鄭 建, 趙 祥, 徐 浩, 宋 娜??

(1. 海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室(中國海洋大學)， 山東 青島 266003； 2. 青島市海洋減災中心， 山東 青島 266003)

小黃魚(Larimichthyspolyactis)是鱸形目(Perciformes)石首魚科(Sciaendae)黃魚屬(Larimichthys)的一種經(jīng)濟魚類，主要棲息在河口附近及沿岸海域[1]。小黃魚是暖溫性底層洄游魚類，主要攝食甲殼類、幼魚以及其他種類的浮游生物[2]。小黃魚是西北太平洋所特有的重要經(jīng)濟魚類，在中國渤海、黃海和東海海域均有分布。曾經(jīng)我國小黃魚的資源量非常豐富，在我國的捕撈漁業(yè)中一直占有重要地位，是我國著名的“四大海產(chǎn)”之一[2]。然而隨著捕撈壓力的加大，小黃魚不僅產(chǎn)量降低且有低齡化趨勢[3]。雖然從二十世紀九十年代開始，國家出臺了一系列保護措施，但目前我國小黃魚漁業(yè)資源狀況仍不容樂觀[4]。

為了研究小黃魚的種質(zhì)資源狀況，制定更合理的保護策略，很多學者從資源量、洄游、形態(tài)學、繁殖生物學等不同方面展開研究[4-7]，利用分子標記手段對小黃魚群體遺傳學的研究也有多篇報道[8-10]。海洋魚類遺傳多樣性和遺傳結構研究是解析物種分布規(guī)律與資源變動情況的有效手段[11]，目前魚類群體遺傳學的研究報道多集中于分析不同地理群體空間尺度上的遺傳多樣性差異。然而也有研究發(fā)現(xiàn)，同一海域不同時間采集的樣品也會存在遺傳學差異[12]，這使得群體遺傳學研究變得更加復雜。若群體存在時間尺度上的遺傳分化，空間上的遺傳多樣性和遺傳結構也會由于采樣時間的不同而產(chǎn)生一定的差異[12-13]。此外，群體時間尺度上的遺傳差異也能在一定程度上反映物種資源量的波動情況。目前小黃魚群體遺傳學研究均集中在不同地理群體間[4-7]，尚未見其同一地點不同時間尺度上的群體遺傳學的研究報道。

由于操作簡便和結果準確，線粒體DNA標記和微衛(wèi)星DNA標記已成為群體遺傳學研究中較常用的分子標記[14-17]。本研究利用線粒體DNA控制區(qū)序列和微衛(wèi)星標記技術對青島近海小黃魚不同季節(jié)的采集樣品進行了群體遺傳學研究，旨在探討小黃魚遺傳多樣性的變化，從而分析小黃魚分布規(guī)律與資源變動情況，為小黃魚資源的合理保護提供基礎資料。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

本研究于2019—2020年在青島近海通過當?shù)貪O民小型船近岸采集得到了3、5、8和12月共計4個月份的青島近海小黃魚樣品，同時從GenBank上下載了2005年的序列數(shù)據(jù)(KF412731～KF412751)[9]，共計117尾樣品的序列進行分析。對新采集的樣品進行形態(tài)鑒定，然后取其肌肉組織并加入95%乙醇，樣品和肌肉組織均放入-20 ℃冰箱進行保存(見表1)。

表1 小黃魚樣品采集信息與遺傳多樣性指數(shù)

1.2 基因組DNA提取、序列擴增及基因分型

使用傳統(tǒng)的苯酚-氯仿法提取小黃魚基因組DNA[17-18]。依據(jù)吳仁協(xié)等[19]擴增的小黃魚線粒體DNA全序列(GenBank: NC 013754)，利用Primer Premier 5軟件設計小黃魚線粒體DNA控制區(qū)引物，然后進行PCR擴增[20]。引物序列為F2-CGGACGTC-GGGGGTTAAAT 和 R2-ATGGGGAGCAACCACA-AGAA。參考Song等[21]的研究來配置PCR反應體系，體系總體積為25 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，37個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過電泳檢測后，將擴增效果較好的產(chǎn)物送到北京擎科生物有限公司青島分公司進行雙向測序。

從Liu等[22]篩選的17對微衛(wèi)星引物中合成12對(Lpo103、Lpo104、Lpo105、Lpo106、Lpo109、Lpo110、Lpo111、Lpo112、Lpo113、Lpo114、Lpo115、Lpo116)用于本研究中樣品的擴增。12對引物的正向引物在合成時添加熒光接頭，共3種熒光接頭，分別為HEX、FAM和TAMARA，利用3種接頭的不同顏色來識別數(shù)據(jù)。PCR反應體系和反應條件參考Liu等[22]的研究來配置。使用瓊脂糖對擴增產(chǎn)物進行檢測，合格的產(chǎn)物送至北京擎科生物有限公司青島分公司進行基因分型。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用DNASTAR(DNASTAR，Inc.，Medison，WI)軟件包中的Seqman根據(jù)測序峰圖校正和比對序列，使用MEGA 7.0軟件構建小黃魚單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹[23]，經(jīng)過1 000次bootstrap抽樣對系統(tǒng)發(fā)育樹的可靠性進行評估。使用Arlequin 3.5軟件獲得單倍型多樣度、核苷酸多樣度、遺傳分化等指標[24]。使用Lamarc 2.0軟件估算參數(shù)θ(θ=Ne·μ，其中Ne為有效種群大小，μ為突變速率)[25]，根據(jù)θ計算各季節(jié)小黃魚樣本有效種群Ne的大小[26]。根據(jù)小黃魚控制區(qū)的突變速率為(3%～12%)/百萬年[17]，使用Lamarc 2.0軟件計算各群體間的基因流M(M=m/μ)和生長率參數(shù)g。

使用Genemarker v.1.91軟件讀取每個個體的各位點的等位基因長度[27]；使用Fstat v.2.9軟件計算各個位點的遺傳多樣性指標，包括等位基因豐度、等位基因數(shù)、觀測雜合度和期望雜合度[28]；使用Excel Microsatellite Toolkit(MS-tools)計算各位點的多態(tài)信息含量(PIC)[29]; 使用Genepop v.4.0軟件來檢測哈代溫伯格平衡和連鎖不平衡[30]；使用Structure v.2.3軟件確定小黃魚樣本的分配模式[31-32]；使用Fstat v.2.9軟件計算小黃魚樣本的遺傳分化指數(shù)(Fst)[28]；使用Population v.1.2軟件計算遺傳距離[33]；使用Genetix軟件進行三維因子主成分分析[34]。

2 結果

2.1 基于線粒體DNA控制區(qū)的遺傳學分析

經(jīng)過與Xiao等[9]擴增的小黃魚序列進行比對后獲得447 bp的同源序列，該序列用于后續(xù)分析。結果顯示：序列的平均A、T、C、G含量分別為27.46%、35.75%、14.43%、22.36%，A+T的含量高于C+G，展現(xiàn)了堿基組成的偏倚。多態(tài)位點數(shù)量、單倍型多樣度和核苷酸多樣度見表1，本研究中青島近海小黃魚存在著較高的遺傳多樣性，且單倍型多樣度和核苷酸多樣度均略高于2005年的數(shù)據(jù)。

本研究中在117條序列中共檢測出63個多態(tài)位點，這些多態(tài)位點共定義了81個單倍型。2019年8月采集的樣本有最多的單倍型，為24個，2005年4月樣本的單倍型數(shù)最少，為16個(見表2)。

表2 各群體小黃魚單倍型統(tǒng)計

以大黃魚為外群(GenBank: EU339149)構建的單倍型NJ系統(tǒng)樹顯示，81個單倍型雜亂分布，沒有顯著的遺傳結構(見圖1)；最小跨度樹也顯示出同樣的結果(見圖2)。

圖1 以大黃魚為外群(GenBank: EU339149)構建的單倍型NJ系統(tǒng)樹Fig.1 The phylogenetic analyzes for L. polyactis investigated using Neighbor-joining tree (NJ) with Larimichthys crocea as the outgroup (GenBank: EU339149)

小黃魚不同季節(jié)樣本間的遺傳分化指數(shù)Fst值整體較小，僅部分季節(jié)樣本間存在微弱的遺傳分化(見圖3)。為進一步探究青島近海小黃魚不同季節(jié)樣本的遺傳差異，對所有的小黃魚樣本進行了3種組合的AMOVA分析，分別是一個基因池(全部樣本)、一個基因池(近期小黃魚樣本)、兩個基因池(近期小黃魚樣本、2005年小黃魚樣本)。AMOVA分析結果顯示，3種分組模式下，小黃魚樣本內(nèi)部的遺傳變異均大于95%，不同季節(jié)小黃魚樣本間無顯著遺傳差異。

本研究中青島近海小黃魚有效種群數(shù)量高于2005年的數(shù)據(jù)，且生長指數(shù)也均呈現(xiàn)較大的正值。種群基因流分析結果顯示本研究中不同季節(jié)樣本間的基因流較高，而2005年的樣本與近期各月份的樣本基因流是較低的(見表3)。

2.2 基于微衛(wèi)星DNA標記的群體遺傳學分析

基于12個位點對2019—2020年小黃魚樣本的遺傳多樣性分析，結果見表4。不同季節(jié)小黃魚樣本共獲得了185個等位基因，等位基因豐富度的范圍是11.752～21.695。所有位點的多態(tài)信息含量的范圍是0.841～0.941，平均多態(tài)信息含量為0.891，所有樣本均表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性水平(見表4)。哈代溫伯格平衡檢測結果表明，經(jīng)Bonferroni校正后，不同季節(jié)小黃魚樣本在2個位點上偏離平衡狀態(tài)(P>0.05)。本研究中小黃魚的平均觀測雜合度、平均期望雜合度和平均多態(tài)信息含量均高于2009年[35](見表5)，這一結果與基于線粒體DNA控制區(qū)的分析結果基本一致。

圖2 基于小黃魚線粒體DNA控制區(qū)序列構建的單倍型網(wǎng)絡圖Fig.2 Haplotype network diagram based on mitochondrial DNA control region sequence of L. polyactis

圖3 小黃魚群體間的Fst值Fig.3 The pairwise Fst values among L. polyactis populations

表3 小黃魚群體的有效種群、生長指數(shù)及基因流Table 3 Effective population, growth parameter and gene flow of L. polyactis

表4 基于12個微衛(wèi)星位點的小黃魚群體的遺傳多樣性參數(shù)

表5 近兩年小黃魚樣本的遺傳多樣性與歷史數(shù)據(jù)的對比

小黃魚不同季節(jié)樣本的遺傳分化指數(shù)Fst值范圍為-0.024(2019年5月和2019年8月相比較)～0.152(2019年5月和2020年3月相比較)(見表6)，遺傳距離(δμ)2范圍為0.279(2019年5月和2019年8月相比較)～0.414(2019年5月和2020年3月相比較)(見表6)。利用主成分分析獲得的三個變異因子的貢獻率分別為50.29%、29.25%和20.64%。結果表明，不同季節(jié)小黃魚樣本均有較大部分重疊，不能被有效區(qū)分(見圖4)。

基于混合模型對不同季節(jié)小黃魚樣本進行了STRUCTURE分析，結果表明，K=3為組群分配的最優(yōu)值，當K=3時，各季節(jié)樣本的分配比例相對一致(見圖5)。

表6 小黃魚樣本的Fst值(對角線下)與遺傳距離(δμ)2(對角線上)

(紫色：2019年5月，紅色：2019年8月，綠色：2019年12月；藍色：2020年3月。Purple:May,2019，Red:Aug.,2019，Green:Dec.,2019，Blue:Mar.,2020.)圖4 小黃魚樣本的主成分分析Fig.4 Principal component analysis of L. polyactis populations

3 討論

物種的遺傳多樣性是生物進化的原始材料，在物種進化過程中起到了重要作用。利用線粒體DNA標記和微衛(wèi)星標記的多態(tài)性計算不同群體的遺傳學參數(shù)，繼而通過統(tǒng)計學手段檢測群體的遺傳結構、遺傳多樣性和群體歷史動態(tài)是非常有效的，并且已經(jīng)被廣泛的應用到海洋魚類的群體遺傳學分析中[16,36-37]。群體時間尺度上的遺傳變異的原因可能是存在一定地理隔離的物種在不同時期出現(xiàn)在同一區(qū)域內(nèi)，或者是該物種在同一時期出現(xiàn)在同一區(qū)域但彼此沒有混合。魚類的洄游和魚卵、仔稚魚隨洋流漂浮的特性為這一現(xiàn)象的產(chǎn)生提供了條件。研究物種時間尺度上的遺傳多樣性和遺傳結構能更有效、更全面地鑒別種群，估算種群的遺傳多樣性變化，對漁業(yè)資源的管理和保護有著重要意義。

圖5 不同季節(jié)小黃魚的STRUCTURE條形圖(K=3)Fig.5 STRUCTURE bar plots (K=3) from 12 microsatellite loci of L. polyactis populations

本研究中線粒體DNA控制區(qū)序列分析的結果表明青島近海小黃魚群體呈現(xiàn)較高的單倍型多樣性和較低的核苷酸多樣性，這表明小黃魚群體內(nèi)的遺傳多樣性較高。這種遺傳模式也存在于其他海洋魚類之中[38-39]。物種在遺傳漂變的作用下會損失部分頻率較低的單倍型，而短時間內(nèi)群體規(guī)模的快速增長可能會造成隨機遺傳漂變減小，從而部分稀有單倍型被保存下來，造成了小黃魚群體有較高的遺傳多樣性[40]。微衛(wèi)星標記的研究結果也支持了這一結論。

與Xiao等[9]和Liu等[35]的數(shù)據(jù)相比較，本研究中線粒體DNA控制區(qū)序列和微衛(wèi)星標記的分析結果均表明青島近海小黃魚的遺傳多樣性指數(shù)略有升高。且基于線粒體DNA標記估算的近期小黃魚的有效種群也高于2005年的數(shù)據(jù)，這可能與小黃魚的適應能力較強以及國家相關禁漁法規(guī)的出臺有關[41]。

遺傳分化指數(shù)Fst是估測群體內(nèi)遺傳相似性的有效手段[42]。本研究中兩種標記的分析結果均表明不同季節(jié)小黃魚樣本間存在較低的遺傳分化，同時主成分分析和STRUCTURE分析結果也表明小黃魚的遺傳變異主要來自于群體內(nèi)部。Xiao等[9]和Liu等[35]等基于線粒體DNA和微衛(wèi)星標記的研究結果顯示我國近海小黃魚各群體間有較高的基因流，因此盡管小黃魚存在大范圍洄游現(xiàn)象，但青島近海各季節(jié)小黃魚樣本沒有顯著的遺傳分化[5,43]。

小黃魚與大黃魚同屬于“四大海產(chǎn)”，我國近海的大黃魚種群在經(jīng)歷了二十世紀八十年代的急劇衰退后，資源量始終難以恢復，而小黃魚的資源量卻有逐漸上升的趨勢[44]。盡管遺傳學研究的結果表明小黃魚現(xiàn)存的種群保持著較高的遺傳多樣性和支持其長期續(xù)存的進化潛力，但是目前小黃魚的小型化和低齡化狀況不容樂觀[45]。有研究表明小黃魚目前的生長方式屬于負異速生長類型，即體長的增長快于體質(zhì)量的增加，也證實了小黃魚群體有小型化和提早性成熟現(xiàn)象[46]。因此，應制定更合理的保護政策，同時加強對漁民的宣傳教育，提高小黃魚的最小可捕規(guī)格，切實有效實現(xiàn)小黃魚漁業(yè)資源的可持續(xù)發(fā)展。

4 結語

本研究結果顯示青島近海小黃魚不同季節(jié)樣本間沒有顯著的遺傳分化，表明我國近海不同地理群體的小黃魚可能存在較高的基因流。青島近海小黃魚群體具有較高的遺傳多樣性暗示其資源量有恢復的趨勢。但小黃魚個體的小型化與早熟化現(xiàn)象也急需我們采取更合理的保護措施。