周婷婷,沈衛(wèi)星,2,陳桐慶,馮慧,譚佳妮,2,徐長亮,2,余成濤,2,范旻旻,2,程海波,2

(1.南京中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院,江蘇 南京 210023;2.江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京 210023)

結直腸癌是發(fā)病率最高的消化道惡性腫瘤,對社會造成巨大負擔[1]。奧沙利鉑(Oxaliplatin,OXA)是第3代鉑類藥物,臨床常用于結直腸癌的治療?；颊叱Ｔ谟盟?4～48 h內(nèi)出現(xiàn)急性神經(jīng)毒性,長期劑量累積會引起慢性神經(jīng)毒性。若OXA用藥累積劑量超過1 165 mg·m-2,大約有50%的患者會出現(xiàn)較嚴重的神經(jīng)毒性反應,如肢端感覺麻木、鈍痛等,從而導致化療中止,最終影響療效[2～3]。OXA神經(jīng)毒性的產(chǎn)生與藥物劑量累積效應呈正相關,此類周圍神經(jīng)毒性被稱為蓄積性周圍神經(jīng)毒性[4]。臨床研究表明,接受含OXA化療方案的惡性腫瘤患者中蓄積性周圍神經(jīng)毒性發(fā)生率高達60%～90%,不僅影響患者化療耐受性、依從性及臨床療效,還嚴重影響患者精神心理健康和生存質(zhì)量[5]。因此,如何有效防治含有OXA化療方案造成的周圍神經(jīng)毒性,減輕周圍神經(jīng)系統(tǒng)損傷已成為臨床迫切需要解決的問題。

探索一種新的化療增效藥物,在保持或增加化療效果的前提下,降低OXA使用劑量,或縮短化療周期,對減輕OXA所致的蓄積性周圍神經(jīng)毒性具有重要意義。近年來,中醫(yī)藥已廣泛應用于腫瘤臨床治療。現(xiàn)代藥理研究表明,預知子包含有三萜類及皂苷類等成分,具有抗腫瘤的作用[6-7],但對預知子中的成分是否可增效OXA尚未有相關報道。本實驗以結腸癌HCT116細胞為研究對象,探索預知子提取物增敏OXA的最佳組合濃度,在保證抗腫瘤藥效的前提下,減少OXA的使用劑量,并初步探討其作用機制,為OXA治療結直腸癌的臨床應用提供思路。

1 材料

1.1 細胞

人結腸癌HCT116細胞由國家中醫(yī)藥管理局名醫(yī)驗方評價與轉化重點研究室提供。

1.2 試劑

預知子(河北福君堂藥業(yè)有限公司，批號:190505,產(chǎn)地:河北);OXA(美國MCE公司,貨號:HY-17371);皂苷B(實驗室自制,純度>98%);α-常春藤皂苷(成都瑞芬思生物科技有限公司,貨號:27013-91-8);噻唑藍(德國Biofroxx公司,貨號:298-93-1);Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司,貨號:KGA107);Cleaved caspase-3抗體(美國Affinity公司,貨號:AF7022);Caspase-3、Bcl-2、Bax、Cyt-c抗體(英國Abcam公司,貨號:AB13847、AB196495、AB5714、AB133504);p-p38 MAPK、p38 MAPK、抗兔IgG、抗鼠IgG抗體(美國CST公司,貨號:4511T、8690T、7074、7076);GAPDH抗體(美國Immuno way公司,貨號:YM3029);RIPA裂解液(上海碧云天生物技術有限公司,貨號:P0013D)；蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑(瑞士Roche公司,貨號:11697498001、4906845001)。

1.3 儀器

ACQUITY UPLC系統(tǒng)、Xevo TQ檢測器、MassLynx4.1質(zhì)譜工作站(美國Waters公司);全自動酶標儀(美國Bio-Tek公司,型號:ELx80);流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司,型號:EPICS XL-MCL ADC);電泳儀(美國Bio-Rad公司,型號:1645050);化學發(fā)光凝膠成像儀器(上海天能科技有限公司,型號:Tanon 5500)。

2 方法

2.1 預知子乙酸乙酯萃取物的制備

將10 kg預知子用無水乙醇浸泡3次,第1次7 d,第2次5 d,第3次3 d。合并浸出液過濾后,減壓回收溶劑得粗浸膏。將粗浸膏分散于5 L純水中,用不同極性的溶劑石油醚、乙酸乙酯依次萃取3次,將乙酸乙酯萃取層用旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮,最終得到乙酸乙酯部位干凈粉末161.5 g。

2.2 預知子提取物樣品活性部位的篩選分離及鑒定

將乙酸乙酯部位161.5 g以硅膠(200～300目)干法拌樣,進行中壓柱層析(200～300目)分離,用石油醚-乙酸乙酯作流動相進行梯度洗脫(純石油醚→50∶1→20∶1→10∶1→5∶1→2∶1→純乙酸乙酯),得到18個餾分,記為1～18。將16餾分12.84 g以反相硅膠(C18)干法拌樣,進行低壓柱層析(C18)分離,以TLC檢測,合并相同的餾分,最后得到25個餾分,記為B1～B25。以對腫瘤細胞的增殖抑制率為效應標準進行篩選,確定B14組分為活性部位[8]。

取B14提取物200 mg,以甲醇/水(1∶1)溶解,制備液相分離。使用HPLC進行分離,色譜柱為Waters X-Bridge C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),保護柱為Phenomenex Widepore C18(4 mm×3 mm),流動相為乙腈(A)-水(B),時長50 min。梯度洗脫程序:0～50 min,40%A;檢測波長為210 nm;流速為1 mL·min-1;柱溫為26 ℃;進樣量為20 μL。

2.3 細胞培養(yǎng)與藥物溶解

HCT116細胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液、37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將B14用DMSO溶解,以DMEM培養(yǎng)液稀釋至所需濃度,對照組含相應濃度的DMSO而不含B14。將OXA用雙蒸水溶解,以DMEM培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。

2.4 MTT法檢測細胞增殖抑制率

2.4.1 B14對HCT116細胞的增殖抑制作用 將HCT116細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期,以每孔1×104個細胞接種于96孔板中,設不同濃度B14組(0、2、4、6、8、16、32 μg·mL-1),設置3個復孔,孵育24 h后,每孔加入MTT溶液(5 g·L-1)20 μL,37 ℃避光4 h,每孔加150 μL DMSO振蕩10 min,測定490 nm處光密度值(OD),計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=(1-OD給藥組/OD對照組)×100%。實驗重復3次。

2.4.2 B14增敏OXA對HCT116細胞的增殖抑制作用 將HCT116細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期,以每孔1×104個細胞接種于96孔板中,采用正交試驗設計方法,B14組設濃度(0、3、6、12、24、32 μg·mL-1),OXA組設濃度(0、7.5、15、25、40、80 μg·mL-1),孵育時間為24 h,均設置3個復孔。檢測方法同“2.4.1”。實驗重復3次。采用CompuSyn軟件分析兩藥聯(lián)合效應,并采用中位數(shù)效應原理確定復合指數(shù)(CI)值。CI=D1/Dx1+D2/Dx2,其中,D1和D2分別表示B14和OXA聯(lián)合使用產(chǎn)生同等效果所需的劑量,Dx1和Dx2分別表示抑制一定水平細胞生長所需的B14和OXA游離藥物劑量。CI<1表示兩藥聯(lián)用為協(xié)同效應,CI=1為相加作用,CI>1為拮抗作用。

根據(jù)MTT的實驗數(shù)據(jù)和軟件分析結果,為后續(xù)實驗確定聯(lián)合用藥最佳藥物量效比濃度。

2.5 細胞形態(tài)學觀察

將HCT116細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期,以每孔1×106個細胞接種于6孔板。根據(jù)“2.4.2”實驗中軟件分析得到的最佳量效濃度,將細胞分為對照組、B14組(6 μg·mL-1)、OXA組(15 μg·mL-1)和聯(lián)合組(6 μg·mL-1B14+15 μg·mL-1OXA)。給藥作用24 h后,倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)改變。

2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡

將HCT116細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期,以每孔1×106個細胞接種于6孔板中,分組同“2.5”。加藥培養(yǎng)24 h后,消化、離心收集細胞,按照Annexin V-FITC/PI試劑盒說明操作,避光室溫孵育15 min后,上流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。實驗重復3次。

2.7 流式細胞術檢測細胞周期

將HCT116細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期,以每孔1×106個細胞接種于6孔板中,分組同“2.5”。細胞貼壁后,換不含血清的DMEM培養(yǎng)液,饑餓細胞24 h使細胞周期同步化。加藥培養(yǎng)24 h后,消化、離心收集細胞,加入10 mL預冷的70%乙醇,-20 ℃固定過夜。固定結束后,用預冷的PBS洗2遍,再用碘化丙啶(PI)染色,避光、室溫反應10 min后上流式細胞儀檢測各組細胞周期百分率。實驗重復3次。

2.8 Western blot法檢測細胞凋亡相關蛋白

各組細胞給藥培養(yǎng)24 h后,移去上清,PBS洗3次后吸除,加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液,提取細胞總蛋白。BCA法定量蛋白,將各組蛋白濃度調(diào)整一致,加入適量4×蛋白上樣緩沖液,100 ℃沸水浴10 min,冷卻備用。SDS-PAGE凝膠電泳分離后,轉移至PVDF膜上,5%脫脂奶粉常溫封閉2 h。依次加入PBST稀釋的一抗(Bcl-2 1∶2 000;Bax 1∶1 000;Cyt-c 1∶5 000;Cleaved caspase-3 1∶1 000;Caspase-3 1∶5 000;p-p38 MAPK 1∶1 000;p38 MAPK 1∶1 000),4 ℃孵育過夜,PBST洗3次,每次10 min。二抗用PBST稀釋至1∶5 000,室溫下孵育2 h。洗膜后顯色、曝光、拍照,用Image J分析各條帶光密度值,蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/GAPDH蛋白灰度值。實驗重復3次。

2.9 統(tǒng)計學分析

3 結果

3.1 預知子活性部位B14的測定結果

根據(jù)2015年版《中國藥典》[9],結合HPLC的檢測結果(圖1～2),初步分析預知子活性部位B14的主要成分為皂苷B和α-常春藤皂苷。圖2中1號峰保留時間為35 min左右,鑒定為皂苷B,全稱:3-O-β-D-xylopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosyl hederagenin[10-11];2號峰保留時間為37 min左右,鑒定為α-常春藤皂苷,全稱:3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosyl hederagenin[12]。

圖1 標準品色譜圖Fig.1 The HPLC chromatograms of standard products

注：1.皂苷B；2.α-常春藤皂苷圖2 B14的HPLC圖譜Fig.2 The HPLC chromatogram of B14

3.2 B14與OXA對HCT116細胞的增殖抑制作用

B14能抑制HCT116細胞增殖,IC50為18.6 μg·mL-1,且抑制作用呈時間與劑量依賴性,見圖3。通過表1分析,聯(lián)合組的抑制作用強于單藥組。6 μg·mL-1B14對HCT116細胞無明顯毒性,但與OXA 7.5、15、25、40、80 μg·mL-1聯(lián)合應用時,其抑制率比單獨使用OXA顯著提高(P<0.001)。

圖3 B14對HCT116細胞增殖的作用Fig.3 The effect of B14 on HCT116 cells proliferation

表1 各組HCT116細胞增殖抑制率的比較Table 1 Comparison of inhibitory rates of HCT116 cells proliferation in each group

3.3 聯(lián)合用藥藥效評價

將B14聯(lián)合OXA的不同濃度(3+7.5、6+15、12+25、24+40、32+80 μg·mL-1)抑制率數(shù)據(jù)輸入CompuSyn軟件生成圖4。提示本研究所選擇的藥物濃度配比中,6 μg·mL-1B14+15 μg·mL-1OXA方案CI值最小,協(xié)同作用最強,為最佳配比,故作為后續(xù)實驗的濃度。

圖4 不同濃度B14+OXA抑制HCT116細胞增殖的聯(lián)合指數(shù)圖Fig.4 Fa-CI plot of HCT116 cells proliferation inhibition with different concentrations of B14+OXA

3.4 B14與OXA對HCT116細胞形態(tài)的影響

對照組HCT116細胞生長狀態(tài)良好。B14組與OXA組細胞密度降低,細胞狀態(tài)變差。聯(lián)合組相鄰細胞連接疏松,細胞增殖減少且形態(tài)發(fā)生明顯變化,出現(xiàn)細胞變圓皺縮等現(xiàn)象,見圖5。

A.空白組;B.B14組;C.OXA組;D.聯(lián)合組圖5 各組HCT116細胞形態(tài)比較(×100)Fig.5 HCT116 cell morphology in each group (×100)

3.5 B14與OXA對HCT116細胞凋亡的影響

與對照組比較,B14組凋亡率有輕度升高,但無明顯統(tǒng)計學意義。OXA組細胞凋亡率高于對照組(P<0.01),但聯(lián)合組具有顯著誘導HCT116細胞凋亡的作用,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001),見圖6。

注：與對照組比較,圖6 各組HCT116細胞凋亡的比較Fig.6 The apoptosis rates of HCT116 cells in each group

3.6 B14與OXA對HCT116細胞周期的影響

與對照組比較,OXA組和聯(lián)合組HCT116細胞明顯被阻滯于G2/M期,S期細胞減少,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001),見圖7。

3.7 B14與OXA對HCT116細胞內(nèi)蛋白表達水平的影響

與對照組比較，OXA組和聯(lián)合組HCT116細胞中Bcl-2、Caspase-3蛋白表達及Bcl-2/Bax比值顯著降低(P<0.01，P<0.001)，Bax、Cyt-c、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-3/Caspase-3比值及p-p38 MAPK顯著升高(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。與OXA組比較，聯(lián)合組Bcl-2、Caspase-3及Bcl-2/Bax比值顯著降低(P<0.01，P<0.001)，Bax、Cyt-c、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-3/Caspase-3比值及p-p38 MAPK顯著升高(P<0.05，P<0.01，P<0.001),見圖8。

注：與對照組比較,圖7 各組HCT116細胞周期的比較Fig.7 The cycle distribution of HCT116 cells in each group

注:A.對照組;B.B14組;C.OXA組;D.聯(lián)合組;與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;與OXA組比較,圖8 各組p38 MAPK信號通路及凋亡相關蛋白的表達情況Fig.8 The expressions of p38 MAPK signal pathway and apoptosis related proteins in each group

4 討論

結直腸癌常由致癌因子引起細胞無限增殖,治療的關鍵是誘導腫瘤細胞凋亡[13]。OXA常用于治療Ⅱ、Ⅲ期結直腸癌,其抗腫瘤作用顯著,但也常引起骨髓抑制、神經(jīng)毒性等不良反應,降低患者生活質(zhì)量,影響臨床化療效果。OXA毒副作用的產(chǎn)生與劑量累積密切相關[14]。近年來,基于增效減毒目的的OXA與其他藥物聯(lián)合使用的臨床與實驗研究表明,在不影響OXA抗腫瘤療效的前提下,降低OXA的使用量是減少其毒副作用的可能途徑之一。肖海娟等[15]研究發(fā)現(xiàn),腸胃清粗提物協(xié)同增效OXA對結腸癌HCT116細胞的化療敏感性。馮杰等[16]研究發(fā)現(xiàn),葫蘆素B促進Cleaved caspase-3和Bax蛋白表達,抑制Caspase-3和Bcl-2蛋白表達,誘導結腸癌SW480細胞凋亡,與OXA聯(lián)合后抑制作用更顯著。

研究表明,預知子是中醫(yī)治療腫瘤行氣活血治法的代表藥,對肝癌、大腸癌、胃癌等具有抑制作用,但研究成果主要集中在臨床經(jīng)驗及實驗研究中,預知子抗腫瘤的機制研究仍有相當大的空間。吳曉等[17]研究發(fā)現(xiàn),預知子醇提物協(xié)同雷公藤紅素具有顯著抑制SMMC7721細胞增殖及凋亡的作用,其機制可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和自噬有關。張瑜等[18]研究發(fā)現(xiàn),預知子醇提物可抑制H22細胞小鼠移植瘤的生長,減輕化療的毒副作用。

根據(jù)本研究HPLC圖顯示，通過與對照品比對，乙腈溶劑峰對皂苷B和α-常春藤皂苷的峰沒有影響；對照品與B14樣品溶液中的皂苷B和α-常春藤皂苷的保留時間基本相同，RSD值均小于2.0%，故該色譜條件適合作為B14定性的HPLC色譜條件，預知子的抗腫瘤活性部位B14的主要成分為皂苷B和α-常春藤皂苷。MTT結果提示，聯(lián)合組細胞增殖抑制率顯著高于B14單藥組(P<0.001)或OXA單藥組(P<0.05，P<0.001),提示B14可以增強HCT116細胞對OXA的化療敏感性。CompuSyn結果提示,B14與OXA聯(lián)合可能存在最佳抑制效果的濃度配比,即濃度分別為6 μg·mL-1和15 μg·mL-1。B14促進細胞凋亡的作用并不顯著,但可以顯著增加OXA誘導的細胞凋亡(P<0.001)。與對照組比較,聯(lián)合組和OXA組細胞G2/M期比例明顯升高,S期細胞百分率降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001),說明聯(lián)合組和OXA組將HCT116細胞阻滯在了G2/M期。

既往研究表明,p38 MAPK屬于絲裂原活化蛋白激酶,參與調(diào)控腫瘤細胞的增殖、凋亡等多種生物學過程。一旦腫瘤形成,p38 MAPK常處于低活化狀態(tài)。本實驗發(fā)現(xiàn)低劑量6 μg·mL-1B14聯(lián)合OXA可以誘導結直腸癌細胞凋亡,激活p38 MAPK磷酸化,可能與介導Bax釋放至線粒體膜上,破壞膜內(nèi)外離子濃度差,進而使Cyt-c釋放到細胞質(zhì)中,激活Caspase-3,引發(fā)的細胞凋亡級聯(lián)反應[19]相關。Bcl-2/Bax是調(diào)節(jié)細胞存活與凋亡的經(jīng)典信號通路,其中Bcl-2是抗凋亡因子,Bax是促凋亡因子[20]。二者結合后可以激活Caspase-3途徑,加速結直腸癌細胞凋亡[21]。Cleaved caspase-3是調(diào)控細胞凋亡過程的核心因子,也是預知子治療腫瘤的潛在靶點,通過活化Caspase-3,激活級聯(lián)反應,誘導細胞凋亡[22]。因此,B14可能成為一種潛在的OXA化療增敏劑,可降低OXA的使用量,進一步限制其副作用。

綜上所述,預知子提取物B14可增加結腸癌HCT116細胞的OXA化療敏感性,這種作用可能與阻滯細胞周期在G2/M期及激活p38 MAPK介導的線粒體凋亡通路有關。本研究結果為臨床減輕OXA毒副作用、提高化療療效提供了方向和線索。同時,由于B14是包含2種成分的混合物,其確切的增敏OXA的活性成分及機制將在今后進行深入研究。