承德市售常見果蔬中葉黃素含量的測(cè)定

趙笑菲，陳 震，孫艷文*

(1．河北石油職業(yè)技術(shù)大學(xué) 化學(xué)工程系，河北 承德 067000；2．河北民族師范學(xué)院 化學(xué)與化工學(xué)院，河北 承德 067000)

葉黃素，又名“植物黃體素”，是一種廣泛存在于蔬菜、花卉、水果與某些藻類生物中的天然色素[1]，葉黃素具有很好的抗氧化性，因此對(duì)于預(yù)防人體衰老、老年性黃斑區(qū)病變、白內(nèi)障等疾病具有良好的功效, 葉黃素已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品、食品、化妝品、飼料等領(lǐng)域[2]。隨著人們生活節(jié)奏加快，手機(jī)電腦等電子產(chǎn)品不斷更新普及，人們用眼時(shí)間和強(qiáng)度不斷加大，眼疲勞增加，老年白內(nèi)障等眼部疾病發(fā)病率不斷升高。雖然可以通過營(yíng)養(yǎng)品和保健品來補(bǔ)充葉黃素，但是過量攝入葉黃素會(huì)對(duì)肝臟造成負(fù)擔(dān)，因此，建立一種簡(jiǎn)單、高效的常見果蔬中葉黃素含量的測(cè)定方法，了解不同果蔬中葉黃素的含量對(duì)人們健康膳食具有重要意義。

葉黃素具有熱不穩(wěn)定性，低溫避光保存蔬菜水果能夠有效防止其所含葉黃素發(fā)生異構(gòu)化或者降解[3]。本文采用超聲波輔助有機(jī)溶劑提取常見果蔬中的葉黃素，對(duì)萃取劑的種類，萃取溫度，萃取時(shí)間，堿度等實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到了最佳實(shí)驗(yàn)條件，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下建立了一種簡(jiǎn)便，高效，可信度高的紫外可見分光光度法對(duì)葉黃素含量進(jìn)行測(cè)定的方法，并對(duì)承德市售常見果蔬中葉黃素的含量進(jìn)行了測(cè)定。

1 儀器與試劑

1.1 試劑

葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品(純度89%)購自斯坦福分析化學(xué)公司；無水乙醇(分析純)，甲醇(分析純)，乙酸乙酯(分析純)，環(huán)己烷(分析純)，二氯甲烷(分析純)，石油醚(分析純)，四氫呋喃(分析純)購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉購自天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器

紫外可見分光光度計(jì)(T6)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；超聲波清洗器(KQ-100E)，昆山市超聲儀器有限公司；離心機(jī)(800)，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；粉碎機(jī)(BJ-150)，永康市鉑歐五金制品有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)步驟

2.1 溶液的配制

2.1.1 葉黃素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

準(zhǔn)確稱取0.010 0 g葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品(89%)于燒杯中，用無水乙醇溶解后定量轉(zhuǎn)移至100 mL的容量瓶，定容，搖勻，配制成濃度為100 μg/mL葉黃素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，冷藏避光保存。

2.1.2 不同濃度的NaOH無水乙醇溶液的配制

分別稱取0.5 g，1.0 g，2.0 g，3.0 g，4.0 g，5.0 g NaOH于小燒杯中，用無水乙醇溶解，制成濃度為5%，10%，20%，30%，40%，50%的NaOH無水乙醇溶液備用。

2.2 樣品預(yù)處理

用自來水將蘋果洗凈，用蒸餾水沖洗，避光晾干，蘋果去核切片，香蕉去皮切片，菠菜和甘藍(lán)去除壞葉，在電子天平上稱量20.000 0 g；烘箱溫度設(shè)定為60 ℃，準(zhǔn)確稱取烘干后蘋果片、香蕉片、菠菜和甘藍(lán)的質(zhì)量；將烘干的蘋果片、香蕉片、菠菜和甘藍(lán)用粉碎機(jī)粉碎，研磨，過60目篩[4]。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用移液槍分別移取50 μL，100 μL，150 μL，200 μL，250 μL葉黃素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于樣品瓶中，分別加入無水乙醇2 450 μL、2 400 μL、2 350 μL、2 300 μL、2 250 μL，搖勻，配制成終濃度為2 μg/mL，4 μg/mL，6 μg/mL，8 μg/mL，10 μg/mL葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液。

以4 μg/mL葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液為待測(cè)樣品，以無水乙醇為空白樣品，用紫外可見分光光度計(jì)在440～490 nm波長(zhǎng)范圍，每間隔1 nm測(cè)定其吸光度，繪制葉黃素的吸收曲線，并確定其最大吸收波長(zhǎng)。

在最大吸收波長(zhǎng)下，以無水乙醇作為空白樣品，分別測(cè)定0 μg/mL，2 μg/mL，4 μg/mL，6 μg/mL，8 μg/mL，10 μg/mL葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，以葉黃素的濃度c為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制葉黃素的標(biāo)準(zhǔn)吸收曲線。

2.4 超聲波輔助有機(jī)溶劑萃取條件的優(yōu)化

2.4.1 萃取劑的優(yōu)化

稱取7份0.020 0 g菠菜粉末分別放入50 mL燒杯中，依次加入四氫呋喃，石油醚，無水乙醇，甲醇，環(huán)己烷，乙酸乙酯，二氯甲烷各24 mL，1 mL 30%的NaOH無水乙醇溶液，在超聲波功率100 W，溫度30 ℃條件下避光超聲30 min后，混合液離心3 min，取上清液，在紫外可見分光光度計(jì)上，在最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度。

2.4.2 萃取溫度的優(yōu)化

稱取5份0.020 0 g菠菜粉末分別放入50 mL燒杯中，各加入24 mL無水乙醇，1 mL 30%的NaOH無水乙醇溶液，依次在10 ℃，20 ℃，30 ℃，40 ℃，50 ℃，超聲波功率100 W的條件下，避光超聲30 min?；旌弦弘x心3 min，取上清液，在紫外可見分光光度計(jì)上，在最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度。

2.4.3 萃取時(shí)間的優(yōu)化

準(zhǔn)確稱取6份0.020 0 g菠菜粉末分別放入50 mL燒杯中，加入24 mL無水乙醇，1 mL 30%的NaOH無水乙醇溶液，在超聲波功率100 W，溫度30 ℃下，避光超聲時(shí)間分別為10 min，20 min，30 min，40 min，50 min，60 min，混合液離心3 min，取上清液，在紫外可見分光光度計(jì)上，在最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度。

2.4.4 堿度的優(yōu)化

準(zhǔn)確稱取6份0.020 0 g菠菜粉末分別放入50 mL燒杯中，各加入24 mL無水乙醇，依次加入5%，10%，20%，30%，40%，50% NaOH無水乙醇溶液各1 mL，在30 ℃下，超聲波功率100 W下，避光超聲30 min。混合液離心3 min，取上清液，在紫外可見分光光度計(jì)上，在最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度。

2.5 承德市售常見果蔬中葉黃素含量的測(cè)定

2.5.1 樣品中葉黃素含量的測(cè)定

分別稱取蘋果粉末1.000 0 g，香蕉粉末1.000 0 g，菠菜粉末0.020 0 g，甘藍(lán)粉末0.100 0 g于5個(gè)50 mL燒杯中，各加入24 mL無水乙醇， 1 mL 30%的NaOH無水乙醇溶液，在超聲波功率100 W，溫度30 ℃下，避光超聲50 min，混合液離心3 min，取上清液，在紫外可見分光光度計(jì)上，在最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度。

3 結(jié)果與討論

3.1 葉黃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)不同波長(zhǎng)下葉黃素的吸光度繪制其吸收曲線(圖1)，發(fā)現(xiàn)在452 nm和482 nm處出現(xiàn)峰值。其中波長(zhǎng)為452 nm處溶液吸光度為0.451，波長(zhǎng)為482 nm處溶液吸光度為0.403，因此，確定葉黃素的最大吸收波長(zhǎng)為452 nm。根據(jù)葉黃素的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液在452 nm波長(zhǎng)下的吸光度繪制葉黃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)。葉黃素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液在0～10 μg/mL范圍內(nèi)線性回歸方程為Y=0.111 31X+0.001 1，相關(guān)系數(shù)R=0.999 87，線性關(guān)系良好，準(zhǔn)確度較高，可以用于葉黃素的定量分析。

3.2 溶劑種類對(duì)萃取液中葉黃素含量的影響

葉黃素作為一種脂溶性色素，不溶于水，溶于有機(jī)溶劑[3]。通過對(duì)不同溶劑作為萃取劑時(shí)萃取液中葉黃素的含量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)萃取液中葉黃素的含量大小順序?yàn)榧状?四氫呋喃>無水乙醇>石油醚>二氯甲烷>環(huán)己烷>乙酸乙酯，甲醇的萃取效果最好。其中，甲醇，四氫呋喃，無水乙醇，石油醚，二氯甲烷作為萃取劑時(shí)萃取效率相差不大，考慮到綠色環(huán)保及節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本，選擇無水乙醇作為萃取劑。

3.3 萃取溫度對(duì)萃取液中葉黃素含量的影響

通過對(duì)不同萃取溫度下萃取液中葉黃素的含量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)隨著萃取溫度的升高，萃取液中葉黃素的含量逐漸增大，當(dāng)萃取溫度為30 ℃時(shí)，萃取液中葉黃素的含量最大。萃取溫度繼續(xù)升高，葉黃素的含量反而逐漸減小(圖4)。這是可能由于當(dāng)萃取溫度低于30 ℃時(shí)，隨著萃取溫度越高，葉黃素越容易溶解到萃取劑中，當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)，葉黃素在萃取劑中的溶解達(dá)到飽和，萃取溫度繼續(xù)升高，會(huì)使部分葉黃素發(fā)生降解或者異構(gòu)化，反而使葉黃素的含量降低。因此，確定30 ℃作為最佳萃取溫度。

3.3 萃取時(shí)間對(duì)萃取液中葉黃素含量的影響

通過對(duì)不同萃取時(shí)間下萃取液中葉黃素的含量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，萃取液中葉黃素的含量逐漸增大，當(dāng)萃取時(shí)間為50 min時(shí)，萃取液中葉黃素的含量最大。50 min以后，萃取液中葉黃素含量減小(圖5)，這是可能是由與當(dāng)萃取時(shí)間超過50 min以后，部分葉黃素被空氣中的氧氣氧化分解，使葉黃素的含量下降。因此，確定50 min作為最佳萃取時(shí)間。

3.3 NaOH濃度對(duì)萃取液中葉黃素含量的影響

葉黃素是一種廣泛存在與蔬菜、水果中的天然色素，但其存在形式有差別，在綠色蔬菜、水果中存在的葉黃素以游離非酯化形式存在，在黃色或橙色水果、蔬菜中的葉黃素以葉黃素酯的形式存在，需進(jìn)行皂化處理[1]。同時(shí)皂化反應(yīng)可被用來去除萃取物中的脂肪和葉綠素，減少對(duì)葉黃素測(cè)定的干擾[5]。通過測(cè)定不同NaOH濃度下萃取液中葉黃素的含量，發(fā)現(xiàn)隨著NaOH濃度的增大，萃取液中葉黃素的含量逐漸增大，當(dāng)NaOH濃度為40%時(shí)，葉黃素的含量最大。當(dāng)NaOH濃度繼續(xù)增加時(shí)，葉黃素的含量反而減小(圖6)。這說明雖然增加NaOH的濃度促進(jìn)葉黃素酯解離為葉黃素單體，去除萃取物中脂肪和葉綠素對(duì)葉黃素測(cè)定的干擾，但是NaOH的濃度過高，會(huì)影響葉黃素的穩(wěn)定性，反而使葉黃素的含量減少。因此，確定最佳NaOH濃度為40%。

3.4 承德市售常見果蔬中葉黃素含量的測(cè)定

以無水乙醇作為萃取劑，在30 ℃下萃取50 min作為最佳果蔬中葉黃素的萃取條件，以NaOH含量為40%，對(duì)承德市售四種常見果蔬中葉黃素含量進(jìn)行了測(cè)定(見表1)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：新鮮果蔬中葉黃素含量的大小順序?yàn)椋翰げ?甘藍(lán)>蘋果>香蕉。

表1 承德市售常見果蔬中葉黃素的含量

3.4 實(shí)驗(yàn)方法的精密度

取4 μg/mL葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液，在紫外可見分光光度計(jì)上，在最大吸收波長(zhǎng)452 nm下測(cè)定其吸光度，該樣本中葉黃素含量的測(cè)定重復(fù)性系數(shù)為0.079%(見表2)。

表2 實(shí)驗(yàn)方法精密度

3.5 實(shí)驗(yàn)方法的加標(biāo)回收率

取5.0 mL果蔬萃取上清液(蘋果、香蕉、菠菜、甘藍(lán))至比色管中，分別加入1.0 mL濃度為4 μg/mL葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液，加無水乙醇溶液定容到10 mL。在紫外可見分光光度計(jì)上，在波長(zhǎng)452 nm下測(cè)定其吸光度，平行三次實(shí)驗(yàn)，計(jì)算葉黃素的含量，并計(jì)算加樣回收率(表3)。承德市售四種常見果蔬中加標(biāo)回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.61%，3.839%，4.44%，0.59%，能夠滿足檢測(cè)實(shí)際樣品的檢測(cè)需要。

表3 承德市售常見果蔬樣品加標(biāo)回收率

4 結(jié)論

本文建立了一種紫外可見分光光度法測(cè)定承德市售常見果蔬中葉黃素含量的方法。葉黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.001 1X+0.111 31，R2=0.999 7，葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液在0～10 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。通過對(duì)超聲波輔助提取承德市售常見果蔬中葉黃素的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳萃取條件為以無水乙醇作為萃取劑，萃取溫度為30 ℃，萃取時(shí)間為50 min，NaOH的含量為40%。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)承德市售常見果蔬中葉黃素的含量進(jìn)行了測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：承德市售常見的四種果蔬中葉黃素含量高低順序?yàn)椴げ?甘藍(lán)>蘋果>香蕉，其中新鮮菠菜中葉黃素含量最高為0.386 mg/g。該方法加標(biāo)回收率能夠滿足檢測(cè)實(shí)際樣品的檢測(cè)需要，可以用于葉黃素的定量分析。