杜茹蕓，王亮，林毅侃

（上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院，上海200233）

0 引言

牛奶及其制品作為一種優(yōu)質(zhì)蛋白補(bǔ)充來(lái)源的食物，幾千年前就已經(jīng)被人類用來(lái)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)，也是目前世界上主流國(guó)家官方營(yíng)養(yǎng)推薦的食品之一。從營(yíng)養(yǎng)學(xué)的角度來(lái)看，牛奶及其制品可以滿足人類對(duì)于蛋白質(zhì)日常需求的20%~28%，其中年齡越小對(duì)于牛奶等乳制品的需求量也會(huì)越大[1-3]。乳制品中的活性蛋白，除了有著較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值外，還有諸多的生物活性功能，對(duì)于人體的腸道、血糖、血脂以及骨骼等都有不同的功效[4-7]。

牛乳蛋白質(zhì)主要分為酪蛋白和乳清蛋白，分別占牛乳蛋白質(zhì)的80%和20%。牛乳中的乳清蛋白又包括α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、乳鐵蛋白以及免疫球蛋白等，其中α-乳白蛋白是乳清蛋白中含量第二豐富的蛋白質(zhì)，約占乳清蛋白的20%。α-乳白蛋白的分子量較小，約為14 000 u，從而易于吸收，可以有效減輕老年人和嬰幼兒的腎臟負(fù)擔(dān)，是必需氨基酸和支鏈氨基酸的極好來(lái)源。α-乳白蛋白富含的色氨酸是神經(jīng)發(fā)育的重要因子，能夠顯著改善嬰幼兒以及成人的睡眠質(zhì)量。α-乳白蛋白在牛乳中含量較低，只占總蛋白的2%~3%。母乳中則含量較高，占總蛋白的20%~25%。因此越來(lái)越多的嬰幼兒配方乳粉額外添加α-乳白蛋白，使其含量接近母乳水平。其他一些針對(duì)特殊人群的配方粉中也可能添加了α-乳白蛋白[8-10]。

乳制品和嬰幼兒配方乳粉中α-乳白蛋白含量的檢測(cè)技術(shù)一直是研究熱點(diǎn)，常規(guī)的分析蛋白的方法包括免疫學(xué)方法（ELISA）、液相色譜法、毛細(xì)管電泳、LCMS的方法等等。其中ELISA的方法取決于抗體的特異性，成本較高并且定量的準(zhǔn)確性不能保證。毛細(xì)管電泳法受限于儀器的應(yīng)用沒(méi)有那么全面，很多企業(yè)和機(jī)構(gòu)都沒(méi)有配備。LC-MS方法需要酶解以及合成特異性的肽段，操作復(fù)雜，對(duì)于人員要求較高，且酶解過(guò)程不可控[11-18]。因此，液相色譜法相對(duì)來(lái)說(shuō)應(yīng)用最廣泛，由于α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的分子量太過(guò)接近，需要選取合適的體積排阻色譜柱對(duì)兩種蛋白進(jìn)行分離，從而準(zhǔn)確測(cè)得α-乳白蛋白的含量。

本研究選取了合適的體積排阻色譜柱，并且不僅針對(duì)于嬰幼兒配方產(chǎn)品，還將同樣有市場(chǎng)需求的乳清粉和牛乳中的α-乳白蛋白的含量檢測(cè)進(jìn)行了研究，從而開(kāi)發(fā)了一種可以同時(shí)用于檢測(cè)嬰幼兒配方牛乳粉、牛乳清粉以及牛乳中α-乳白蛋白含量的檢測(cè)方法，并且對(duì)市場(chǎng)上多批次的產(chǎn)品進(jìn)行了檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

40批次嬰幼兒配方乳粉和10批次牛奶來(lái)源于網(wǎng)絡(luò)及超市購(gòu)買(mǎi)、10批次乳清粉由企業(yè)提供。

α-乳白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（牛源，純度≥85%）、β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（牛源，純度≥85%），美國(guó)Sigma公司；β-巰基乙醇，上海普譽(yù)科貿(mào)有限公司；鹽酸胍(優(yōu)級(jí)純），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；β-巰基乙醇，美國(guó)Sigma公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、乙二胺四乙酸、鹽酸、氫氧化鈉（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters 2695高效液相色譜儀帶DAD檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司；MS304S電子分析天平（感量0.1 mg），瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；GL-88B漩渦混合器，其林貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 流動(dòng)相配制

緩沖溶液：稱取56.6 g磷酸氫二鈉、3.5 g磷酸二氫鈉和2.9 g乙二胺四乙酸，將其溶解到800 mL水中，測(cè)量p H，如有必要，用50%氫氧化鈉溶液或鹽酸將p H調(diào)節(jié)到7.0±0.5。將溶液轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶，用水定容至1 000 mL。

流動(dòng)相：稱取573 g鹽酸胍，置于1 000 mL廣口錐形瓶中，添加100 mL緩沖溶液，再用水將該溶液稀釋到約900 mL，同時(shí)不停攪拌，用50%氫氧化鈉溶液，將p H調(diào)節(jié)到7.0±0.5。將溶液轉(zhuǎn)移至1 000 m L容量瓶中，并用水定容至刻度。0.45μm濾膜過(guò)濾。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

由于β-乳球蛋白的分子量與α-乳白蛋白接近，是干擾α-乳白蛋白測(cè)定的主要蛋白，因此每次進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)樣品都需要加上β-乳球蛋白用于判定兩者的分離情況。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：根據(jù)每批次標(biāo)準(zhǔn)品提供的COA分析證書(shū)，稱取含有10 mg（精確到0.1 mg）α-乳白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和10 mg（精確到0.1 mg）β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，置于10 m L容量瓶，用水充分溶解后定容，作為α-乳白蛋白和β-乳球蛋白混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，濃度為1.0 mg/mL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液：分別移取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.25、0.5、1.25、2.5、5 m L至10 m L容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并定容至刻度，配成濃度為10、25、50、125、250、500 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配。分別取1.5 m L配置好的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，分別加入10μL 2-巰基乙醇，旋緊瓶蓋，劇烈振蕩10 s，置于室溫下2 h后再進(jìn)行高效液相色譜分析。制備好的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液應(yīng)在48 h內(nèi)測(cè)定。

1.3.3 樣品前處理

（1）牛奶：稱取0.5 g牛奶，置于10 m L容量瓶中，加入流動(dòng)相定容至10 mL，溶液備用。

（2）奶粉：稱取1.0 g奶粉，置于10 m L容量瓶中，加水使樣品溶解，如樣品溶解不完全，可使用超聲儀超聲，應(yīng)保持樣品溫度不高于30℃，樣品完全溶解后，加水定容至10 m L。吸取1.0 m L溶解后的樣品至10 m L容量瓶中，加流動(dòng)相定容至10 m L，溶液備用。

（3）乳清粉樣品：稱取1.0 g乳清粉樣品，置于100 mL容量瓶中，加水使樣品完全溶解后，用水定容至100 mL。吸取一定量溶解后的樣品至10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相進(jìn)行稀釋，使α-乳白蛋白的含量在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，溶液備用。

（4）還原反應(yīng)：取上述備用溶液1.5 m L，加入10μL 2-巰基乙醇，旋緊瓶蓋，劇烈振蕩10 s，置于室溫下2 h后再進(jìn)行儀器分析。制備好的樣品應(yīng)在48 h內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 色譜儀器條件

（1）高效液相色譜儀:Waters 2695帶二極管陣列檢測(cè)器；色譜柱：體積排阻色譜保護(hù)柱：MAbPac SEC-1G 5μm（4 mm×50 mm）；體積排阻色譜柱：兩根M AbPac SEC-1 300（7.8 mm×300 mm）；流動(dòng)相：6 mol/L鹽酸胍；流速：0.5 m L/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：50μL。

（2）試樣溶液的測(cè)定。取50μL樣品溶液注入高效液相色譜儀,在色譜條件下測(cè)定試樣的響應(yīng)值(峰面積)。由校準(zhǔn)工曲線線性回歸方程計(jì)算樣品溶液中α-乳白蛋白的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相色譜條件的確定

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

由于β-乳球蛋白的分子量與α-乳白蛋白較為接近，為了確認(rèn)α-乳白蛋白以及β-乳球蛋白的分離情況，用本方法測(cè)定α-乳白蛋白時(shí)，需要將α-乳白蛋白以及β-乳球蛋白的標(biāo)準(zhǔn)溶液同時(shí)進(jìn)樣。在200 nm～400 nm的范圍內(nèi)進(jìn)行二極管陣列掃描，β-乳球蛋白的得到其特征吸收光譜圖。兩個(gè)蛋白在280 nm左右吸收峰都較強(qiáng)，因此，確定280 nm為α-乳白蛋白檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.2 流動(dòng)相的確定

乳粉、牛奶、乳清粉的加工過(guò)程中不可避免的會(huì)使用到熱處理工藝，乳清蛋白對(duì)熱較為敏感，不可避免的會(huì)發(fā)生一點(diǎn)的空間結(jié)構(gòu)變化以及聚合。6 mol/L鹽酸胍是常用的蛋白變性劑，可以很好的溶解蛋白質(zhì)并使蛋白結(jié)構(gòu)變得一致，因此本研究采用6 mol/L鹽酸胍作為流動(dòng)相對(duì)α-乳白蛋白和β-乳球蛋白進(jìn)行分離。研究發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相pH在6.5~7.5范圍內(nèi)對(duì)于兩種蛋白的分離沒(méi)有太大區(qū)別，如圖1，并且避開(kāi)了α-乳白蛋白4.2左右、β-乳球蛋白5.2左右以及酪蛋白4.8左右的等電點(diǎn)，不會(huì)造成樣品中蛋白質(zhì)的沉淀。因此，本標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于流動(dòng)相的p H值范圍設(shè)定為6.5~7.5。

圖1流動(dòng)相pH值對(duì)于α-乳白蛋白和β-乳球蛋白分離的影響

2.1.3 液相色譜色譜柱的確定

乳清蛋白家族中，對(duì)α-乳白蛋白檢測(cè)的主要干擾來(lái)自于β-乳球蛋白，α-乳白蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量約為14 000 u，β-乳球蛋白的分子量為18 000 u，兩者的分子量較為接近，需要選取有效的體積排阻色譜柱（SEC柱）對(duì)兩者進(jìn)行分離。本研究嘗試使用一根耐高壓的內(nèi)經(jīng)為1.9μm或者2.7μm，長(zhǎng)度為30 cm的體積排阻色譜柱對(duì)α-乳白蛋白和β-乳球蛋白進(jìn)行分離，結(jié)果單根色譜柱均無(wú)法對(duì)兩種蛋白進(jìn)行很好的分離，如圖2。由于分子量太接近，一根體積排阻色譜柱無(wú)法將這兩種蛋白完全分離，考慮串聯(lián)兩根提價(jià)排阻色譜柱來(lái)進(jìn)行分離，由于耐高壓的體積排阻色譜柱成本較高，本研究選取了串聯(lián)兩根內(nèi)徑為5μm，長(zhǎng)度為30 cm的體積排阻色譜柱來(lái)進(jìn)行測(cè)試。共購(gòu)買(mǎi)了3個(gè)品牌的2根體積排阻色譜柱進(jìn)行串聯(lián)，分別為T(mén)SK-GEL G3000 SWXL（5μm，7.8 mm×300 mm）、Dikma SEC 1000（5μm，7.8×300 mm）以及Thermo的MAbPac SEC-1（5μm，7.8×300 mm）。相對(duì)而言，兩根Thermo的MAbPac SEC-1連用對(duì)于α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的分離情況較好，見(jiàn)圖3。

圖2 一根2.7μm以及一根1.9μm體積排阻色譜柱對(duì)于α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的分離情況

圖3不同品牌的兩根凝膠色譜柱串聯(lián)對(duì)于α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的分離情況

2.2 方法的線性范圍及檢出限

2.2.1 線性范圍

線性范圍是指試樣量與響應(yīng)訊號(hào)之間保持線性關(guān)系的范圍。各取50μL濃度為0、25、50、125、250、500 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，分別按上述色譜條件進(jìn)行分析。以相應(yīng)的色譜峰面積y為縱坐標(biāo)、待測(cè)組分的質(zhì)量濃度x（mg/L）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，經(jīng)線性回歸后求得相關(guān)系數(shù)。所得結(jié)果見(jiàn)表1和圖4。說(shuō)明待測(cè)組分在該濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系。

表1線性方程

圖5α-乳白蛋白的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

2.2.2 方法的檢出限和定量限

標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)為10 mg/L,取50μL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液最低點(diǎn)注入超高效液相色譜儀,溶液在相同條件下進(jìn)樣6次,記錄色譜峰面積,以最低濃度峰與基線噪音峰比值的3倍測(cè)得目標(biāo)物的檢出限(limit of detection,LOD),以最低濃度峰與基線噪音峰比值的10倍測(cè)得目標(biāo)物的定量限(limit of quantitation,LOQ),計(jì)算出方法的檢出濃度和定量濃度,測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2α-乳白蛋白的檢出濃度和定量濃度

α-乳白蛋白的檢出濃度為3.00μg/mL，定量濃度為10.0μg/mL。當(dāng)牛奶的取樣量為0.5 g，定容體積為10 m L的時(shí)候，檢出限為0.006 g/100 g，定量限為0.02 g/100 g；當(dāng)乳粉的取樣量為1.0 g，稀釋倍數(shù)為10時(shí)，檢出限為0.03 g/100 g，定量限為0.1 g/100 g；當(dāng)乳清粉的取樣量為1.0 g，稀釋倍數(shù)為20時(shí)，檢出限為0.6 g/100 g，定量限為2.0 g/100 g。

2.3 回收率及精密度實(shí)驗(yàn)

選取嬰幼兒配方乳粉、乳清粉、牛乳樣品基質(zhì)，由于樣品本底就會(huì)含有α-乳白蛋白，因此乳粉和牛乳的實(shí)際加標(biāo)量，會(huì)根據(jù)樣品中本底含量來(lái)添加，添加量為本底的一半、本底值以及本底的2倍作為低、中、高3個(gè)加標(biāo)濃度進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，每一個(gè)添加水平重復(fù)6次。乳清粉通常作為原料添加到配方乳粉中，因此乳清粉中α-乳白蛋白的含量范圍跨度可能較大，根據(jù)實(shí)際檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)，加標(biāo)量為（10%、20%、40%），每一個(gè)添加水平重復(fù)測(cè)定6次。按照相同的分析方法進(jìn)行測(cè)定，比較加入標(biāo)準(zhǔn)樣品后實(shí)際測(cè)得的含量扣除本底值后和理論添加的含量的比值，來(lái)計(jì)算加標(biāo)回收率，并計(jì)算測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD),牛奶、乳粉和乳清粉中α-乳白蛋白低中高3種濃度的加標(biāo)平均回收率分別為90.9%～98.2%、100.0%～101.4%和95.1%～100.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍分別為1.03%～2.34%、1.84%～5.26%和3.94%～6.06%，詳見(jiàn)表3。

表3不同樣品基質(zhì)中平均回收率及精密度

2.4 實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果

使用本研究建立的方法，對(duì)市場(chǎng)上及企業(yè)提供的40批次乳粉，企業(yè)提供的10批次α-乳清粉以及10批次滅菌牛乳進(jìn)行了α-乳白蛋白的含量的測(cè)定，可以看到牛奶中α-乳白蛋白的本底值大概在0.1%左右，乳清粉中α-乳白蛋白的含量大概在30%～40%左右，嬰配粉中可能額外添加α-乳白蛋白，因此含量跨度比較大，有標(biāo)簽表示值的和檢出值比較接近，具體檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4實(shí)際樣品測(cè)試結(jié)果

（續(xù)表4）

3 結(jié)論

本研究建立牛奶、牛乳粉和牛乳清粉中的α-乳白蛋白含量測(cè)定的體積排阻色譜法,該方法具有前處理簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)。經(jīng)實(shí)際樣品檢測(cè)證明,該方法適合牛奶、牛乳粉和牛乳清粉中α-乳白蛋白的含量檢測(cè),為企業(yè)保健品注冊(cè)以及政府對(duì)于乳制品市場(chǎng)的監(jiān)管提供了強(qiáng)有力的技術(shù)保障。