邵建斌，方因，文霆，楊梅蘭

1.廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科福建廈門 361000；

2.廈門市思明區(qū)開元街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心健教科福建廈門 361000

甲狀腺癌（thyroid cancer）是一種常見的內(nèi)分泌相關(guān)腫瘤，研究顯示，其發(fā)病率有逐漸上升趨勢(shì)，且發(fā)病年齡越來越年輕化［1-2］。目前研究證明，甲狀腺癌可按其病理分類，主要分為4個(gè)類型：乳頭狀甲狀腺癌、濾泡狀甲狀腺癌、髓樣甲狀腺癌和未分化甲狀腺癌［3-4］。目前的治療方式包括內(nèi)分泌治療、化療、基因治療以及手術(shù)治療，但手術(shù)后副作用較大，患者通常需終生服用甲狀腺素片，因此，基因治療成為目前較為關(guān)注的治療方法之一［5-7］。miR-520c-3p被認(rèn)為是腫瘤生長的負(fù)調(diào)節(jié)因子，與腫瘤的增殖、運(yùn)動(dòng)凋亡密切相關(guān)［8-9］。LEI等［10］研究表明，miR-520c-3p可抑制肝癌細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)其凋亡。張靈敏等［11］研究表明，miR-520c-3p可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)特征。由此推測(cè)，miR-520c-3p對(duì)乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、運(yùn)動(dòng)和血管再生也有一定影響。

本研究旨在探討miR-520c-3p介導(dǎo)的血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）對(duì)乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)和血管再生的影響及其機(jī)制，為甲狀腺癌的治療奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞及質(zhì)粒 乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞B-CPAP由中科院協(xié)和細(xì)胞庫提供；miR-520c-3p mimic、pcDNA-VEGFA、VEGFA野生及突變質(zhì)粒（Luc-VEGFA 3′UTR wt和Luc-VEGFA 3′UTR mut）由上海禾午生物科技有限公司提供。

1.2主要試劑及儀器 雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒、HRP標(biāo)記的山羊抗兔/鼠抗體和ECL發(fā)光劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔源VEGFA、Ki67、PCNA、E-cadherin抗體、Vimentin抗體及鼠源GAPDH抗體購自美國Abcam公司；RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Hyelone公司；CCK-8檢測(cè)試劑盒購自南京萊富賽生物科技有限公司；Transwell小室購自美國Corning Coseter公司；蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3細(xì)胞培養(yǎng) 用含100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)B-CPAP細(xì)胞，待細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)生長期時(shí)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組處理 將B-CPAP細(xì)胞分為Control、NCmimic、miR-520c-3p mimic、pcDNA vector、VEGFA和mimic+VEGFA組，其中Control組不做任何處理，NC mimic組轉(zhuǎn)染mimic陰性對(duì)照物，miR-520c-3p mimic組單獨(dú)轉(zhuǎn)染miR-520c-3p mimic，pcDNA vector組轉(zhuǎn)染pcDNA vector，VEGFA組轉(zhuǎn)染pcDNA-VEGFA，mimic+VEGFA組聯(lián)合轉(zhuǎn)染miR-520c-3p mimic和pcDNA-VEGFA。該部分試驗(yàn)由上?；鶢栴D生物科技有限公司完成。

1.5靶向關(guān)系的驗(yàn)證 利用生物信息學(xué)軟件Target Scan 7.2預(yù)測(cè)VEGFA是否為miR-520c-3p的結(jié)合片段。將VEGFA野生及突變質(zhì)粒（Luc-VEGFA 3′UTRwt和Luc-VEGFA 3′UTRmut）分別與NCmimic、miR-520c-3p mimic轉(zhuǎn)染B-CPAP細(xì)胞，使用雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒檢測(cè)各組的熒光素酶活性。

1.6相關(guān)基因表達(dá)水平檢測(cè) 采用RT-PCR法。提取各組細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用2-ΔΔCt法計(jì)算RNA的相對(duì)表達(dá)量，以GADPH為內(nèi)參。miR-520c-3p基因上游引物：5′-ACACTCCAGCTGGGAAAGUGCTTCCTTT-3′，下游引 物：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCACCCTCTA-3′［12］；GAPDH基因上游引物：5′-GGTATCGTGGAAGGACTC-3′，下游引物：5′-GTAGAGGCAGGGATGATG-3′；VEGFA基因上游引物：5′-VEGFAGACGGACAGACAGACAGACAC-3′，下游引物：5′-CCGCCTCGGCTTGTCACAT-3′［13］。引物由武漢源深生物科技有限公司合成。

1.7相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot法。取各組B-CPAP細(xì)胞，4℃恒溫條件下12 000×g離心10 min，加入裂解液裂解后，加入Loading Buffer緩沖液，測(cè)定蛋白濃度。經(jīng)10%SDS-PAGE分離總蛋白，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，置于5%脫脂牛奶中室溫封閉2 h；分別加入兔源VEGFA（1∶1 000稀釋）、Ki67（1∶1 500稀釋）、PCNA（1∶1 000稀釋）、E-cadherin（1∶2 000稀釋）、Vimentin（1∶1 000稀釋）抗體及鼠源GAPDH抗體（1∶1 000稀釋），4℃孵育過夜；TBS洗膜5次，8 min/次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔/鼠抗體（1∶2 000稀釋），室溫孵育1 h；TBST洗膜5次，8 min/次，滴加ECL發(fā)光劑，暗室中發(fā)光顯影。以GADPH為內(nèi)參，目的蛋白條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值為相對(duì)蛋白表達(dá)水平。

1.8細(xì)胞增殖能力的檢測(cè) 采用CCK-8法。取各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，接種于96孔板中，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，分別于1、2、3、4 d進(jìn)行CCK-8檢測(cè)，按照試劑盒說明書操作，酶標(biāo)儀測(cè)波長為570 nm。

1.9細(xì)胞侵襲能力的檢測(cè) 采用Transwell小室試驗(yàn)。用移液器在PVPF聚碳酸濾膜外表面均勻涂抹纖粘連蛋白，膜內(nèi)側(cè)涂matrigel。取各組細(xì)胞，按2×105個(gè)/孔接種于Transwell小室，37℃，5%CO2培養(yǎng)4 h；去除小室中膜內(nèi)側(cè)表面多余的細(xì)胞，用多聚甲醛固定，于顯微鏡400倍視野下隨機(jī)選取10個(gè)視野，雙盲計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)膜下表面的細(xì)胞數(shù)平均值，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.10微管結(jié)節(jié)數(shù)檢測(cè) 采用微管形成試驗(yàn)。取各組細(xì)胞，按1×105個(gè)/mL接種于鋪Matrigel基質(zhì)膠的24孔板上，37℃，5%CO2培養(yǎng)，每隔4 h在顯微鏡下觀察B-CPAP細(xì)胞的微管樣結(jié)構(gòu)，繼續(xù)培養(yǎng)16 h后，計(jì)數(shù)細(xì)胞微管形成數(shù)目。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，利用Graph Pad Prism 5軟件作圖，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1靶向關(guān)系的驗(yàn)證 生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，miR-520c-3p與VEGFA 3′UTR192-198位點(diǎn)處存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖1。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示，各組細(xì)胞熒光素酶相對(duì)活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=70.374，P＜0.001），其中與Luc-VEGFA 3′UTR wt+NC mimic組比較，共轉(zhuǎn)染Luc-VEGFA 3′UTR wt與miR-520c-3p mimic組細(xì)胞中熒光素酶相對(duì)活性明顯降低（t=16.706，P＜0.001），見圖2。各組細(xì)胞miR-520c-3p表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=186.788，P＜0.001），其中與NC mimic組比較，miR-520c-3p mimic組miR-520c-3p表達(dá)水平明顯升高（t=23.676，P＜0.001），見圖3。

圖2 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)各組B-CPAP細(xì)胞的熒光素酶活性Fig.2 Determination of luciferase activities of B-CPAPcells in various groups by dual luciferase reporter gene assay

注：紅色處表示結(jié)合位點(diǎn)。

圖3 靶向關(guān)系驗(yàn)證試驗(yàn)各組B-CPAP細(xì)胞中miR-520c-3p的表達(dá)水平Fig.3 Expression levels of miR-520c-3p in B-CPAP cells of various groups in verification for targeting relationship

2.2各組B-CP A P細(xì)胞miR-520c-3p及VE GFA表達(dá)情況

2.2.1基因表達(dá)水平 各組細(xì)胞miR-520c-3p的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=422.931，P＜0.001），與Control組比較，miR-520c-3p mimic組miR-520c-3p表達(dá)水平明顯升高（t=40.989，P＜0.001），VEGFA組miR-520c-3p表達(dá)水平明顯降低（t=9.624，P＜0.001）；與VEGFA組比較，mimic+VEGFA組miR-520c-3p表達(dá)水平明顯升高（t=12.574，P＜0.001），見圖4。各組細(xì)胞VEGFAmRNA的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=197.540和345.011，P均＜0.001），其中與pcDNA vector組比較，VEGFA組VEGFAmRNA的表達(dá)水平明顯升高（t=24.382，P＜0.001）；與Control組比較，miR-520c-3p mimic組VEGFAmRNA的表達(dá)水平明顯降低（t=7.815，P＜0.001）；與VEGFA組比較，mimic+VEGFA組VEGFAmRNA的表達(dá)水平明顯降低（t=32.117，P＜0.001）。見圖5。

圖4 靶向關(guān)系驗(yàn)證試驗(yàn)各組B-CPAP細(xì)胞中miR-520c-3p的表達(dá)水平Fig.4 Expression levels of miR-520c-3p in B-CPAP cells of various groups in verification for targeting relationship

圖5 各組B-CPAP細(xì)胞中VEGFA mRNA的表達(dá)水平Fig.5 Expression levels of VEGFA mRNA in cells of various groups

2.2.2蛋白表達(dá)水平 各組細(xì)胞VEGFA蛋白表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=55.265，P＜0.001），與Control組比較，miR-520c-3p mimic組VEGFA蛋白表達(dá)水平明顯降低（t=3.894，P=0.014），VEGFA組VEGFA蛋白表達(dá)水平明顯升高（t=13.274，P＜0.001）；與VEGFA組比較，mimic+VEGFA組VEGFA蛋白表達(dá)水平明顯降低（t=12.389，P＜0.001）。見圖6和圖7。

圖6 Western blot分析各組B-CPAP細(xì)胞中VEGFA蛋白的表達(dá)Fig.6 Western blotting of VEGFA expressions in B-CPAP cells of various groups

圖7 各組B-CPAP細(xì)胞中VEGFA蛋白的表達(dá)水平Fig.7 Expression levels of VEGFA protein in B-CPAPcells of various groups

2.3miR-520c-3p介導(dǎo)VE GFA對(duì)B-CP A P細(xì)胞增殖能力的影響

2.3.1細(xì)胞增殖活性 各組細(xì)胞培養(yǎng)4 d時(shí)的增殖活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=43.561，P＜0.001），與Control組比較，miR-520c-3p mimic組細(xì)胞增殖活性明顯降低（t=5.379，P=0.002），VEGFA組細(xì)胞增殖活性明顯升高（t=10.489，P＜0.001）；與VEGFA組比較，mimic+VEGFA組細(xì)胞增殖活性明顯降低（t=9.548，P＜0.001）。見圖8。

圖8 各組B-CPAP細(xì)胞的增殖活性Fig.8 Proliferation activities of B-CPAP cells in various groups

2.3.2增殖相關(guān)蛋白的表達(dá) 各組細(xì)胞Ki67和PCNA蛋白的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別為147.127和82.599，P＜0.001），與Control組比較，miR-520c-3p mimic組Ki67和PCNA蛋白的表達(dá)水平均明顯降低（t分別為5.914和5.506，P分別為＜0.001和0.001），VEGFA組Ki67和PCNA蛋白的表達(dá)水平均明顯升高（t分別為22.179和15.733，P均＜0.001）；與VEGFA組比較，mimic+VEGFA組Ki67和PCNA蛋白的表達(dá)水平均明顯降低（t分別為18.647和14.859，P均＜0.001）。見圖9和圖10。

圖9 Western blot分析各組B-CPAP細(xì)胞中增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.9 Western blotting of expressions of proliferationassociated proteins in B-CPAPcells of various groups

圖10 各組B-CPAP細(xì)胞中增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)水平Fig.10 Expression levels of proliferation-associated proteins in B-CPAPcells of various groups

2.4miR-520c-3p介導(dǎo)VE GFA對(duì)B-CP A P細(xì)胞侵襲能力的影響

2.4.1細(xì)胞侵襲能力 各組細(xì)胞侵襲數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=45.865，P＜0.001），與Control組比較，miR-520c-3p mimic組細(xì)胞侵襲數(shù)明顯降低（t=8.606，P＜0.001），VEGFA組細(xì)胞侵襲數(shù)明顯升高（t=7.934，P＜0.001）；與VEGFA組比較，mimic+VEGFA組細(xì)胞侵襲數(shù)明顯降低（t=9.144，P＜0.001）。見圖11和圖12。

圖11 各組B-CPAP細(xì)胞侵襲能力的顯微鏡觀察（×400）Fig.11 Microscopy of invasion abilities of B-CPAP cells in various groups（×400）

圖12 各組B-CPAP細(xì)胞的侵襲能力Fig.12 Invasion abilities of B-CPAPcells in various groups

2.4.2侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá) 各組細(xì)胞E-cadherin和Vimentin蛋白的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別為62.296和51.111，P均＜0.001），與Control組比較，miR-520c-3p mimic組E-cadherin蛋白的表達(dá)水平明顯升高，Vimentin蛋白的表達(dá)水平明顯降低（t分別為14.935和3.770，P分別為＜0.001和0.043），VEGFA組E-cadherin蛋白的表達(dá)水平明顯降低，Vimentin蛋白的表達(dá)水平明顯升高（t分別為5.384和12.147，P均＜0.001）；與VEGFA組比較，mimic+VEGFA組E-cadherin蛋白的表達(dá)水平明顯升高，Vimentin蛋白的表達(dá)水平明顯降低（t分別為3.849和13.822，P分別為0.038和＜0.001）。見圖13和圖14。

圖13 Western blot分析各組B-CPAP細(xì)胞中侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.13 Western blotting of invasion-associated proteins in B-CPAPcells of various groups

2.5miR-520c-3p介導(dǎo)VE GFA對(duì)B-CP A P細(xì)胞微管形成的影響 各組細(xì)胞微管結(jié)節(jié)數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=45.412，P＜0.001），與Control組比較，miR-520c-3p mimic組細(xì)胞微管結(jié)節(jié)數(shù)明顯降低（t=6.336，P＜0.001），VEGFA組細(xì)胞微管結(jié)節(jié)數(shù)明顯升高（t=10.031，P＜0.001）；與VEGFA組比較，mimic+VEGFA組細(xì)胞微管結(jié)節(jié)數(shù)明顯降低（t=8.975，P＜0.001）。見圖15和圖16。

圖15 各組B-CPAP細(xì)胞微管結(jié)節(jié)數(shù)的顯微鏡觀察（×100）Fig.15 Microscopy of numbers of microtubule nodules in B-CPAPcells of various groups（×100）

圖16 各組B-CPAP細(xì)胞的微管結(jié)節(jié)數(shù)Fig.16 Numbers of microtubule nodules in B-CPAP cells of various groups

3 討論

VEGFA是VEGF的一個(gè)亞型，也是對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和分化影響最大的亞型，多項(xiàng)研究表明［14-15］，VEGFA在實(shí)體瘤和血液腫瘤中異常高表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)VEGFA為miR-520c-3p的靶基因，并通過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)驗(yàn)證其靶向關(guān)系。為進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，采用B-CPAP細(xì)胞單獨(dú)或聯(lián)合轉(zhuǎn)染miR-520c-3p mimic和pcDNA-VEGFA，經(jīng)Western blot和RTPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，VEGFA組VEGFAmRNA相對(duì)表達(dá)水平較對(duì)照組顯著升高，miR-520c-3p mimic組miR-520c-3p相對(duì)表達(dá)水平顯著升高，VEGFA mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著降低；與VEGFA組比較，聯(lián)合轉(zhuǎn)染的mimic+VEGFA組VEGFA mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)水平均顯著降低，miR-520c-3p相對(duì)表達(dá)水平顯著升高。表明成功地將miR-520c-3p和VEGFA導(dǎo)入了B-CPAP細(xì)胞中。

腫瘤的惡性生物學(xué)特征包括惡性增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移等，其中腫瘤的惡性增殖與相關(guān)蛋白和增殖相關(guān)蛋白密切相關(guān)［16-17］。Ki67是一種重要的增殖相關(guān)蛋白，當(dāng)Ki67高表達(dá)時(shí)，細(xì)胞的有絲分裂加速［18］。PCNA是增殖細(xì)胞核抗原，與細(xì)胞增殖分化密切相關(guān)，當(dāng)PCNA高表達(dá)時(shí)，細(xì)胞增殖加速［19］。本研究通過CCK-8染色試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-520c-3p mimic組細(xì)胞增殖活性顯著降低，表明miR-520c-3p mimic可明顯抑制B-CPAP細(xì)胞增殖活性。為了探究其機(jī)制，本研究采用Western blot法檢測(cè)增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)，與VEGFA組比較，mimic+VEGFA組Ki67和PCNA蛋白表達(dá)水平顯著降低，表明miR-520c-3p可靶向抑制VEGFA表達(dá)，并下調(diào)增殖相關(guān)蛋白表達(dá)，使B-CPAP細(xì)胞的增殖受到抑制。李慶賀等［20］研究表明，長鏈非編碼RNA可通過靶向下調(diào)VEGFA表達(dá)，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，與本研究得到的結(jié)論相類似。

腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移也是其重要的惡性生物學(xué)特征，這種特征受上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchyml transition，EMT）可使得上皮細(xì)胞極性喪失并獲得移動(dòng)能力［21-23］。EMT過程受相關(guān)蛋白的調(diào)控，如Ncadherin、E-cadherin及Vimentin等［24］。E-cadherin為E-鈣黏蛋白，也是調(diào)節(jié)EMT過程的重要蛋白，Ecadherin減少會(huì)使間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物如Vimentin、纖聯(lián)蛋白等表達(dá)上調(diào)，使得上皮細(xì)胞失去黏附連接作用，增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力［25-26］。本研究通過Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲情況，發(fā)現(xiàn)mimic+VEGFA組侵襲遷移能力顯著降低。為了驗(yàn)證其作用機(jī)制，本研究采用Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋水平白的表達(dá)，結(jié)果顯示，與VEGFA組比較，mimic+VEGFA組Vimentin蛋白表達(dá)量顯著降低，E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著升高，表明miR-520c-3p介導(dǎo)VEGFA低表達(dá)可通過EMT過程抑制腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力。這與方淑芬等［27］研究指出下調(diào)VEGFA的表達(dá)可調(diào)控腫瘤細(xì)胞的EMT過程的結(jié)論相類似。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，miR-520c-3p可通過介導(dǎo)VEGFA低表達(dá)實(shí)現(xiàn)抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖和運(yùn)動(dòng)的能力。