中IL-6及TNF-α含量減少，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與紅外組比較，艾灸組小鼠血清中IL-6及TNF-α含量降低，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明艾灸及紅外照射治療能改善CRF小鼠的炎癥狀態(tài)。見(jiàn)表4。

表4 各組小鼠血清IL-6、TNF-α水平比較

2.3 RT-PCR法檢測(cè)Jak1 mRNA、STAT3 mRNA及IL-6 mRNA表達(dá)

小鼠經(jīng)艾灸及紅外灸療儀干預(yù)后小鼠腫瘤組織中的Jak1 mRNA、STAT3 mRNA及IL-6 mRNA表達(dá)減少，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與紅外組比較，艾灸組小鼠瘤體組織的Jak1 mRNA、STAT3 mRNA及IL-6 mRNA降低，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明艾灸及紅外照射治療能下調(diào)CRF小鼠的Jak1 mRNA、STAT3 mRNA及IL-6m RNA的表達(dá)，激活JAK-STAT信號(hào)通路。見(jiàn)表5。

表5 各組小鼠瘤體組織JAK1、STAT3、IL-6 mRNA表達(dá)水平比較

2.4 Westernblot法檢測(cè)Jak1、Phospho-Jak1、STAT3、Phospho-STAT3蛋白的表達(dá)

艾灸組小鼠腫瘤組織P-Jak1與P-STAT3表達(dá)較模型組降低，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；紅外組小鼠腫瘤組織P-Jak1與P-STAT3表達(dá)較模型組降低，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；說(shuō)明艾灸及紅外治療能下調(diào)P-Jak1與P-STAT3蛋白的表達(dá)。圖1、表6。

表6 各組小鼠瘤體組織P-Jak1/JAK1、P-STAT3/STAT3蛋白表達(dá)水平比較

圖1 Jak1、Phospho-Jak1、STAT3、Phospho-STAT3蛋白條帶圖

3 討論

癌性疲勞隸屬中醫(yī)理論中“虛證”和“虛勞”范疇, 《黃帝內(nèi)經(jīng)》曰“虛者補(bǔ)之、陷下則灸之”，說(shuō)明艾灸療法可以較好地改善虛勞下陷等病癥?，F(xiàn)代研究揭示，劉曉榮[13]、霍雨佳等[14]根據(jù)《素問(wèn)·陰陽(yáng)應(yīng)象大論篇》中所闡述的“形不足者，溫之以氣”及李東垣的“脾主五臟元?dú)狻钡睦碚?，觀(guān)察艾灸神闕、關(guān)元、氣海、中脘、足三里對(duì)CRF的影響，發(fā)現(xiàn)艾灸能夠改善癌癥患者的疲乏癥狀及生活質(zhì)量。

JAK-STAT通路是一條參與細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、凋亡的重要細(xì)胞因子信號(hào)通路[15]，該通路的異?；罨蛔C明在腫瘤細(xì)胞的克隆性增殖和分化中發(fā)揮了重要作用[16]。JAK是一類(lèi)非特異受體型酪氨酸激酶，主要包含四個(gè)亞型，分別為JAK1、JAK2、JAK3和TYK2，并能被包括IL-6在內(nèi)的多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子活化，繼而激活JAK-STAT信號(hào)通路，參與到多種疾病的發(fā)生發(fā)展[8]。白細(xì)胞介素6(interleukin6，IL-6) 是一種多功能細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)網(wǎng)中占有重要地位。IL-6與其受體結(jié)合后可通過(guò)3條信號(hào)通路發(fā)揮生物學(xué)功能：JAK/STAT途徑、Ras/Erk途徑和PI3K介導(dǎo)的途徑[17-19]。IL-6與IL-6Rα和gp130兩個(gè)受體結(jié)合后，通過(guò)磷酸化JAK而激活STAT3轉(zhuǎn)錄因子，磷酸化的STAT3形成二聚體，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中，使JAK/STAT3信號(hào)通路持續(xù)激活而引起腫瘤組織的增長(zhǎng)[17，20-21]。IL-6在癌癥患者中表達(dá)增高，而JAK-STAT通路參與了IL-6介導(dǎo)的免疫細(xì)胞炎癥反應(yīng)，表明炎癥因子IL-6與JAK-STAT通路可能與促進(jìn)腫瘤或者癌性疲勞機(jī)制有關(guān)[22-23]。另外，研究表明，TNF-α、IL-6能抑制促紅細(xì)胞生成素，減少血紅蛋白的產(chǎn)生及活動(dòng)耐受力，亦能導(dǎo)致癌性發(fā)熱，使機(jī)體長(zhǎng)期處于消耗性狀態(tài)，在CRF的發(fā)生過(guò)程中起關(guān)鍵作用[24-25]。

艾灸能直接激活JAK/STAT3信號(hào)通路調(diào)節(jié)炎癥狀態(tài)。楊馨等[26-27]通過(guò)干預(yù)滑膜細(xì)胞內(nèi)JAK-STAT信號(hào)通路及分泌功能，證明艾灸能有效改善動(dòng)物RA滑膜炎癥。趙繼夢(mèng)等[28]運(yùn)用隔藥灸抑制了NF-κB通路和STAT3的磷酸化, 減少了IL-6、IL-1β的釋放，從而緩解了腸炎模型大鼠的結(jié)腸炎癥。斐建等[29]發(fā)現(xiàn)艾灸可通過(guò)JAK-STAT3信號(hào)通路調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境。

本研究中，CRF模型小鼠通過(guò)疲勞跑臺(tái)實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn)兩方面反映了荷瘤小鼠的疲勞狀況。如結(jié)果所示，各實(shí)驗(yàn)組疲勞度由高到低依次為：模型組、紅外組、艾灸組、空白組，證明癌性疲勞小鼠模型復(fù)制成功，艾灸及紅外灸療儀均能有效緩解CRF小鼠的疲勞狀態(tài)，艾灸治療作用更顯著。炎癥因子作為癌性疲勞的發(fā)病機(jī)制假說(shuō)之一，本實(shí)驗(yàn)示，與空白組相比，模型組小鼠血清中IL-6、TNF-α的含量明顯升高，同國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果一致。與模型組比較，紅外組、艾灸組均有效緩解了CRF鼠的炎癥狀態(tài)。在探究艾灸及紅外光治療癌性疲勞的作用機(jī)理中，JAK-STAT信號(hào)通路的各效應(yīng)分子的表達(dá)也受到不同程度影響。其中, 與模型組比較，紅外組與艾灸組可明顯降低CRF小鼠P-JAK1、P-STAT3蛋白表達(dá)，IL-6、JAK1及STAT3mRNA的表達(dá)，提示艾灸及紅外灸可通過(guò)不同程度下調(diào)JAK-STAT信號(hào)通路，調(diào)節(jié)炎癥因子，起到抗癌性疲勞的作用。此外，與紅外組比較，艾灸組明顯降低了血清中IL-6、TNF-α的含量，減少了Jak1 mRNA、STAT3 mRNA及IL-6 mRNA的表達(dá)，P-JAK1、P-STAT3的蛋白表達(dá)上有降低的趨勢(shì)，說(shuō)明艾灸組對(duì)JAK-STAT信號(hào)通路的影響上優(yōu)于紅外組，填補(bǔ)了國(guó)際上觀(guān)察傳統(tǒng)艾灸與紅外灸對(duì)CRF療效比較及相關(guān)機(jī)制的空白，也進(jìn)一步揭示了艾灸的作用機(jī)理。

總之，IL-6介導(dǎo)的JAK-STAT信號(hào)通路相關(guān)的炎癥反應(yīng)在CRF的發(fā)生與進(jìn)展中起重要作用。本研究表明，艾灸可不程度降低荷瘤及順鉑導(dǎo)致的癌性疲勞，其中紅外光發(fā)揮了關(guān)鍵作用，其機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)IL-6、TNF-α及JAK-STAT信號(hào)通路的表達(dá)發(fā)揮作用，該研究結(jié)果可為艾灸治療CRF提供一定科學(xué)依據(jù)。