楊 云 劉小龍 饒靜秋 賀艷紅 韓克國 王 劍 袁智勇*

(1.西南林業(yè)大學，云南省高校極小種群野生動物保育重點實驗室，昆明，650224；2.文山市國家級自然保護區(qū)管護分局，文山，663099；3.紅河學院生命科學與技術(shù)學院，蒙自，661199)

越南趾溝蛙(Ranajohnsi)隸屬于兩棲綱(Amphibia)無尾目(Anura)蛙科(Ranidae)蛙屬[1]，是Smith[2]發(fā)表的新種，模式產(chǎn)地為越南林同省郎邊高原(Langbian Plateau，Lam Dong，Vietnam)。目前該蛙在國內(nèi)分布于廣西、廣東、海南和重慶，國外分布于越南和老撾[3-5]。2019年7月，在云南省文山壯族苗族自治州馬關(guān)縣古林箐省級自然保護區(qū)對兩棲爬行動物調(diào)查期間，于保護區(qū)核心區(qū)(22°45′16.36″ N，103°57′43.17″ E；海拔1 160 m)內(nèi)發(fā)現(xiàn)蛙屬物種6只，采集到蛙屬物種標本1號(標本號：SWFU 005647)，標本現(xiàn)保存于西南林業(yè)大學。對采集的蛙屬物種標本進行了外部形態(tài)特征比較和分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析，鑒定該物種為越南趾溝蛙，為云南兩棲動物分布新紀錄。本研究進行了采集地生境描述、形態(tài)描述和分子數(shù)據(jù)及系統(tǒng)發(fā)育分析，為進一步探討越南趾溝蛙的分布情況提供基礎(chǔ)研究資料。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

將采集到的蛙屬物種雄性標本(標本號：SWFU 005647)的肝臟樣品儲存在體積分數(shù)95%的乙醇中，用于后續(xù)的分子試驗。整體標本固定保存在體積分數(shù)75%的乙醇中。

1.2 形態(tài)學測量

依據(jù)費梁等[4]的測量方法，用數(shù)顯卡尺對標本進行形態(tài)學測量，精確到0.1 mm。測量指標：頭體長(snout-vent length，SVL)，自吻端至體后端的長度；頭長(head length，HL)，自吻端至上、下頜關(guān)節(jié)后緣的長度；頭寬(head width，HW)，最大頭部寬度；吻長(snout length，SL)，自吻端至眼前角的長度；鼻間距(internasal space，INS)，左右鼻孔內(nèi)緣之間的距離；眼間距(interorbital space，IOS)，左、右上眼瞼內(nèi)側(cè)緣之間的最窄距離；眼徑(diameter of eye，ED)，與體軸平行的眼球外露部分的直徑；上眼瞼寬(width of upper eyelid，UEW)，上眼瞼最大寬度；鼓膜徑(diameter of tympanum，TD)，鼓膜的水平直徑，測量到鼓膜邊緣的外緣；鼓膜到眼距離(tympanum-eye distance，TEY)，自眼孔的后緣至鼓膜的前緣；前臂及手長(length of lower arm and hand，LAHL)，自肘關(guān)節(jié)至Ⅲ指指尖；股骨長度(femur length，F(xiàn)EM)；脛骨長(tibia length，TIB)；跗足長(length of the foot and tarsus，LFT)，從脛跗關(guān)節(jié)到Ⅳ趾趾尖；足長(foot length，F(xiàn)L)，從跖骨內(nèi)結(jié)節(jié)基部至Ⅳ趾趾尖；第Ⅲ指指吸盤的水平直徑(the horizontal diameter of the finger Ⅲ digital disc，F(xiàn)3DSC)。

1.3 分子系統(tǒng)發(fā)育分析

采用ThermoFisher Scientific公司DNA提取試劑盒提取標本的DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂靡?6S AR(5′-CGCCTGTTTACCAAAAACAT-3′)和16S BR(5′-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3′)[6]，對16S rRNA基因片段進行擴增。PCR反應程序為95 ℃預變性5 min；95 ℃變性40 s，53 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；最后72 ℃終延伸10 min。擴增的PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，最后送至北京擎科生物科技有限公司測序。使用Lasergene 7.0軟件包中的SeqMan對所得序列進行質(zhì)量檢測和人工校對，生成一致序列。

根據(jù)Yuan等[7]對整個蛙屬的系統(tǒng)發(fā)育研究結(jié)果，選擇黃腿蛙(Ranamuscosa)作為外群，從GenBank(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載越南趾溝蛙(KX269182)、明全蛙(R.zhengi，KX269206)、中亞林蛙(R.asiatica，KX269200)、黑龍江林蛙(R.amu-rensis，KX269203)和黃腿蛙(AY779195)序列?；谧畲笏迫环?ML)和貝葉斯法(BI)重建系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。采用MEGA 7.0[8]和Clustal W 2.0[9]對所有序列進行比對，用jModelTest 0.1.1計算最佳替換模型，使用RaxML 8.2.4版本運行最大似然估計[10]。在ML分析下使用非參數(shù)自助重取樣重復1 000次來評估自引支持度。使用Mrbayes 3.1.2進行貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育分析[11]，通過讓4條遞增加熱的馬爾科夫鏈運行3 000萬代，每1 000代抽樣1次，得出后驗概率分布?；谑諗壳闆r，舍棄前25%的樹。使用Tracer v1.5檢測各運行參數(shù)值是否收斂[12](有效樣本量大于200和潛在的尺度縮減因子值接近1來保證收斂)。最后使用MEGA 7.0[8]中的p-distance雙參數(shù)模型計算蛙屬物種間的遺傳距離。

2 結(jié)果與分析

2.1 生境描述

古林箐省級自然保護區(qū)屬于南亞熱帶濕潤季風氣候[13-14]，本次在云南省馬關(guān)縣采集的1號越南趾溝蛙標本，發(fā)現(xiàn)于海拔1 160 m左右的山間溪流內(nèi)，溪流水流緩慢，溪中有一些石塊。附近植被豐富，主要以灌木、草本植物和喀斯特地貌常綠闊葉林為主，間有小面積的低海拔熱帶雨林成分(圖1)。同域生境下發(fā)現(xiàn)的兩棲動物還有腹斑掌突蟾(Paramegophrysventripunctatus)、白斑棱皮樹蛙(Thelodermaalbopunctatum)、版納大頭蛙(Limnonectesbannaensis)和沙巴琴蛙(Nidiranachapaensis)。

2.2 形態(tài)描述

采集的越南趾溝蛙頭體長38.3 mm，其余各部位量度數(shù)據(jù)見表1。頭長大于頭寬；吻端鈍圓，突出于下唇；瞳孔橫橢圓形，眼間距略小于上眼瞼寬；鼓膜清晰；犁骨齒呈兩斜列。背面光滑，背側(cè)褶細，到鼓膜上方略彎曲；體背后部有小疣粒；體腹面光滑(圖2)。

表1 越南趾溝蛙標本形態(tài)量度

指端略膨大，無溝；后肢細長，脛跗關(guān)節(jié)前伸達吻鼻之間或略超過吻端，左、右跟部重疊；脛長超過體長之半，明顯長于股部長；跗褶部位有小疣，趾端呈小吸盤狀，腹側(cè)具溝，趾間全蹼，蹼緣缺刻深。背面褐色，兩眼間有一深褐色橫紋，肩上方有“人”形褐色斑；四肢背面有深褐色橫紋；體腹面淺黃色，胸、腹部有深色的云斑(圖2)。

圖2 越南趾溝蛙(云南省古林箐省級自然保護區(qū)，)Fig.2 Rana johnsi from Gulinqing Provincial Nature Reserve，Yunnan，China() 注：A.背側(cè)面；B.背面；C.腹面 Note：A，Dorsolateral view.B，Dorsal view.C，Ventral view

指長順序為Ⅱ<Ⅰ<Ⅳ<Ⅲ，指基部有指基下瘤，指間無蹼，關(guān)節(jié)下瘤突出；掌突3個，橢圓形，第Ⅱ指掌突略圓，較弱小。趾長順序為Ⅰ<Ⅱ<Ⅲ<Ⅴ<Ⅳ，趾間蹼發(fā)達，關(guān)節(jié)下瘤明顯；內(nèi)蹠突橢圓形，外蹠突圓而小；跗褶部位具小疣(圖3)。

圖3 越南趾溝蛙手部及足部形態(tài)(云南省古林箐省級自然保護區(qū)，)Fig.3 Hands and foots of Rana johnsi from Gulinqing Provincial Nature Reserve，Yunnan，China() 注：A.手背面；B.手腹面；C.足背面；D.足腹面 Note：A，Dorsal view of hand.B，Ventral view of hand.C，Dorsal view of foot.D，Ventral view of foot

2.3 分子數(shù)據(jù)及系統(tǒng)發(fā)育分析

新獲取1條序列(GenBank登錄號OK037567)，比對后序列長度580 bp，變異位點57個和簡約信息位點23個，系統(tǒng)發(fā)育的結(jié)果顯示，BI和ML樹的拓撲結(jié)構(gòu)基本相同。在文山馬關(guān)縣采集的蛙屬物種樣本與越南林同省的越南趾溝蛙樣本聚成單系(圖4)，支持率高(100%)?；趐-distance雙參數(shù)模型估算的新采集樣本與越南趾溝蛙的遺傳距離為0.8%。

3 討論

在云南文山州古林箐省級自然保護區(qū)采集到的越南趾溝蛙標本與越南郎邊高原的該蛙模式標本在外部形態(tài)描述上基本一致，同時系統(tǒng)發(fā)育分析的結(jié)果顯示，采集的標本與模式標本聚為一個支系，遺傳距離非常小(0.8%)。基于以上結(jié)果，證實了越南趾溝蛙在云南省文山州馬關(guān)縣的分布。本研究采集到的雄性標本頭體長較模式標本小(頭體長分別是38.3 mm和49.0 mm)[2]，且背部體色和腹部體色較深。越南趾溝蛙在云南馬關(guān)縣古林箐自然保護區(qū)的發(fā)現(xiàn)，提示與相鄰的廣西、越南地區(qū)有相似的物種組成，對動物地理學研究有重要意義。越南趾溝蛙的繁殖季節(jié)在8月下旬—9月下旬[3-4]，研究人員于2019年7月29日在古林箐保護區(qū)采集標本時，未發(fā)現(xiàn)其抱對現(xiàn)象，由于考察時間較短，不確定該蛙是否進入繁殖期，繁殖生活史需進一步研究。

致謝：感謝西南林業(yè)大學魏平凡和密歇根州立大學張寅鵬同學在文章撰寫過程中給予的幫助。