布雷菲德菌素A對(duì)蕨類植物卵發(fā)育的影響

郭嚴(yán)冬 曹建國(guó) 周義峰 戴錫玲 王全喜 張明霞

（1. 江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所，南京 210014；2. 上海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200234）

蕨類植物的位置在植物界中較為特殊，是介于苔蘚植物與種子植物之間的一個(gè)過(guò)渡類群，具有孢子體和配子體2 個(gè)世代，且2 個(gè)世代均能存活，這在植物界是獨(dú)有的。目前對(duì)蕨類植物的研究主要集中在形態(tài)學(xué)、系統(tǒng)分類以及新分布等方面。水蕨（L.Brongn.）作為蕨類植物的模式植物，其高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器較為典型。相關(guān)研究結(jié)果表明：受精孔是精子進(jìn)入卵細(xì)胞的通道，對(duì)研究蕨類植物有性生殖生物學(xué)具有重要的作用。課題組在前期研究的基礎(chǔ)上推測(cè)受精孔的形成可能與卵細(xì)胞和腹溝細(xì)胞中的多種細(xì)胞器（如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、囊泡、胞間連絲等）密切相關(guān)。但受精孔在蕨類植物中發(fā)生的普遍性、細(xì)胞發(fā)生機(jī)制、生物學(xué)功能和演化意義等仍未可知。

相關(guān)研究結(jié)果表明：布雷菲德菌素A（brefeld?in A，BFA）可誘導(dǎo)高爾基體的分解，反競(jìng)爭(zhēng)性抑制蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體，抑制蛋白質(zhì)從高爾基體的運(yùn)輸。Shaw 等研究發(fā)現(xiàn)，BFA對(duì)分泌系統(tǒng)（包括高爾基體的變化、大囊泡的形成、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)匾囊的增多）具有顯著效果，阻止了高爾基體分泌物的運(yùn)輸。國(guó)內(nèi)關(guān)于BFA 的研究還主要集中在抗癌細(xì)胞中的作用等方面，且多數(shù)研究集中于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。而關(guān)于BFA 對(duì)植物的影響，尤其是對(duì)植物生殖發(fā)育的影響的研究還較少。水蕨因其孢子生活力很強(qiáng)、容易培養(yǎng)、生長(zhǎng)速度快、孢子萌發(fā)2周后配子體就能達(dá)到性成熟、精子器和頸卵器都直接暴露在配子體的表面而易于觀察等諸多優(yōu)點(diǎn)而成為一個(gè)很好的研究配子發(fā)生和相互作用的模型。鑒于此，本研究使用BFA 處理發(fā)育中的頸卵器，通過(guò)觀察高爾基體、囊泡等細(xì)胞器形態(tài)上一些可見(jiàn)的變化來(lái)探索高爾基體、囊泡等細(xì)胞器對(duì)卵膜和受精孔形成的影響，進(jìn)而探索受精孔形成的機(jī)制，為蕨類植物生殖生物學(xué)的研究提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

水蕨的孢子于2012 年10 月采自云南西雙版納植物園。將帶成熟孢子的葉片收集于標(biāo)本紙中，置于干燥通風(fēng)處使孢子自然散落。10 d后將孢子去雜并收集于硫酸紙袋中，置于冰箱中4 ℃保存?zhèn)溆谩{證標(biāo)本現(xiàn)存放于上海師范大學(xué)植物標(biāo)本室。

1.2 方法

采用參考文獻(xiàn)中的方法對(duì)成熟孢子進(jìn)行消毒和培養(yǎng)，用Nikon SMZ1500 解剖鏡和Nikon E800光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察并照相記錄，待配子體上長(zhǎng)出幼嫩頸卵器后，挑選一批配子體（大于30 個(gè)）放入不同質(zhì)量濃度（5、50、100 μg·mL）的BFA 溶液中，然后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)10、20、30 h，共9 組，各重復(fù)3 次。對(duì)照組為未進(jìn)行任何處理的水蕨配子體（長(zhǎng)出頸卵器）。

每隔10 h從不同質(zhì)量濃度的BFA 溶液中挑選出一批（大于10 個(gè)）水蕨配子體放入0.1 mol·L磷酸緩沖液配制的體積分?jǐn)?shù)3%的戊二醛中室溫固定6 h，經(jīng)相同緩沖液沖洗后，用體積分?jǐn)?shù)2%的鋨酸后固定2 h。系列丙酮（體積分?jǐn)?shù)50%、70%、90%、100%）脫水后，用Spurr’s 樹(shù)脂滲透并包埋，經(jīng)70 ℃聚合9 h 得到包埋塊。半薄切片經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后，用Nikon E800 觀察和照相。超薄切片經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛染色后，用Hitachi-600 電鏡觀察和照相。

高碘酸-錫夫反應(yīng)（PAS）：半薄切片用自來(lái)水浸泡1 min，1%的高碘酸氧化30 min，自來(lái)水沖洗，錫夫試劑染色30 min，用自來(lái)水沖洗1 min，亞硫酸鈉漂洗液漂洗3 次，每次2 min，自來(lái)水沖洗3 min，蒸餾水經(jīng)過(guò)，自然干燥，光學(xué)顯微鏡觀察并照相。

蘇丹黑B 反應(yīng)：半薄切片用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇浸泡1～2 min，用新鮮配制的體積分?jǐn)?shù)0.3%蘇丹黑B液（體積分?jǐn)?shù)70%乙醇配制）在40 ℃條件下染色30 min；體積分?jǐn)?shù)70%乙醇分色1 min，自來(lái)水沖洗，蒸餾水經(jīng)過(guò)，自然干燥，光學(xué)顯微鏡觀察并照相。

2 結(jié)果和分析

對(duì)制備的9個(gè)處理組樣品觀察后發(fā)現(xiàn)：經(jīng)不同質(zhì)量濃度BFA 處理不同時(shí)間后的水蕨均受到不同程度的影響，其中以50 μg·mLBFA 處理30 h的處理組的各器官表型性狀變化較為典型，因此，以該處理組（經(jīng)50 μg·mLBFA 處理30 h）的樣品與對(duì)照組（未經(jīng)BFA 處理）的樣品進(jìn)行比較。觀察結(jié)果（見(jiàn)圖版Ⅰ）表明：對(duì)照組發(fā)育卵中期的水蕨（見(jiàn)圖版Ⅰ：A1）卵細(xì)胞較大、呈杯型，細(xì)胞核體積也較大、呈弓狀，核仁呈圓形，細(xì)胞內(nèi)包含高爾基體、線粒體以及質(zhì)體等細(xì)胞器；卵細(xì)胞和腹溝細(xì)胞間的受精孔清晰可見(jiàn)，二者間的分離腔內(nèi)僅有極少量的泡狀分泌物。處理組的卵細(xì)胞及細(xì)胞核整體形態(tài)與對(duì)照組基本一致，但在細(xì)胞核上方和卵膜下方均分布著大量的嗜鋨性囊泡，分離腔中充滿了絮狀物質(zhì)，核仁中也呈現(xiàn)較小且數(shù)量較多的白色泡狀物質(zhì)（見(jiàn)圖版Ⅰ：B1）。組織定位顯示：對(duì)照組的分離腔較空（見(jiàn)圖版Ⅰ：A2），處理組腔內(nèi)染色較深（見(jiàn)圖版Ⅰ：B2），高碘酸-錫夫反應(yīng)（PAS）顯示處理組分離腔內(nèi)充滿著多糖類物質(zhì)（見(jiàn)圖版Ⅰ：B3）。對(duì)照組受精孔周圍的卵膜較厚，有明顯的層次，膜下有少量的嗜鋨性囊泡，受精孔下方有較多的線粒體和少量的高爾基體分布（見(jiàn)圖版Ⅰ：A3～A4）；處理組卵細(xì)胞受精孔及其附近的卵膜基本上由數(shù)量較多、大小不一的囊泡組成，也有較多的線粒體分布（見(jiàn)圖版Ⅰ：B4～B5）。

圖版Ⅰ 布雷菲德菌素A對(duì)蕨類植物卵發(fā)育的影響A1～A4.對(duì)照組；B1～B5.處理組；VCC.腹溝細(xì)胞；SeC.分離腔；P.質(zhì)體；N.細(xì)胞核；E.卵細(xì)胞；NCC.頸溝細(xì)胞；FP.受精孔；M.線粒體；EM.卵膜；OM.嗜鋨物質(zhì)PlateⅠ Effect of brefeldin A on the development of fern egg A1?A4.Control group；B1?B5.Treatment group；VCC.Ventral canal cell；SeC.Separation cavity；P.Plastid；N.Nucleus；E.Egg；NCC.Neck canal cell；FP.Fertilization pore；M.Mitochondrion；EM.Egg membrane；OM.Osmiophilic material

從細(xì)胞器看，對(duì)照組卵細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體發(fā)達(dá)，且數(shù)量較多（見(jiàn)圖版Ⅱ：A5～A6），而處理組的卵細(xì)胞中則基本上觀察不到完整的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，出現(xiàn)較多的是囊泡和嗜鋨性囊泡（見(jiàn)圖版Ⅱ：B7～B8）。增加放大倍數(shù)可見(jiàn)，對(duì)照組的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體基本完整、連續(xù)（見(jiàn)圖版Ⅱ：A7），而處理組的高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)已斷裂，被斷裂的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)包裹（見(jiàn)圖版Ⅱ：B9～B10）。值得注意的是，頸卵器周圍的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞中也出現(xiàn)了一個(gè)較為明顯的變化，對(duì)照組細(xì)胞中質(zhì)體分布較為分散（見(jiàn)圖版Ⅱ：A8），而處理組營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞中的質(zhì)體則出現(xiàn)“聚集”的現(xiàn)象（見(jiàn)圖版Ⅱ：B11～B12）。

圖版Ⅱ 布雷菲德菌素A對(duì)蕨類植物卵發(fā)育的影響A5～A8.對(duì)照組；B6～B12.處理組；G.高爾基體；ER.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；Ver.膜性囊泡；Vo.嗜鋨性囊泡；Ve.囊泡；VC.營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞Plate Ⅱ Effect of brefeldin A on the development of fern egg A5?A8.Control group；B6?B12.Treatment group；G.Golgi body；ER.Endoplasmic reticulum；Ver.Reticulum vesicle；Vo.Osmiophilic vesicles；Ve.Vesicle；VC.Vegetative cell

3 討論

Keidan 等認(rèn)為，向?qū)?shù)生長(zhǎng)期的紫球藻（）中添加（10～25 μmol·L）BFA 會(huì)降低結(jié)合多糖和可溶性多糖的含量，但用20 μmol·LBFA 處理穩(wěn)定期的紫球藻細(xì)胞對(duì)細(xì)胞壁結(jié)合多糖形成的抑制效果要強(qiáng)于可溶性多糖，說(shuō)明BFA 處理濃度和細(xì)胞發(fā)育時(shí)期的不同可能會(huì)有略微的差異，但總體的處理效果大致相同。超微結(jié)構(gòu)研究也表明：20 μmol·LBFA 處理細(xì)胞16 h 會(huì)破壞高爾基體的完整性。本研究中，設(shè)置不同的BFA 處理濃度和時(shí)間，經(jīng)大量觀察后發(fā)現(xiàn)各BFA 處理組的細(xì)胞均會(huì)受到不同程度的損傷，細(xì)胞中的高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器的完整性遭到破壞。Cros?ti 等的研究結(jié)果表明：BFA 處理會(huì)抑制蛋白質(zhì)從高爾基體的運(yùn)輸；Kartusch 等的研究結(jié)果表明：BFA 處理會(huì)影響分泌系統(tǒng)（包括高爾基體的堆疊、大囊泡的形成以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)扁囊的擴(kuò)展），甚至高質(zhì)量濃度（60 μg·mL）會(huì)導(dǎo)致高爾基體的分解，但對(duì)細(xì)胞壁無(wú)影響。頸卵器卵細(xì)胞中的受精孔與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體密切相關(guān)，本研究顯微觀察表明：BFA 處理后的卵細(xì)胞中的高爾基體較少，觀察到的幾個(gè)高爾基體的結(jié)構(gòu)也不完整；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)也遭到了破壞；小囊泡的數(shù)量增多，這可能是因?yàn)槁鸭?xì)胞中的分泌系統(tǒng)遭到破壞，原本應(yīng)該被運(yùn)輸?shù)铰鸭?xì)胞上方用于卵膜形成的蛋白質(zhì)和脂類等物質(zhì)的結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致形成的卵膜不典型（由多個(gè)囊泡堆疊形成）。對(duì)照組的卵細(xì)胞和腹溝細(xì)胞間的物質(zhì)交換是通過(guò)受精孔在線粒體供能的條件下完成的，分離腔基本無(wú)分泌物；而處理組的卵細(xì)胞由于卵細(xì)胞上方的卵膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，受精孔形成不典型，卵細(xì)胞中的物質(zhì)會(huì)通過(guò)整個(gè)卵細(xì)胞上方卵膜與腹溝細(xì)胞進(jìn)行物質(zhì)運(yùn)輸，分離腔內(nèi)充滿了分泌物，進(jìn)而影響整個(gè)頸卵器的發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn)，盡管BFA 處理會(huì)影響膜分泌系統(tǒng)，會(huì)影響小囊泡在高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的“出芽”和“融合”，但在高爾基體未被完全分解的條件下，分泌系統(tǒng)仍然會(huì)行使其功能；值得注意的是處理組細(xì)胞中質(zhì)體出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，這可能是因?yàn)锽FA 處理會(huì)導(dǎo)致膜性細(xì)胞器的破壞，包裹淀粉粒的膜數(shù)量減少，細(xì)胞體通過(guò)這種“聚集”來(lái)緩解藥物所帶來(lái)的損耗。

相關(guān)研究結(jié)果顯示：較難總結(jié)出BFA 處理的推薦抑制濃度，即使在較高濃度的BFA 處理下，僅通過(guò)洗脫藥物，就可以使細(xì)胞表型得到恢復(fù)；且對(duì)擬南芥（L.Heynh.）的研究中發(fā)現(xiàn)BFA處理會(huì)導(dǎo)致“BFA-compartments”的形成，即反面高爾基體網(wǎng)絡(luò)/早期核內(nèi)體膜的大集合體。本研究中的處理組細(xì)胞中基本無(wú)高爾基體堆疊，僅有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)包裹著斷裂的高爾基體片段。這也從另一個(gè)方面驗(yàn)證了本研究的結(jié)論，即處理組卵細(xì)胞中的高爾基體等膜性細(xì)胞器雖然遭到破壞，但不典型的卵膜和受精孔仍然可以形成，與腹溝細(xì)胞的物質(zhì)運(yùn)輸也可以進(jìn)行。BFA 具體的破壞程度與受精孔的形成的具體關(guān)系，可進(jìn)一步借助內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體特異性熒光探針進(jìn)行進(jìn)一步的研究，以期為明確蕨類植物卵細(xì)胞中的細(xì)胞器如何分工合作形成受精孔奠定基礎(chǔ)。下一步通過(guò)洗脫藥物觀察幼嫩頸卵器（即受精孔還未開(kāi)始形成），觀察受精孔是否可以正常形成，來(lái)進(jìn)一步探索細(xì)胞器在頸卵器發(fā)育過(guò)程中的作用。

綜上所述，BFA 會(huì)對(duì)卵細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等膜性細(xì)胞器造成破壞，影響分泌系統(tǒng)的正常功能，進(jìn)而影響卵膜及受精孔的形成。