姚偉潔 杜博冉 李瀟 馮欣

血管生成參與了妊娠的全過程。血管生成伴隨著子宮和臍帶血流量增加，通過提供給胎兒充足的血液，從而促進胚胎的著床與發(fā)育[1]。血管生成異常，會導致流產(chǎn)的風險增加[2]。陳雷寧等[3]采用三維多普勒超聲發(fā)現(xiàn)，復發(fā)性自然流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion，RSA)患者的子宮內(nèi)膜血管化程度與正常妊娠女性相比較顯著降低，表明血管生成異常是RSA患者的病理特征。研究表明，滋養(yǎng)層細胞功能缺陷導致的血管生成異常被認為是RSA最重要的原因之一[4]。因此，改善胎盤血管生成可以作為治療RSA的有效方法。

中藥復方養(yǎng)血安胎顆粒是北京婦產(chǎn)醫(yī)院臨床應用30余年的院內(nèi)制劑，在臨床治療RSA中具有確切的療效[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)養(yǎng)血安胎顆粒能夠通過調(diào)節(jié)溶酶原活化物抑制因子-1治療RSA[5]，而溶酶原活化物抑制因子-1是胎盤功能不全的標志，與血管生成密切相關(guān)[7]。課題組進而通過整合藥理學結(jié)合Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes富集分析發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)血安胎顆粒治療RSA與調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)信號通路密切相關(guān)[8]。VEGF對血管生成發(fā)揮促進作用，是重要的血管生長調(diào)節(jié)因子[9]，但是養(yǎng)血安胎顆粒調(diào)控VEGF的機制尚缺少深入報道。研究發(fā)現(xiàn)，miR-16與VEGF的3-UTR互補，進而抑制人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞和人絨毛膜癌細胞(JEG-3)中的VEGF表達，從而抑制血管生成[10]。

研究發(fā)現(xiàn)，外泌體在滋養(yǎng)層細胞與子宮各種細胞的相互作用中發(fā)揮了重要的溝通作用，從而保證了血管生成和胎盤的正常發(fā)育[11]，養(yǎng)血安胎顆粒能否通過外泌體作為媒介調(diào)控VEGF以促進血管生成仍不清楚。故本實驗以養(yǎng)血安胎顆粒為治療藥物，滋養(yǎng)層細胞和人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)為研究對象，血管生成和外泌體為切入點，探討?zhàn)B血安胎顆粒調(diào)控VEGF以促進血管生成的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、實驗細胞及培養(yǎng)

20只SD雄性大鼠，鼠齡6～8周、體質(zhì)量(200±20)g、購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物許可證編號：SCXK(京)2016-0006。

人絨毛膜癌細胞(JEG-3)、人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)均購自武漢普諾賽生命科技有限公司；JEG-3細胞及HUVECs均培養(yǎng)在25 cm2培養(yǎng)瓶中，使用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含10%胎牛血清及1%青鏈霉素混合液，培養(yǎng)環(huán)境為37℃和5%二氧化碳的培養(yǎng)箱。

1.2 實驗藥物

養(yǎng)血安胎顆粒(8 g/袋，每g含生藥3.25 g)，首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院制劑(批準文號：京藥制字Z20062027；產(chǎn)品批號：200301Y)，由當歸417 g、白芍417 g、續(xù)斷417 g、桑寄生417 g、蓮子417 g、菟絲子500 g、山藥417 g和廣木香250 g組成，煎煮并濃縮成顆粒至1000 g。

1.3 實驗試劑

小鼠單克隆VEGF抗體(Santa Cruz，貨號：sc-7269)，兔多克隆p-VEGFR2抗體(貨號：ab194806)，兔單克隆CD9抗體(貨號：ab92726)，小鼠單克隆TSG101抗體(貨號：ab83)，兔多克隆Flotillin 1抗體(貨號：ab41927)，小鼠單克隆β-actin抗體(貨號：ab8226)，購自Abcam公司。Trizol試劑(Invitrogen，貨號：223306)，TransStart Tip Green qPCR SuperMix(全式金，批號：20200105)，TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(全式金，批號：20200105)，高效RIPA組織/細胞裂解液(索萊寶，批號：20200305)，超敏發(fā)光液(Millipore，批號：1907701)，BCA蛋白定量試劑盒(博奧森，批號：20190805)，CCK-8試劑盒(尚寶生物，批號：20200111)，miR-16-5p mimic、NC及轉(zhuǎn)染試劑(銳博生物)。

1.4 實驗儀器

超速離心機(美國Beckman公司，L-80XP)，實時熒光定量PCR儀(Bio-Rid，CFX96TM)，PowerPacTM基礎(chǔ)電泳儀電源(Bio-Rid)，Mini-PROTEAN?Tetra電泳槽(Bio-Rid)，小型Trans-Blot?轉(zhuǎn)印槽(Bio-Rid)，全波長酶標儀(Molecular Devices，SpectraMax Plus 384)。

1.5 實驗方法

1.5.1 養(yǎng)血安胎含藥血清的制備 將20只SD大鼠適應性喂養(yǎng)一周后，隨機分為2組，每組10只，分別為空白血清組和養(yǎng)血安胎血清組。其中養(yǎng)血安胎血清組每天灌胃給予6.24 g/kg的養(yǎng)血安胎溶液，空白血清組每次灌胃給予等量蒸餾水。連續(xù)給藥7天，末次給藥1小時后處死，腹主動脈取血，靜置2小時后，使用離心機在4℃，3 000r/min離心20分鐘，吸取上清液，60℃滅活處理后，通過0.22 μm的微孔濾膜除菌，隨后將血清分裝凍存?zhèn)溆肹12]。

1.5.2 JEG-3細胞的分組與處理 將JEG-3細胞以4×103細胞/孔的數(shù)量接種于96孔板中或4×105細胞/孔的數(shù)量接種于6孔板中并放置過夜，隨后將6孔板的細胞分為4組，分別為空白對照+mimic NC組、養(yǎng)血安胎+mimic NC組、空白對照+miR-16 mimic組和養(yǎng)血安胎+miR-16 mimic組。其中空白對照+mimic NC組加入空白組血清并轉(zhuǎn)染miR-16-5p mimic NC，養(yǎng)血安胎+mimic NC組加入養(yǎng)血安胎含藥血清并轉(zhuǎn)染miR-16-5p mimic NC，空白對照+miR-16 mimic組加入空白組血清并轉(zhuǎn)染miR-16-5p mimic，養(yǎng)血安胎+miR-16 mimic組加入養(yǎng)血安胎含藥血清并轉(zhuǎn)染miR-16-5p mimic。72小時后收集細胞[13]。96孔板細胞分為空白對照組，1%養(yǎng)血安胎組、5%養(yǎng)血安胎組和10%養(yǎng)血安胎組，分別加入空白血清，1%、5%、10%含藥血清。

1.5.3 外泌體的分離 通過差速離心法分離JEG-3細胞分泌的外泌體，具體方法為將培養(yǎng)有JEG-3細胞的培養(yǎng)基先后以300 g離心10分鐘，2 000 g離心15分鐘，10 000 g離心30分鐘，隨后吸取上清液并以70 000 g離心70分鐘2次，得到的沉淀物為外泌體。隨后使用磷酸緩沖鹽溶液溶解外泌體，用于后續(xù)實驗[14]。

1.5.4 HUVECs的分組與外泌體共培養(yǎng) 將HUVECs以4×103細胞/孔的數(shù)量接種于96孔板中或4×105細胞/孔的數(shù)量接種于6孔板中并放置過夜，將6孔板的細胞設(shè)置空白對照+mimic NC組、養(yǎng)血安胎+mimic NC組、空白對照+miR-16 mimic組和養(yǎng)血安胎+miR-16 mimic組。按1∶40 000將HUVECs分別與相應組別JEG-3細胞分泌的外泌體共培養(yǎng)24小時[15]。96孔板細胞分組同1.5.2。

1.6 檢測指標

1.6.1 Cell Counting Kit-8(CCK-8)法測定JEG-3和HUVECs的活力 將96孔板中JEG-3細胞放置過夜后，加入不同濃度養(yǎng)血安胎含藥血清(分別為1%、5%、10%)分別處理JEG-3細胞24小時和48小時；將96孔板中HUVECs放置過夜后，按照步驟1.5的方法處理細胞；分別在JEG-3細胞和HUVECs每孔中加入CCK-8溶液后37℃孵育3小時，使用酶標儀在490 nm處測定吸光度值。

1.6.2 實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)法檢測JEG-3細胞、外泌體和HUVECs中miR-16水平的變化 使用步驟1.5.2的方法處理JEG-3細胞，步驟1.5.4的方法處理HUVECs，隨后收集細胞和外泌體。采用Trizol法提取細胞和外泌體中的總RNA，然后通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進而通過SYBR預混系統(tǒng)和特異性引物進行RT-PCR擴增，以U6為內(nèi)參，計算2-△△Ct目的基因相對表達量，結(jié)果以倍數(shù)形式表示。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物

1.6.3 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)法檢測JEG-3細胞和HUVECs中VEGF和磷酸化血管內(nèi)皮細胞生長因子受體2(phosphorylated VEGF receptor 2，p-VEGFR2)蛋白表達及外泌體的標記蛋白的表達 使用步驟1.5.2的方法處理JEG-3細胞，步驟1.5.4的方法處理HUVECs，隨后收集細胞和外泌體。使用RIPA裂解液提取細胞中的總蛋白，并使用蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度，將蛋白加入十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝中，使用電泳分離蛋白質(zhì)，隨后使用濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)將蛋白轉(zhuǎn)移至0.45 μm的PVDF膜上。使用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2小時，4℃下加入相應一抗孵育過夜，回收一抗后洗膜，加入對應二抗室溫孵育1小時，加入電化學發(fā)光試劑并在凝膠成像系統(tǒng)中形成圖像。使用Image J軟件計算樣品灰度值，計算蛋白表達，將β-actin作為內(nèi)標蛋白，結(jié)果以倍數(shù)的形式表示。一抗分別為小鼠單克隆VEGF抗體、兔多克隆p-VEGFR2抗體、兔單克隆CD9抗體、小鼠單克隆TSG101抗體、兔多克隆Flotillin 1抗體。

1.7 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 養(yǎng)血安胎含藥血清對JEG-3細胞活力的影響

結(jié)果顯示，與空白對照組、1%養(yǎng)血安胎組比較，24小時和48小時的5%和10%養(yǎng)血安胎組JEG-3細胞活力均顯著升高(P<0.05)；與48小時的5%養(yǎng)血安胎組比較，48小時的10%養(yǎng)血安胎組JEG-3細胞活力進一步升高(P<0.05)，表明養(yǎng)血安胎含藥血清能夠提高JEG-3細胞的細胞增殖，后續(xù)實驗選擇10%含藥血清干預JEG-3細胞48小時。見表2。

表2 不同濃度養(yǎng)血安胎含藥血清在不同時間點對JEG-3細胞活力的影響

2.2 外泌體分離結(jié)果

使用超速離心法對處理后的JEG-3細胞培養(yǎng)基中外泌體進行分離，通過Western blot法對外泌體標記蛋白進行測定。結(jié)果顯示，CD9、TSG101和Flotillin1蛋白表達呈陽性，Calnexin蛋白表達陰性，表明分離得到的物質(zhì)為外泌體，且外泌體中未包含細胞碎片，純度符合標準。見圖1。

圖1 Western blot法測定外泌體標志性蛋白的表達結(jié)果

2.3 外泌體對HUVECs細胞活力的影響

將外泌體與HUVECs共培養(yǎng)，明確其對細胞增殖的影響。結(jié)果顯示，與空白對照+mimic NC組比較，miR-16 mimic來源的外泌體干預后，HUVECs細胞活力顯著降低(P<0.05)；與空白對照+mimic NC組、空白對照+miR-16 mimic組比較，養(yǎng)血安胎來源的外泌體干預后，HUVECs細胞活力顯著升高(P<0.05)，表明養(yǎng)血安胎能夠通過外泌體對HUVECs的細胞增殖進行調(diào)節(jié)，其調(diào)節(jié)作用可能與外泌體中miR-16水平有關(guān)。見表3。

表3 不同處理組細胞的外泌體對HUVECs細胞活力的影響

2.4 養(yǎng)血安胎顆粒對JEG-3細胞、HUVECs及外泌體中miR-16的影響

結(jié)果顯示，在JEG-3細胞中，與空白對照+mimic NC組、養(yǎng)血安胎+mimic NC組比較，轉(zhuǎn)染miR-16 mimic后，miR-16水平均顯著升高(P<0.05)，表明miR-16被成功過表達。與空白對照+mimic NC組、空白對照+miR-16 mimic組比較，使用養(yǎng)血安胎干預后，miR-16水平均顯著降低(P<0.05)，表明養(yǎng)血安胎含藥血清能夠抑制miR-16水平。見表4。

在外泌體中，與空白對照+mimic NC組、養(yǎng)血安胎+mimic NC組比較，轉(zhuǎn)染miR-16 mimic后，外泌體中miR-16水平均顯著升高(P<0.05)；與空白對照+mimic NC組、空白對照+miR-16 mimic組比較，使用養(yǎng)血安胎干預后，miR-16水平均顯著降低(P<0.05)，表明JEG-3細胞miR-16變化能夠進一步影響其分泌的外泌體中miR-16水平。見表4。

在HUVECs中，與空白對照+mimic NC組、養(yǎng)血安胎+mimic NC組比較，miR-16 mimic來源的外泌體干預后，HUVECs中miR-16水平均顯著升高(P<0.05)；與空白對照+mimic NC組、空白對照+miR-16 mimic組比較，養(yǎng)血安胎來源的外泌體干預后，HUVECs中miR-16水平均顯著降低(P<0.05)，表明外泌體與HUVECs共培養(yǎng)后，外泌體進入HUVECs中，并影響了HUVECs中miR-16水平。見表4。

表4 養(yǎng)血安胎顆粒對不同組別細胞及JEG-3細胞分泌的外泌體中miR-16的影響

2.5 養(yǎng)血安胎顆粒對JEG-3細胞、HUVECs中VEGF、p-VEGFR2的影響

研究發(fā)現(xiàn)，miR-16直接靶向VEGF，進而對VEGF進行負調(diào)節(jié)。本實驗結(jié)果顯示，在JEG-3細胞中，與空白對照+mimic NC組、養(yǎng)血安胎+mimic NC組比較，轉(zhuǎn)染miR-16 mimic后，JEG-3細胞中VEGF和p-VEGFR2蛋白表達均顯著降低(P<0.05)，表明過表達miR-16能夠抑制VEGF的表達。與空白對照+mimic NC組、空白對照+miR-16 mimic組比較，使用養(yǎng)血安胎干預后，VEGF和p-VEGFR2蛋白表達均顯著升高(P<0.05)，VEGF對血管生成發(fā)揮促進作用，表明養(yǎng)血安胎能夠增加VEGF表達以促進血管生成。見圖2、表5。

在HUVECs中，與空白對照+mimic NC組、養(yǎng)血安胎+mimic NC組比較，miR-16 mimic來源的外泌體干預后，HUVECs中VEGF和p-VEGFR2蛋白表達均顯著降低(P<0.05)；與空白對照+mimic NC組、空白對照+miR-16 mimic組比較，養(yǎng)血安胎來源的外泌體干預后，HUVECs中VEGF和p-VEGFR2蛋白表達均顯著升高(P<0.05)表明外泌體通過影響HUVECs中miR-16，進而影響血管生成。見圖2、表5。

注：A 空白對照+ mimic NC組; B 養(yǎng)血安胎+mimic NC組; C 養(yǎng)血安胎+miR-16 mimic組; D 養(yǎng)血安胎+miR-16 mimic組。

表5 養(yǎng)血安胎顆粒對不同組別JEG-3細胞和HUVECs中VEGF和p-VEGFR2的影響

3 討論

RSA在中醫(yī)學中屬“滑胎”范疇，治療的關(guān)鍵在于調(diào)補腎氣，活血化瘀。近年來，以補腎活血法治療RSA的方劑臨床療效確切，并被證明與改善血管生成相關(guān)[16-17]。養(yǎng)血安胎顆粒由菟絲子、續(xù)斷、山藥、益母草、白芍、當歸、石蓮子、桑寄生、廣木香組成，以補腎活血為治則，諸藥合用，以奏補腎健脾，養(yǎng)血安胎之功。其治療RSA可能也與改善血管生成相關(guān)[8]，但目前尚未有深入的研究報道。

VEGF是重要的血管生成的調(diào)控因子，對血管生成發(fā)揮促進作用，利于胚胎著床。在妊娠過程中，胎盤組織中能夠檢測到VEGF蛋白和mRNA的高表達，而RSA患者血清中VEGF表達則顯著降低[18]。VEGF也可通過介導VEGFR2發(fā)揮促血管生成作用，通過與VEGFR2結(jié)合，后者發(fā)生二聚化和自磷酸化，進而激活下游通路，促進細胞增殖與遷移，發(fā)揮促血管生成作用[19-21]。

miRNA能夠通過調(diào)節(jié)相關(guān)血管生成蛋白表達進而導致RSA發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，將miR-16注入妊娠小鼠胎盤，會導致小鼠胎盤異常，出現(xiàn)自然流產(chǎn)幾率明顯增加。此外，通過分離RSA患者的絨毛和蛻膜組織，也檢測到miR-16水平相比正常妊娠女性明顯增加，表明miR-16在RSA中發(fā)揮了重要的作用[10]。熒光素酶報告基因結(jié)果顯示，miR-16與VEGF的3-UTR互補，通過直接靶向VEGF來負調(diào)節(jié)VEGF表達，是血管生成的新型抑制劑[10]。本實驗中，為了探討?zhàn)B血安胎顆粒能否提高VEGF的表達，首先通過miR-16 mimic過表達了JEG-3細胞中miR-16水平，發(fā)現(xiàn)JEG-3細胞中VEGF蛋白表達顯著降低，也驗證了miR-16能夠抑制VEGF的表達。而養(yǎng)血安胎顆粒干預后，發(fā)現(xiàn)其能夠抑制miR-16的水平，進而增加VEGF的表達。CCK-8實驗也顯示，養(yǎng)血安胎顆粒能夠促進JEG-3細胞的增殖。以上結(jié)果表明，養(yǎng)血安胎顆粒具有增加VEGF表達，促進血管生成的作用。

血管生成是由蛻膜化子宮內(nèi)膜細胞作用于內(nèi)皮細胞以促進其增殖，遷移和侵襲產(chǎn)生的[22]。為了進一步研究養(yǎng)血安胎顆粒如何調(diào)節(jié)血管生成，課題組分離了JEG-3細胞中的外泌體。細胞外囊泡是由真核和原核細胞釋放到細胞外空間的各種具有膜結(jié)構(gòu)的囊泡結(jié)構(gòu)統(tǒng)稱，根據(jù)直徑大小可分為外泌體、微囊泡和凋亡小體[23]。外泌體的研究目前最為廣泛，其直徑約40～100 nm，具有雙層膜結(jié)構(gòu)，內(nèi)部包含多種蛋白、mRNA和miRNA等多種物質(zhì)。外泌體一旦釋放到細胞外空間，即可改變臨近細胞活性或進入體液向遠端發(fā)揮作用，通過攜帶來源細胞的蛋白質(zhì)、mRNA和miRNA至受體細胞，進而對受體細胞功能進行調(diào)控，發(fā)揮細胞通訊作用。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體能夠調(diào)節(jié)血管生成，并在胚胎植入中發(fā)揮重要的通訊作用。細胞的跨膜蛋白CD9、CD63、多泡體產(chǎn)生的蛋白Alix和TSG101以及轉(zhuǎn)膜和融合相關(guān)蛋白Flotillin 1可作為鑒定外泌體的標記物[24]。Calnexin是細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的標記蛋白，本實驗中，通過Western blot法對外泌體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標記蛋白進行測定，發(fā)現(xiàn)CD9、TSG101和Flotllin 1呈陽性表達，Calnexin蛋白呈陰性表達，表明分離得到的物質(zhì)為外泌體，且不含其他細胞成分，純度符合標準，能夠用于后續(xù)實驗。實驗結(jié)果表明，過表達JEG-3細胞中的miR-16后，其分泌的外泌體中miR-16也同樣升高；而養(yǎng)血安胎干預后，外泌體中的miR-16水平也得以降低。

將分離的外泌體進而與HUVECs共培養(yǎng)后可觀察到HUVECs的細胞增殖與JEG-3細胞趨勢一致，表明外泌體能夠?qū)κ荏w細胞進行調(diào)控，且受源細胞的影響。檢測與外泌體共培養(yǎng)后的HUVECs中miR-16水平和VEGF的蛋白表達，結(jié)果顯示miR-16水平和VEGF的蛋白表達也均與JEG-3細胞的趨勢相同，表明JEG-3分泌的外泌體進入HUVECs后，對HUVECs的活性進行了調(diào)節(jié)。養(yǎng)血安胎顆粒則通過外泌體增加了HUVECs的VEGF表達，進而發(fā)揮了促血管生成作用。

綜上，養(yǎng)血安胎顆粒抑制JEG-3細胞外泌體中miR-16水平，進一步抑制HUVECs中的miR-16水平，進而增加HUVECs中VEGF和VEGFR2的蛋白表達，促進血管生成。