孟祥玉，許 龍，宋曉梅

（佳木斯大學 生命科學學院，黑龍江 佳木斯 154007）

咖啡因濃度作為判斷茶葉質(zhì)量的主要因素，其對測試茶葉質(zhì)量具有至關(guān)重要的作用，尤其在信息化時代背景下，我國咖啡因濃度檢測方式趨于多樣化，如紫外分光光度法、薄層色譜法等，其中相色譜法憑借自身高效性、高靈敏度等特點，被經(jīng)常應(yīng)用在茶葉咖啡因檢測當中。而從茶葉中提出咖啡堿最常用的方法有二氯甲烷有機溶劑提取法和醇提法兩種，而醇提法是通過利用乙醇溶液和提取器來提取咖啡因，或利用熱度進行加熱，通常前面提取方式往往要耗費2-3小時，需要耗費較長時間，后者需要應(yīng)用大量二氯甲烷、丙酮、三氯甲烷等有機藥劑，這種藥劑會對人體與環(huán)境造成嚴重污染，且需要經(jīng)過水浴回收、蒸餾、抽濾等過程，不利于日常檢測。雖然我國政府部門利用合理隨便對樣品處理過程進行升級，將水作為溶劑的替代品，利用氧化鎂來檢測茶葉中單寧酸元素，但由于整個處理過程十分復(fù)雜，往往要利用沸水處理兩次，且要不定期搖晃，需要耗費大量時間，操作步驟十分繁瑣，提取率很低。針對以上這些問題，為了提高提取率、縮短操作步驟，對提取方式進行了優(yōu)化。用70%乙醇溶液做主體，對其進行加熱、超聲提取、微波萃取等，來提高提取效果，并對測試萊蕪干烘茶中咖啡堿的高效液相色譜法進行優(yōu)化，為后續(xù)研究打下堅實的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

LTB-800數(shù)控超聲波清洗機主要生產(chǎn)在濟寧魯通超聲電子設(shè)備公司；而TDZ5-WS離心機是出廠于湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司；SHA-C水浴恒溫振蕩器，江蘇金怡儀器科技有限公司；U3000高效液相色譜儀；日本島津公司UV-2700紫外可見分光光度計。同時咖啡因標準品≥99.8%，；無水乙醇、甲醇、乙腈、氧化鎂（分析純）、萊蕪干烘茶、測試用水為娃哈哈純凈水。

1.2 液相色譜條件

流動相：甲醇-水比例25∶75，V/V；檢測波長275mm；色譜柱acclaim120c18；柱長度4.6mmX150mm，直徑5um；流動相流速1ml/min；柱溫30°。

1.3 干烘差樣品處理

當工作人員將干烘茶放在低溫環(huán)境下進行干燥粉碎后，要將其放在孔徑為0.600mm的孔徑篩內(nèi)，將所提煉出來的氧化鎂與茶葉樣品放入在微波萃取管和三角瓶當中，然后在三角瓶中添加不同劑量的乙醇溶液，再將這些溶液進行攪拌，等到所有溶液全部攪拌均勻后，可采用加熱的方式進行提取，或者可利用超聲提取、微波萃取等方式來提取茶葉中蘊含的咖啡堿成分。將會得到大量的提取液，將全部提取液放置在瓶中，再用純凈水進行定容，經(jīng)過有機相針式過濾器后在進行測試。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的研究分析

2.1.1 檢測器波長確定。在正常情況下，工作人員根據(jù)行業(yè)要求，將咖啡堿溶液利用紫外分光光度計來進行掃描，再合理利用掃描數(shù)據(jù)來制作吸收曲線，幫助工作人員發(fā)現(xiàn)咖啡因的最長吸收波長（如圖1所示）。從吸收曲線圖可見，在咖啡因280mm左右，所吸收波漲幅達到最高點。由于在最大吸收波長條件下檢測，所具有的雜質(zhì)最少，讓其具有較好的穩(wěn)定性與靈敏性，從而將275mm作為測定波長。

圖1 咖啡堿標準品溶液吸收曲線

2.1.2 流動相組成及比例確定。經(jīng)過有關(guān)人員研究發(fā)現(xiàn)，乙晴和甲醇兩種物質(zhì)與不同體積水相融合，當其逐漸流動時，很容易給雜質(zhì)峰和目標峰帶來不同程度的影響，經(jīng)過有關(guān)人員分析發(fā)現(xiàn)，在有機環(huán)境下雜質(zhì)峰和目標峰分離狀態(tài)能達到預(yù)期標準，且峰形能滿足實際需求。但由于在研究過程中發(fā)現(xiàn)甲醇毒性較低，研究人員可將甲醇和水進行相互結(jié)合，形成全新的流動物質(zhì)來進行流動。將甲醇與水根據(jù)不同體積比例對干烘茶提取液進行測試，這時甲醇與水的體積分為別10:90/20:80/25:75，而柱溫為30°，紫外波長為275mm，經(jīng)過實驗發(fā)現(xiàn)，當兩者體積比達到第一比例時，咖啡堿提取時間不會超過18min；當體積比在達到第二階段時，咖啡堿提取時間下降到7min；當體積比達到第三階段后，咖啡堿提取時間降低到5min內(nèi)，并且體積比達到第三階段后雜質(zhì)峰和目標峰呈現(xiàn)分離狀態(tài)，具有相同比例的色譜峰形狀，給甲醇檢測效率帶來不同程度的影響。

2.1.3 確定色譜柱溫度。經(jīng)過大量實驗證明，當色譜柱溫度控制在40°—52°時，要嚴格遵循色譜條件進行檢測，每隔5°要測試一次咖啡堿標準溶液。經(jīng)過研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在一定溫度中柱溫并不會給咖啡堿保留時間、色譜峰峰形帶來嚴重；隨著溫度不斷升高，很容易給會色譜柱壽命帶來嚴重限制，甚至會有效降低各組分離度，經(jīng)過專業(yè)人員實驗發(fā)現(xiàn)柱溫可控制在30°。

2.2 咖啡堿提取方法的優(yōu)化選擇

在信息化時代背景下，茶葉咖啡堿提取方式是根據(jù)提取溶劑不同使用不同的提取方法，如二氯甲烷提取法、醇提法、水提法等。按照提取方式不同可分為微波萃取、加熱浸提、超聲提取等方式。經(jīng)過專業(yè)研究發(fā)現(xiàn)，利用乙醇溶液、水、二氯甲烷作為提取劑效果更好，但值得注意的是，要選擇不同體積分數(shù)的乙醇溶液作為提取溶劑，并將直接加熱浸提優(yōu)化為加熱振蕩提取，將三種不同的提取法進行對比，選擇一種性價比最高的提取方法。

2.2.1 加熱振蕩提取。加熱振蕩提取是現(xiàn)代應(yīng)用范圍較廣的提取方式，其具有簡單易操作特點。取0.5g萊蕪干烘茶樣品和5份氧化鎂，將其放在5只100mL三角瓶當中，分別在這個瓶子內(nèi)加入40ml、50ml、60ml、70ml、80ml、90ml的乙醇溶液，將其放入到恒溫的振蕩器中，由于在常規(guī)條件下的乙醇溶液沸點較低，為避免提取過程當中乙醇沸騰降低其功效，在提取時要控制溫度，不宜過高，溫度控制在80°左右。

2.2.2 超聲提取。超聲提取是利用超聲波機械獨特的性能，如粉碎功能、空化功能，提高提取速度，將其向溶劑四周拓展，能有效提高提取率。嚴格遵循行業(yè)標準進行稱取重量，在干烘茶樣品和氧化鎂中添加乙醇溶液，在功率為200w，78°情況下，利用超聲波來提取60min。

2.2.3 微波萃取。微波萃取技術(shù)是一種新型的提取技術(shù)，其具有試劑用量少、萃取時間短、節(jié)能高效等特點，已被普及到生物樣品分析、食品分析等方面。在國家政策當中有明確表明，在茶葉提取實驗當中，我們應(yīng)該通過化學實踐，自己準備實驗藥品、實驗裝置，親自實驗，才能明白干烘茶藝之間的反應(yīng)，明白提取法在干烘茶里面的重要意義，讓我們在實驗當中學到實際知識、提升我們的動手能力。這種萃取方法是以CEM微波化學技術(shù)作為基礎(chǔ)，再結(jié)合其他文獻進行優(yōu)化，稱取0.5g粉碎干烘茶樣品和5份1g氧化鎂，分別放置在5個萃取管內(nèi)，分別在這個瓶子內(nèi)加入40ml、50ml、60ml、70ml、80ml、90ml的乙醇溶液，研究人員要嚴格根據(jù)方法1進行萃取。通過三種不同方法進行提取液將所有上清液用純凈水定容在50ml，經(jīng)過有機相針式過濾器進行過濾，從而準確判斷檢測條件來確保提取液的順利進行，如圖4所示。

表1 微波萃取方法

從圖2可見，提取方法和乙醇體積分數(shù)對咖啡因提取效果存在不同程度的影響。當茶葉樣品基本數(shù)據(jù)相同時，乙醇體積分數(shù)在70%，研究人員可通過微波萃取方式來提高咖啡堿的質(zhì)量；當乙醇體積為80%時，依舊利用微波萃法所得到的咖啡堿質(zhì)量最高；當乙醇體積小于70%時，加熱振蕩法所產(chǎn)生的咖啡因質(zhì)量最低。從以上數(shù)據(jù)可知，當乙醇溶液體積在70%時，微波萃取方法效果最好，其具有操作簡單、用時最短的特征。

圖2 提取方法及乙醇體積分數(shù)對咖啡堿提取效果的影響

2.3 咖啡因線性和方法檢出限

將咖啡堿標準儲備液制作成為六種不同質(zhì)量濃度溶液，要根據(jù)測試條件來做出相應(yīng)測試，經(jīng)過統(tǒng)計測試結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在這個范圍內(nèi)峰面積線性和質(zhì)量濃度具有直接性關(guān)系（如圖3所示）。曲線方程如表2所示。

如圖3 咖啡因校正曲線圖

如表2 校正曲線和檢出限

2.4 方法精密度實驗

在進行實驗裝置創(chuàng)新時，要以安全為主，保證實驗時實驗裝置的安全性、穩(wěn)定性，嚴格執(zhí)行實驗規(guī)范。比如在改良設(shè)備裝置時，安裝順序應(yīng)該是由左到右、由下到上，依次操作，實驗的操作過程應(yīng)該是按照設(shè)備——檢查設(shè)備裝置的密閉性——添加實驗藥品——進行實際操作。節(jié)約型原則在改進設(shè)計時非常重要，需要明白實驗的要求，可以在實驗課當中學到實際知識、提升動手能力，在實驗當中盡可能的少用儀器以及藥劑，簡化實驗步驟。比如在創(chuàng)新干烘茶裝置時，可以采用取代的方式，避免實驗過程中藥劑的浪費（如表3所示）。

表3 咖啡因精密度實驗結(jié)果

經(jīng)過以上實驗結(jié)果分析，在經(jīng)過六次測量后，其相對標準偏差大概為0.46%，干烘茶樣品當中的咖啡因平均值為23.85mg/g，通過數(shù)據(jù)我們不難看出，這種方法精密度較高，能應(yīng)用于日常檢測當中。

2.5 方法加標回收率的測定

稱取茶葉樣品在校正曲線范圍內(nèi)，加入不同量的咖啡因，并利用合理方式來進行測定（如表4所示）。

表4 加標回收試驗結(jié)果

3 結(jié)論

通過對不同提取咖啡堿方法進行對比發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過離心過濾后能直接進行上機測試，與加熱振蕩提取相比，這種提取方式效率更高、更簡單、耗時較少；與其他測試茶葉中咖啡堿的高效液相色譜法相比，這種方式的回收率更高、分析時間較少，檢出限較高。符合政府部門檢查要求，適合應(yīng)用于萊蕪干烘茶中，對測試咖啡因含量具有非常重要的作用。