史恒瑞，董 平

(1.杭州市丁橋醫(yī)院 口腔科，浙江 杭州 310022；2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴州 遵義 563000)

頜面部位于身體表面，遭遇車禍、外力擊打后易受到損傷，影響咀嚼等生理功能，如有面部外形改變亦會導(dǎo)致心理創(chuàng)傷。隨著研究的進(jìn)展，組織工程為修復(fù)頜面部組織缺損提供了新的選擇。人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(hAMCs)存在于孕婦產(chǎn)后分娩出的胎盤中，可以分化成來自三個(gè)胚層的所有細(xì)胞，這些細(xì)胞可用來修復(fù)頜面部的各類組織缺損。同時(shí)，hAMCs具有較強(qiáng)的增殖能力，且較易獲取，并具有低免疫原性，異體移植不易引起免疫排斥反應(yīng)。通過以上特點(diǎn)可預(yù)見，該細(xì)胞在組織工程修復(fù)與重建及細(xì)胞替代治療等再生醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景。但hAMCs也存在著一些缺陷，尤其在體外培養(yǎng)時(shí)，生長速度緩慢、傳代代數(shù)有限。所以，如何能高效地?cái)U(kuò)增人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞就顯得尤為重要。

現(xiàn)代藥理學(xué)證實(shí)丹參有強(qiáng)心、擴(kuò)血管、抗血栓形成、改善微循環(huán)、促進(jìn)組織再生與修復(fù)等良好的作用，其有效成分如丹酚酸、丹參酮都具有抗氧化、降低生物體內(nèi)氧自由基水平的藥理作用。已有多篇文獻(xiàn)證實(shí)，在體外培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞時(shí)給予其類似于體內(nèi)的低氧環(huán)境后，間充質(zhì)干細(xì)胞會保持較原始的狀態(tài)，增殖能力則會大大增強(qiáng)?；谏鲜龅难芯砍晒坝^點(diǎn)，本研究觀察丹參是否具有促進(jìn)hAMCs增殖的能力，為將來更好地將hAMCs應(yīng)用于組織工程及再生醫(yī)學(xué)中提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 人羊膜來源于遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，經(jīng)倫理審核、產(chǎn)婦知情同意后，在無菌的條件下從健康足月剖宮產(chǎn)的產(chǎn)婦分娩的胎盤中采集羊膜，將采集到的羊膜置于裝有潔凈的PBS溶液的玻瓶中，并在2 h內(nèi)進(jìn)入實(shí)驗(yàn)的流程。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 胰蛋白酶、胎牛血清、L-DMEM，均來自Gibco(USA)；膠原酶Ⅱ、L-谷氨酰胺、鼠抗人波形蛋白抗體，購自Sigma(USA)；CD45-FITC、CD29-FITC、CD34-FITC、CD166-PE、CD73-PE、CD44-PE，購自BD(USA)；細(xì)胞周期檢測試劑盒購自南京凱基(中國)；丹參凍干粉購自哈藥二廠(中國)；SDS-PAGE電泳液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、Western轉(zhuǎn)膜液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、細(xì)胞裂解液，均購自碧云天(中國)。

1.3 人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 無菌條件下取孕期為38～40周剖宮產(chǎn)或自然順產(chǎn)后的人胎盤，機(jī)械剝離胎盤羊膜組織，參照相關(guān)研究分離獲得人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，當(dāng)原代細(xì)胞生長所占的面積占到培養(yǎng)瓶底壁的80% 時(shí)傳代，第3代時(shí)進(jìn)行人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定。

1.4 人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定

1.4.1 免疫表型鑒定 取第3代細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，至少選取1×10個(gè)細(xì)胞，在暗室中分別加入5 μL 熒光標(biāo)記單抗至不同的上機(jī)管中，同型對照為相應(yīng)熒光標(biāo)記的小鼠IgG-FITC、IgG-PE，每管加入已制備好的細(xì)胞懸液100 μL至上述上機(jī)管，室溫下避光孵育30 min，PBS洗滌后重懸細(xì)胞，加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。

1.4.2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測 取第3代細(xì)胞爬片兩張，按照試劑盒說明操作，將細(xì)胞爬片分為實(shí)驗(yàn)組及對照組，實(shí)驗(yàn)組滴加波形蛋白抗體室溫孵1 h，對照組滴加PBS液代替一抗，兩組的孔內(nèi)均滴加鼠兔通用型二抗，經(jīng)室溫下孵育、DAB顯色、蘇木素復(fù)染等操作后待玻片自然干燥置于顯微鏡下觀察并拍照。

1.4.3 Western Blot檢測波形蛋白表達(dá) 以上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞作為對比，取第3代人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞加入蛋白裂解液抽取細(xì)胞總蛋白，將定量好的總蛋白按體積比4∶1加入上樣緩沖液，煮沸5 min，置于-20 ℃冰箱內(nèi)。取蛋白進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(8%分離膠)，加入5 μL蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物以確定所檢測蛋白帶的位置。電泳的起始電壓為80 V，待樣品至分離膠時(shí)提高電壓至100 V，指示劑至凝膠底部時(shí)停止電泳；再于電轉(zhuǎn)儀上在330 mA、90 min下將蛋白樣品濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上。用含5%脫脂牛奶PBST封閉1 h，分別加入稀釋后的一抗，4 ℃置于搖床過夜，室溫下孵育1∶2 000的二抗1.5 h，洗膜3次，用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯影，拍照后進(jìn)行灰度值分析。

1.5 MTT法檢測細(xì)胞增殖情況 取第4代細(xì)胞沉淀，計(jì)數(shù)后平分為A、B、C三組，分別加入含0.05%丹參的全培養(yǎng)基、含0.005%丹參的全培養(yǎng)基、全培養(yǎng)基，將細(xì)胞種于96孔板中并設(shè)置空白對照D組，每48 h換液1次，測試時(shí)加入預(yù)先配制好的MTT，之后在CO培養(yǎng)箱中孵育4 h，無菌條件吸除孔內(nèi)的液體，加入100 μL的DMSO，置于酶標(biāo)儀中再測定每組的OD值。所得數(shù)據(jù)為藥物干預(yù)細(xì)胞生長后第1天的OD值，之后每24 h測定一次并繪制7天內(nèi)的生長曲線。

1.6 細(xì)胞周期測定 取第4代細(xì)胞沉淀，按MTT法檢測細(xì)胞增殖情況時(shí)的方法進(jìn)行細(xì)胞分組并種瓶，每48 h換液，待各組細(xì)胞在培養(yǎng)瓶內(nèi)長滿后，制取細(xì)胞懸液并保證懸液中所含有的細(xì)胞大于1×10，加入同體積的阻止培養(yǎng)基，在4 ℃、1 000 r/min下離心5 min，倒掉上清，PBS洗滌細(xì)胞，冰乙醇固定細(xì)胞，PBS洗去固定液后，每組加入100 μL的牛胰核糖核酸酶，37 ℃水浴30 min，400 μL的碘化丙啶染色混勻，4 ℃避光孵育后，流式細(xì)胞儀采集各組細(xì)胞檢測，Cellqust軟件分析各組細(xì)胞周期計(jì)算增殖指數(shù)(proliferation index, PI)，PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%。

1.7 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞免疫表型鑒定 獲取第5代人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞，加入含0.05%丹參的全培養(yǎng)基，待細(xì)胞長滿后，按1.4.1方法檢測該組細(xì)胞CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD166的表達(dá)情況，并與鑒定細(xì)胞時(shí)的結(jié)果做對比。

2 結(jié)果

2.1 人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)及鑒定 原代鏡下可見細(xì)胞貼壁生長，呈長條形、梭形或角形。隨著傳代及生長，細(xì)胞形態(tài)呈長梭形更為明顯并呈漩渦狀生長(封三圖1)。第3代hAMCs高表達(dá)：CD44、CD73、CD29、CD166；低表達(dá)：CD34、CD45(表1)。所制取的細(xì)胞波形蛋白陽性表達(dá)，細(xì)胞胞漿呈棕褐色(封三圖2A)，空白對照組則未見明顯表達(dá)(封三圖2B)。Western Blot法顯示，羊膜中所提取的細(xì)胞高表達(dá)波形蛋白(Vimentin)、低表達(dá)E鈣黏連蛋白(封三圖3)，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05)。綜合以上結(jié)果可以說明所獲取的細(xì)胞為人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞。

2.2 不同濃度丹參促增殖的影響 各組細(xì)胞生長曲線顯示(圖1)，在第4～6天時(shí)，各組細(xì)胞處于對數(shù)生長期，A、B兩組OD值高于C組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05)。計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間(doubling time，Td)：Td=t×lg2/(lgNt-lgN)。A、B、C組細(xì)胞倍增時(shí)間分別為72.24 h、84 h、99.12 h，A、B兩組低于C組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05)。細(xì)胞周期檢測結(jié)果顯示，A、B兩組細(xì)胞的G2/M、S期比例高于C組，G0/G1期比例低于C組，A、B、C組PI分別為(60.75±0.68)%、(15.7±0.95)%、(6.64±0.96)%，A、B組高于常規(guī)對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05)，見圖2。實(shí)驗(yàn)組第5代細(xì)胞流式術(shù)結(jié)果表明細(xì)胞高表達(dá)：CD44、CD73、CD29、CD166，低表達(dá)：CD34、CD45。將該結(jié)果與常規(guī)培養(yǎng)基組的細(xì)胞流式結(jié)果做對比，結(jié)果顯示：除CD166外，其余CD分子間的表達(dá)率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(>0.05)，見表1。

圖1 各組細(xì)胞生長曲線Figure 1 The cell growth curve

圖2 各組細(xì)胞的細(xì)胞周期變化對比Figure 2 The contrast of each cycle changes

表1 流式細(xì)胞術(shù)分析及對比

3 討論

人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞自發(fā)現(xiàn)以來，因取材方便、來源廣泛且產(chǎn)量豐富、增殖能力較骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞強(qiáng)、免疫原性低、多向分化潛能、幾乎不存在倫理學(xué)爭議等特點(diǎn)，已經(jīng)展現(xiàn)出較其他干細(xì)胞巨大的優(yōu)勢，這些優(yōu)勢均提示其有可能成為組織工程學(xué)及細(xì)胞替代治療中理想的種子細(xì)胞。但是，間充質(zhì)干細(xì)胞在體外擴(kuò)增時(shí)，易發(fā)生增殖數(shù)量少、細(xì)胞衰亡的現(xiàn)象。為了延緩間充質(zhì)干細(xì)胞的衰老并保持其較強(qiáng)的增殖能力，人們做了大量的研究。有文獻(xiàn)報(bào)道：將β-catenin-綠色熒光蛋白重組腺病毒擴(kuò)增后，轉(zhuǎn)染人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞可提高其增殖能力，但此法費(fèi)用較高，且步驟較繁瑣，不利于大規(guī)模應(yīng)用。除此之外，有學(xué)者將堿性成纖維細(xì)胞生長因子加入到培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)該法可促進(jìn)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖。也有文獻(xiàn)表明該法雖可促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，但會導(dǎo)致細(xì)胞向成纖維細(xì)胞分化。因此，尋找一種費(fèi)用低且效果好的方法來促進(jìn)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞增殖有研究意義。

氧化應(yīng)激是指生物、細(xì)胞體內(nèi)出現(xiàn)大量的活性氧(ROS)、氧自由基團(tuán)，過量的氧自由基團(tuán)可引起組織、細(xì)胞和機(jī)體不同程度的受損，這種損害主要是通過NADPH氧化酶途徑和線粒體電子傳遞鏈途徑造成的?；谏鲜隼碚摚灰杉?xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中有足夠的抗氧化劑，清除不利于細(xì)胞生長的氧自由基團(tuán)，從而維持氧化還原平衡就可以維持其較原始的特性，增加其存活概率。針對該設(shè)想，目前有研究證實(shí)，在體外培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞時(shí)將其置于低氧的環(huán)境中能減少細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基的生成，維持其較強(qiáng)的活性及較為原始的狀態(tài)。另有文獻(xiàn)表明：給予細(xì)胞抗氧化劑后，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以維持較高的增殖能力及多向分化潛能。

有文獻(xiàn)表明丹參所含的丹參酮及丹酚酸類成分具有抗氧化、降低生物體內(nèi)氧自由基水平、抗氧化應(yīng)激反應(yīng)等藥理作用，丹參作為傳統(tǒng)中藥材，其產(chǎn)量大且價(jià)格低。所以，本研究試驗(yàn)性地在常規(guī)培養(yǎng)基中加入適量的丹參，觀察細(xì)胞生長狀況，結(jié)果顯示，所獲取的第三代細(xì)胞高表達(dá)波形蛋白及CD44、CD73、CD29、CD166，低表達(dá)CD34、CD45，這個(gè)結(jié)果符合國際細(xì)胞治理協(xié)會設(shè)立的人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞表型特征的標(biāo)準(zhǔn)。本研究結(jié)果說明培養(yǎng)基中加入適量的丹參對人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用，可以干預(yù)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞周期變化，這個(gè)變化至少在短期內(nèi)是存在的。然而由于各種因素限制，本實(shí)驗(yàn)只是選擇加入0.05%和0.005%的丹參于培養(yǎng)基中，未能嘗試更多的加藥濃度，所以本實(shí)驗(yàn)只能說明0.005%～0.05%這個(gè)濃度范圍對增殖有促進(jìn)作用，未能完全探明該藥物的有效濃度范圍，這需要后續(xù)大量的實(shí)驗(yàn)去探明。除此之外，經(jīng)過藥物促增殖后的細(xì)胞多向分化能力、關(guān)鍵基因的表達(dá)及免疫源性有無改變等問題，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。