趙笑，白沙沙，孔凡華，徐佳佳，柴艷兵，張耀廣，李興佳，李飛，李東，崔亞娟

（1.北京市營養(yǎng)源研究所，北京100069；2.石家莊君樂寶乳業(yè)有限公司，石家莊050221；3.河北君樂寶君源乳業(yè)有限公司，石家莊050011；4.北京市科學(xué)技術(shù)研究院，北京100089）

0 引言

乳清蛋白主要含有α-乳白蛋白和β-乳球蛋白等[1]?；钚匀榍宓鞍着c一般的乳清蛋白相比，具有更高的營養(yǎng)價值[2]。牛乳加熱可促進(jìn)蛋白質(zhì)相互作用并形成聚集體[3]。加熱溫度在70℃以上時，可導(dǎo)致β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的變性[4]。目前，加熱牛奶時產(chǎn)生的蛋白質(zhì)變性和結(jié)構(gòu)改變已被廣泛研究[5-6]，然而面對市場上各式各樣的液態(tài)乳產(chǎn)品，更多人關(guān)注的是牛乳中所含有的活性蛋白質(zhì)究竟有多少。

高效液相色譜法（HPLC）是測定乳蛋白質(zhì)量濃度最常用的方法[7-9]。但該方法用時較長且穩(wěn)定性存在差異[10-11]。因此，本文建立了反相高效液相色譜法（RPHPLC），測定了市售乳中活性蛋白的質(zhì)量濃度，為液態(tài)乳的加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低溫存放（2~6℃）的液態(tài)乳（編號D1-D 12，D28，D29，D30，其中D 3為高溫殺菌乳，D12，D29，D30為滅菌乳，其余為巴氏殺菌乳）和常溫存放的液態(tài)乳（編號C13-C27，均為高溫滅菌乳）購自北京當(dāng)?shù)爻?；原料乳（編號Y31-Y35）由北京當(dāng)?shù)啬翀鎏峁沪?乳白蛋白（α-lactalbumin，α-La，純度≥85%）、β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-LgA和β-LgB，純度≥90%）標(biāo)準(zhǔn)品購自美國Sigma公司；乙腈為液相色譜級；檸檬酸鈉、鹽酸胍、丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、巰基乙醇等其他試劑均為分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

數(shù)顯p H計FE20，梅特利-托利多（上海）儀器有限公司；高速冷凍離心機CR 21Ⅲ，日本HITACHI公司；臺式高速離心機5424，德國Eppendorf公司；蛋白電泳系統(tǒng)（Mini-Protean，PowerPac Basic），美國Bio-Rad公司；全自動凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司；高效液相色譜（UltiMate 3000），美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 pH 4.6沉淀乳蛋白

取液態(tài)乳樣品10 mL，加入30 mL蒸餾水，混勻后用純乙酸調(diào)節(jié)p H至4.6。沉淀后的樣品經(jīng)6 000 r/min離心10 min，取上清作進(jìn)一步研究。

1.3.2 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）

SDS-PAGE是根據(jù)Laemmli[12]中敘述的方法進(jìn)行并有所改動。樣品處理液配置為2%SDS，50%甘油，10%SDS和Tris-HCl的混合液，4%巰基乙醇，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的溴酚藍(lán)。為了使結(jié)果對比更簡明清晰，減少實驗樣品量，從隨機編號的15個低溫乳和15個隨機編號的常溫乳中各選擇5個樣品，5個隨機編號的原料乳中選擇2個樣品，即樣品D1~D5，C13~C17，Y31，Y32，經(jīng)p H 4.6沉淀后與樣品處理液以3∶1的比例混勻，未經(jīng)p H 4.6沉淀的樣品（D1~D5，C13~C17，Y31，Y32），在4℃條件下，轉(zhuǎn)速為6 000 r/min離心10 min去除上層脂肪后，與樣品處理液以3∶1的比例混勻，將上述樣品沸水浴5 min，冷卻至室溫，使用臺式高速離心機室溫條件下轉(zhuǎn)速5 000 r/min離心5 min，離心后取上清直接上樣，上樣量為5μL。濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.5%，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.5%。電壓程序的設(shè)定如下：將電壓保持恒定在70 V，直到樣品到達(dá)濃縮膠和分離膠之間的交界處，然后降低到50 V，直到樣品到達(dá)分離膠結(jié)束前1.5 cm的位置。取下蛋白凝膠用質(zhì)量濃度為0.1 g/L考馬斯亮藍(lán)R 250染色20 min，并配置甲醇∶冰醋酸∶去離子水比例為250∶70∶680（體積比）的洗脫液，進(jìn)行脫色處理，使用全自動凝膠成像系統(tǒng)對凝膠進(jìn)行掃描和軟件分析。

1.3.3 液相色譜樣品前處理

取1.3.1中經(jīng)pH 4.6沉淀后的液態(tài)乳樣品上清液，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，打入液相小瓶后直接上樣。

1.3.4 儀器條件

Waters ACQUITY UPLC 300 Protein BEHC4色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7μm)；檢測波長為280 nm；柱溫為60℃；進(jìn)樣量為10μL；流速為0.45 m L/min。

1.3.5 色譜條件

流動相分為A液和B液：A液為0.1%TFA水溶液，B液為0.1%TFA乙腈溶液，進(jìn)行梯度洗脫。梯度洗脫程序如下：0~1.5 min，5%B；1.5~2.5 min，5%~38%B；2.5~6.5 min，38%~41%B；6.5~7.6 min，41%~95%B；7.6~8.0 min，保持95%B；8.0~8.1 min，95%~5%B；8.1~10.0 min，5%B。

1.3.6 精密度和穩(wěn)定性實驗

根據(jù)SDS-PAGE結(jié)果和預(yù)實驗測定，選擇α-La，β-LgA和β-LgB質(zhì)量濃度中等，具有代表性的樣品D4，進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性和回收率的實驗。

精密度實驗設(shè)計：選取D4樣品，將樣品按照

1.3.1 處理后，精密吸取10μL樣液，在1.3.5條件下平行測定6次，計算α-La，β-LgA，β-LgB質(zhì)量濃度和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

穩(wěn)定性實驗設(shè)計：選取D4樣品，將樣品按照1.3.1處理后，平行操作6份，在1.3.5條件下，進(jìn)樣測定，計算α-La，β-LgA，β-LgB質(zhì)量濃度和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.7 標(biāo)準(zhǔn)品回收率實驗

選取D4樣品，將樣品按照1.3.1處理后，每種標(biāo)準(zhǔn)蛋白（α-La，β-LgA，β-LgB）分別加入一定數(shù)量。測定添加標(biāo)準(zhǔn)蛋白前后樣品中各蛋白質(zhì)組分的總質(zhì)量濃度，并計算標(biāo)準(zhǔn)樣品的回收率。加標(biāo)回收率（%）=(加標(biāo)試樣測定值-試樣測定值)/加標(biāo)量×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH4.6沉淀前后樣品中蛋白差異電泳分析

為更好的分析牛乳活性蛋白，了解經(jīng)p H 4.6沉淀后，牛乳中不同蛋白的保留情況，選取部分原料乳、常溫和低溫保存的牛乳，對其p H 4.6沉淀前后樣品中的蛋白進(jìn)行了SDS-PAGE電泳分析。結(jié)果如圖1所示。圖1中，M為標(biāo)準(zhǔn)分子蛋白Marker，圖1（a）中泳道2~10和圖1（b）中泳道2~4為樣品經(jīng)p H 4.6沉淀后蛋白電泳，圖1（b）中泳道5~10和圖1（b）中泳道2~7為樣品未經(jīng)pH 4.6沉淀的蛋白電泳。由圖1可以看出，未經(jīng)pH 4.6沉淀的牛乳中酪蛋白（αs1-CN，αs2-CN，β-CN，κ-CN）則完整的體現(xiàn)在SDS-PAGE圖譜中，其中κ-CN由于質(zhì)量濃度較低，其對應(yīng)的蛋白條帶顏色較淺。而經(jīng)p H 4.6沉淀后大部分的酪蛋白均被除去，剩余的蛋白中α-La，β-Lg，Lf和BSA的蛋白條帶較為清晰，但不同牛乳樣品中各組分的蛋白條帶清晰程度差異較為明顯。兩種原料乳中乳清蛋白條帶較為一致，而低溫存放的牛乳中，樣品D 2和D 3經(jīng)p H 4.6沉淀后，乳清蛋白條帶與其它低溫存放的牛乳樣品相比顯著模糊，常溫存放的牛乳樣品經(jīng)p H 4.6沉淀后，乳清蛋白條帶顏色均較淺。結(jié)果表明p H 4.6沉淀可以很好的除去酪蛋白和變性的乳清蛋白，而不同熱處理的商品液態(tài)乳中的乳清蛋白的變性程度不同，導(dǎo)致乳清蛋白中非變性活性乳蛋白在SDS-PAGE圖譜中顯示出粗細(xì)不同的條帶。

圖1樣品經(jīng)pH4.6沉淀前后蛋白電泳結(jié)果

2.2 RP-HPLC方法的建立

2.2.1 方法精密度和穩(wěn)定性結(jié)果

為了進(jìn)一步分析液態(tài)乳中活性乳白蛋白和乳球蛋白的質(zhì)量濃度，建立了RP-HPLC法。該方法的精密度和穩(wěn)定性如表1所示。由表1可知樣品經(jīng)6次平行測定后，α-La，β-LgA，β-LgB質(zhì)量濃度的平均值和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為1.1129 g/L，1.4480 g/L，0.8004 g/L和0.49%，1.37%，1.17%。6個平行樣品測定中α-La，β-LgA，β-LgB質(zhì)量濃度平的均值和相對標(biāo)準(zhǔn) 偏 分 別 為1.1411 g/L，1.4459 g/L，0.7767 g/L和4.29%，6.61%，7.62%。表明在280 nm波長下測定樣品質(zhì)量濃度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，因此采用該方法對液態(tài)乳樣品中這3種主要活性蛋白組分的定量檢測結(jié)果具有很好的穩(wěn)定性，符合檢測要求。

表1方法的精密度和重復(fù)性 g/L

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品回收率結(jié)果分析

不同標(biāo)準(zhǔn)蛋白組分在液態(tài)乳樣品中的回收率結(jié)果表明了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在測定過程中的損失，損失越少則回收率越高。本研究中，α-La，β-LgA，β-LgB標(biāo)準(zhǔn)蛋白的回收率均在95%以上，且相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在5%以下,見表2。結(jié)果說明該方法在液態(tài)乳定量測定中具有很好的回收率。

表2方法的標(biāo)準(zhǔn)回收率 mg/mL

2.3 樣品中活性蛋白組分質(zhì)量濃度的測定結(jié)果

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立與譜圖分析

本實驗采用外標(biāo)法，以峰面積(mAU)為Y軸，以質(zhì)量濃度（mg/mL）為X軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。α-La、β-LgB和β-LgA按照單峰面積進(jìn)行統(tǒng)計計算，測定系數(shù)分別為0.9984，0.9986和1,見表3。通過表3中的標(biāo)準(zhǔn)方程和測定系數(shù)，證明了該方法在各自蛋白濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

表3標(biāo)準(zhǔn)蛋白的線性方程和相關(guān)系數(shù)

分別選取蛋白標(biāo)準(zhǔn)（圖2（a））、原料乳樣品Y32（圖2（b）），低溫保存乳樣品D 7（圖2（c）），常溫保存乳樣品C13（圖2（d））的圖譜進(jìn)行對比分析。由圖2可知，3個目標(biāo)蛋白在5~10 min內(nèi)全部被洗脫，按照出峰順序?qū)?yīng)的目標(biāo)蛋白依次為α-La、β-LgB和β-LgA。由圖譜可知3種蛋白在標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中均得到了很好的基線分離，其中圖2（b）和圖2（c）中3種蛋白峰型比較一致，而圖2（d）中蛋白峰面積很小，尤其是蛋白β-LgB所在位置的峰幾乎檢測不出，表明該樣品中β-LgB蛋白質(zhì)量濃度很低。

2.3.2 樣品中活性α-La測定結(jié)果分析

由圖3可知，5種原料乳樣品中活性α-La質(zhì)量濃度均高于1.32 g/L；而低溫保存樣品中，除D8，D9，D10，D11中α-La質(zhì)量濃度均高于2.00 g/L外，D1，D4，D5中α-La質(zhì)量濃度也較高，質(zhì)量濃度在（1.00~1.50）g/L之間，其余樣品α-La質(zhì)量濃度均較低，尤其是D12，D 29，D 30這3個樣品中α-La質(zhì)量濃度低于0.15 g/L；而常溫保存的樣品中活性蛋白α-La質(zhì)量濃度均低于0.16 g/L,其中C14樣品的α-La質(zhì)量濃度最高，為0.1551 g/L，其余常溫存放樣品的α-La質(zhì)量濃度均很低，因此未在圖3中表示。趙烜等[13]的研究表明α-La熱變性后無法自聚，但能與β-Lg、免疫球蛋白等形成聚集體，有利于縮短發(fā)酵時間，改善凝膠后的凝膠結(jié)構(gòu)，且高溫短時巴氏殺菌乳中α-乳白蛋白質(zhì)量濃度低于低溫巴氏殺菌乳中的質(zhì)量濃度。α-La在壓力和加熱條件下的動力學(xué)和熱力學(xué)參數(shù)表明α-La的變性為一個聚集式反應(yīng)[14]，同時，在加熱過程中，α-La的存在可導(dǎo)致位于乳鐵蛋白內(nèi)部的疏水殘基進(jìn)一步暴露，加速活性乳鐵蛋白的變性[15]。Lorenzen等[16]的研究中原料乳的α-La質(zhì)量濃度高于1.00 g/L，Boitz等[17]的報道中表明經(jīng)巴氏殺菌后的牛乳中α-La質(zhì)量濃度在1.020~1.152 g/L之間。相同熱處理時間內(nèi)，天然α-La的保留程度會隨著熱處理溫度的升高而顯著下降[18]。因此，本研究結(jié)果中樣品α-La的質(zhì)量濃度差異與前人研究結(jié)果相符合。

圖2蛋白標(biāo)準(zhǔn)和樣品的HPLC圖譜

2.3.3 樣品中活性β-Lg（β-LgA和β-LgB）測定結(jié)果分析

由圖4可知，5種原料乳樣品中β-LgA質(zhì)量濃度高于1.55 g/L，β-LgB質(zhì)量濃度高于0.95 g/L；低溫存放的樣品除D3，D12，D28，D29，D30質(zhì)量濃度低于0.10 g/L外，其余樣品中β-LgA和β-LgB質(zhì)量濃度在0.19~2.70 g/L之間。這是由于不同乳蛋白組分的變性溫度不同，β-Lg在溫度達(dá)到75℃時開始變性，且變性程度不僅與熱處理溫度密切相關(guān)還受持續(xù)時間的影響[19]。常溫存放的乳樣品中，25號樣品β-LgA的質(zhì)量濃度最高為0.0751 g/L，24號樣品β-LgB的質(zhì)量濃度最高為0.0218 g/L，其余常溫存放樣品的β-LgA和β-LgB質(zhì)量濃度均很低，未在圖4中標(biāo)出。有關(guān)研究表明經(jīng)巴氏殺菌的牛乳中β-Lg質(zhì)量濃度高于2.00 g/L，而經(jīng)超高溫瞬時滅菌的牛乳中β-Lg質(zhì)量濃度低于0.05 g/L[20]。Zhu等[21]的研究表明，在熱處理過程中β-LgB和β-LgA的變化趨勢相似，在55℃或65℃加熱時，β-LgB和β-LgA的變性程度性均不超過10%，而在95℃加熱5 min后，則幾乎全部發(fā)生變性。Bogahawaththa等[22]的研究表明75℃處理15 s基本不會使β-Lg及β-Lg與α-La的混合物蛋白變性。這些研究結(jié)果與我們的研究結(jié)果較為一致。也有研究表明β-Lg在70℃下加熱30 min，蛋白質(zhì)即展開，并形成不可逆的二聚反應(yīng)[23]。本研究中低溫存放的巴氏殺菌乳大多滿足國際乳品聯(lián)合會（International Dairy Federation，IDF）中要求的巴氏殺菌乳中β-Lg最低質(zhì)量濃度為2.60 g/L，高溫巴氏殺菌乳最低質(zhì)量濃度為2.00 g/L的標(biāo)準(zhǔn)[24]。

圖3樣品中α-乳白蛋白質(zhì)量濃度

圖4樣品中β-乳球蛋白的質(zhì)量濃度

2.3.4 樣品活性蛋白與保質(zhì)期關(guān)系的綜合分析

圖5顯示了樣品中活性蛋白α-La、β-LgA和β-LgB，及其總量與樣品保質(zhì)期的關(guān)系。當(dāng)保質(zhì)期小于1 d時，活性蛋白保持的均較好，保質(zhì)期在7，15，30 d內(nèi)時，與未經(jīng)過熱處理的原料乳相比，活性蛋白質(zhì)量濃度則有所降低，但不同樣品中活性蛋白的最終質(zhì)量濃度有所差異。其中D3樣品中蛋白質(zhì)量濃度較低，這與SDSPAGE圖譜中測定的D3樣品的結(jié)果一致。當(dāng)樣品保質(zhì)期在30~45 d內(nèi)時，活性蛋白質(zhì)量濃度均顯著降低，當(dāng)樣品（編號C13~C25）保質(zhì)期為180 d時，活性蛋白質(zhì)量濃度均低于0.24 g/L，因此未在圖5中表示。同理，Sabrina等[25]的報道中闡述了熱加工強度增加，可延長貨架期的同時也會不同程度的破壞乳蛋白，并可根據(jù)活性乳蛋白如β-Lg的質(zhì)量濃度來判斷乳及乳制品的熱加工程度。總之，液態(tài)牛乳經(jīng)巴氏殺菌后，只能殺死大部分致病微生物，還會留有一些無害或有益但致死條件比較高的微生物，之后還需要冷鏈儲存和運輸，保質(zhì)期相對較短，只有3 d到15 d不等，但該方法可保持牛奶的一些活性蛋白成分。而牛奶經(jīng)高溫殺菌后，所有的微生物幾乎被殺滅，但極高的溫度也會令牛奶中一些熱敏活性蛋白質(zhì)有所損失。

圖5樣品中活性蛋白質(zhì)量濃度與保質(zhì)期的關(guān)系

3 結(jié)論

市售液態(tài)牛乳經(jīng)p H 4.6沉淀后，酪蛋白和大部分變性的乳清蛋白可被除去，上清液中保留的活性α-乳白蛋白和β-乳球蛋白質(zhì)量濃度可用本研究建立的RP-HPLC方法在10 min內(nèi)快速準(zhǔn)確地檢出。經(jīng)巴氏殺菌后的牛乳中活性蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度與原料乳相比變化不大，甚至部分高于原料乳中活性蛋白測定量，而經(jīng)滅菌后低溫存放的牛乳中活性蛋白質(zhì)量濃度較低；經(jīng)高溫滅菌的牛乳中活性蛋白的保留很低；因此，經(jīng)巴氏殺菌后低溫存放的鮮牛奶能夠最大程度的保留乳中活性蛋白。