嬰幼兒配方乳粉中乳清蛋白檢測及蛋白熱變性的研究進(jìn)展

徐濤，陳璟瑤，楊寶雨，喬為倉，姜鐵民，陳歷俊

(1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連116033；2.北京三元食品股份有限公司 國家母嬰乳品健康工程技術(shù)研究中心，北京100163；3.桂林理工大學(xué)國家母嬰乳品健康工程技術(shù)研究中心南亞分中心，廣西 桂林541006)

0 引言

乳清蛋白作為配方奶粉一項重要檢測指標(biāo)，在食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 10765-2010中規(guī)定嬰幼兒配方奶粉乳清蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)應(yīng)大于60%[1]。然而，最新的國標(biāo)中只規(guī)定了含量標(biāo)準(zhǔn)未規(guī)定檢測方法，其檢測仍沿用國標(biāo)GB/T 5413.2-1997中的乳清蛋白檢測方法。由于原料牛乳在加工前后會出現(xiàn)熱變性產(chǎn)生交聯(lián)蛋白，導(dǎo)致生產(chǎn)廠商不能有效對原輔料進(jìn)行監(jiān)測把控，相應(yīng)監(jiān)管部門也無法實現(xiàn)對終端乳粉產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)管。因此，明確蛋白受熱結(jié)構(gòu)變化進(jìn)而開發(fā)更為準(zhǔn)確的乳清蛋白定量檢測方法是乳制品行業(yè)迫切所需。本文從乳清蛋白熱變性和乳清蛋白檢測方法兩個方面。綜述了國內(nèi)外相關(guān)研究進(jìn)展，旨在為嬰幼兒配方乳粉加工前后乳清蛋白含量檢測提供參考。

1 乳清蛋白組成與功能

乳清蛋白是乳液中多種可溶性蛋白的總稱，必需氨基酸種類齊全，有極高的生物利用效價，主要包括α-乳白蛋白（α-Lactalbumin，α-La）、β-乳球蛋白（βlactoglobulin，β-Lg）、免疫球蛋白（immunoglobulins，Ig）和牛血清白蛋白（Bovine albumin，BSA）等生物活性物質(zhì),見表1。

表1乳清蛋白各組分生理功能

2 乳清蛋白熱變性對定量檢測的影響

乳具有一定的熱穩(wěn)定性，在加熱過程中，乳的熱穩(wěn)定性受到乳清蛋白蛋白變性、酪蛋白膠束的解聚及其表面電荷的變化、蛋白之間的共聚合作用和乳中各成分平衡被破壞的影響。其中，乳清蛋白自身結(jié)構(gòu)變性和乳蛋白之間的相互作用能夠?qū)е屡浞饺榉壑腥榍宓鞍椎臋z測出現(xiàn)誤差。如趙亭亭等[9]使用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析了不同受熱情況對乳粉中乳清蛋白的影響如圖1所示，從左到右樣品受熱溫度依次升高。在受熱溫度低時，乳清蛋白條帶清洗且顏色較深；隨溫度升高，乳清蛋白中β-乳球蛋白與α-乳白蛋白條帶顏色變淺。而酪蛋白條帶無明顯變化。可見使用SDS-PAGE檢測乳制品中的乳清蛋白會有一定的限制，受到加工工藝的影響。除SDSPAGE檢測外，使用毛細(xì)管電泳，超高效液相色譜等在蛋白水平的檢測方法也都會受到蛋白變性的影響。與生牛乳相比較，加工后乳制品的檢測譜圖峰形發(fā)生偏移，峰底扭曲，導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確[10-11]。而其他在肽段水平或者氨基酸水平的檢測方法，由于蛋白質(zhì)被進(jìn)一步分解，其空間結(jié)構(gòu)的變化不會影響到檢測結(jié)果。

圖1 SDS-PAGE對不同受熱溫度乳蛋白的檢測

2.1 乳白蛋白熱變性

α-乳白蛋白分子內(nèi)含有8個半胱氨酸殘基，在Cys6-Cys120，Cys60-Cys77，Cys73-Cys90，Cys28-Cys111處能夠形成二硫鍵，由于自身不含游離的巰基，熱處理不會使其分子間發(fā)生二硫鍵的交換，受熱更穩(wěn)定。當(dāng)溫度到達(dá)一定程度時α-La自身的二硫鍵才會被破壞，蛋白結(jié)構(gòu)完全展開如圖2所示，展開后的α-乳白蛋白能夠與含游離巰基的其他蛋白質(zhì)結(jié)合形成蛋白聚合體[12-14]。α-La的熱穩(wěn)定性還與環(huán)境中Ca2+濃度有關(guān)，α-La上與Ca2+結(jié)合的位點是四個帶負(fù)電的天冬氨酸，在未結(jié)合Ca2+時，其自身的靜電排斥會影響蛋白二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白內(nèi)的疏水位點更容易接觸到外部，降低蛋白穩(wěn)定性[13]如圖3所示。

圖2熱處理對α-乳白蛋白結(jié)構(gòu)的變化

圖3α-乳白蛋白與金屬離子結(jié)合

2.2 乳球蛋白熱變性

β-乳球蛋白自身極易受溫度與p H值的影響，根據(jù)受熱溫度不同其自身的變化也不同。中性溶液中，溫度在30℃以下時β-乳球蛋白以單體和二聚體的形式存在，兩者能夠相互轉(zhuǎn)化并維持在一個平衡狀態(tài)；溫度達(dá)到30℃以上，此時β-乳球蛋白的平衡會向單體形態(tài)轉(zhuǎn)變，最終以單體的形式存在[16]；在溫度60℃以上時，β-乳球蛋白的空間折疊結(jié)構(gòu)逐漸被打開，維持β-乳球蛋白基本結(jié)構(gòu)的二硫鍵發(fā)生交換，發(fā)生不可逆的變化；當(dāng)溫度高于85℃時，β-乳球蛋白的螺旋結(jié)構(gòu)消失，巰基暴露，疏水性增強，分子之間通過二硫鍵與疏水作用折疊成熱變性聚合物如圖4所示。在高溫條件下熱變性聚合物的二硫鍵會發(fā)生斷裂，β-乳球蛋白會得到進(jìn)一步伸展[17-19]。

圖4熱處理前后β-乳球蛋白結(jié)構(gòu)變化

2.3 熱處理對蛋白之間相互作用的影響

在乳的加熱過程中，β-乳球蛋白的球狀結(jié)構(gòu)先被打開，通過二硫鍵的交換進(jìn)而形成聚集體；隨著溫度升高α-乳白蛋白空間結(jié)構(gòu)也被打開與變性的β-乳球蛋白結(jié)合形成蛋白聚合體。乳清蛋白在受熱變性結(jié)構(gòu)展開的過程中，其中的硫巰化合物與二硫鍵會與κ-酪蛋白相結(jié)合形成乳清蛋白-酪蛋白復(fù)合物[20]。

乳中另一部分重要的蛋白是酪蛋白，酪蛋白相較于乳清蛋白具有更高的熱穩(wěn)定性，只有當(dāng)溫度達(dá)到140℃時酪蛋白才會發(fā)生變性。酪蛋白對乳清蛋白熱聚合的保護(hù)性影響早在1964年就被發(fā)現(xiàn)，Kehoe等[21]發(fā)現(xiàn)β-酪蛋白能夠改變?nèi)榍宓鞍自诩訜徇^程中的熱聚集現(xiàn)象，β-酪蛋白并沒有改變?nèi)榍宓鞍椎淖冃詼囟纫膊皇峭ㄟ^減緩聚集過程發(fā)揮作用，而是以競爭的方式影響乳清蛋白的熱聚集，β-酪蛋白形成的聚集體比乳清蛋白自聚集形成的聚集體小。更小的聚集體的形成產(chǎn)生更不渾濁、更可溶的蛋白質(zhì)溶液[22]。Arzuaga MR等[23]研究中發(fā)現(xiàn)在乳清蛋白加熱變性聚集過程中，酪蛋白的存在并沒有阻止變性行為的發(fā)生，但在酪蛋白-乳清蛋白體系中蛋白質(zhì)的溶解度增加了100%，能夠防止蛋白加熱時的聚集行為。Liyanaa rachchi等[24]研究不同酪蛋白與乳清蛋白比例對乳清蛋白熱凝集的影響，在p H 7.5，酪蛋白與乳清蛋白（30∶70）時乳清蛋白的二級構(gòu)象受加熱過程的影響最小，酪蛋白某個階段終止了乳清蛋白的變性和聚集過程。

3 乳清蛋白檢測方法

研究者針對配方乳粉中乳清蛋白各組分蛋白（α-La，β-Lg和BSA等）展開了一系列的方法研究，雖檢測對象略有不同，但乳清蛋白中各組分蛋白之間的檢測方法具有通用性。目前主要的檢測方法包括十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis）、氨基酸折算法、毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis，CE）、高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（liquid Chromatograph Mass Spectrometer，LC-MC）等，見表2。

表2乳清蛋白各種檢測方法對比

3.1 毛細(xì)管電泳

1981年Jorgenson等人首先提出使用高壓電作為動力在毛細(xì)管中進(jìn)行樣品分析，毛細(xì)管電泳技術(shù)誕生，由于其在生命科學(xué)領(lǐng)域?qū)Φ鞍踪|(zhì)等生物分子分離效果突出，得到迅速發(fā)展。最終發(fā)展成為在直流高壓場中以毛細(xì)管作為分離通道根據(jù)各檢測成分的淌度和分配行為差異進(jìn)行分離的高效電泳技術(shù)[32]。目前解決毛細(xì)管吸附問題提高檢測準(zhǔn)確性的方法主要是在毛細(xì)管內(nèi)施加非共價鍵合涂層或共價鍵合涂層抑制內(nèi)壁對大分子的吸附[33]；此外調(diào)整電泳緩沖液，也能有效降低毛細(xì)管電泳的吸附[34]。

Zhao J等[35]使用帶有雙C4D/UV檢測器的毛細(xì)管電泳同時測定牛奶中的主要金屬陽離子和乳清蛋白，陽離子檢測分析過程中日內(nèi)和日間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%，n=5）分別為0.37%~0.55%和0.46%~0.79%，在乳清蛋白檢測分析中，β-Lg和α-La的檢測限分別為5 mg/L和3 mg/L，日內(nèi)和日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%，n=5）為0.29%~0.31%，遷移時間在0.43%~0.48%之間，峰面積為2.89%~3.25%和3.29%~4.18%。

Ping Feng等[36-38]將乳清蛋白與酪蛋白看作整體，通過對脫脂奶粉的檢測，即可確定乳清蛋白和酪蛋白的面積校正因子，從而建立了快速檢測配方奶粉中乳清蛋白和酪蛋白比例的方法。實驗對不含蛋白質(zhì)的配方乳粉進(jìn)行測定，從而證明在檢測配方乳粉時其他成分不會影響檢測結(jié)果。經(jīng)過多次驗證已被國際標(biāo)準(zhǔn)化組織（ISO）設(shè)為檢測乳基嬰兒配方粉中乳清蛋白的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法（標(biāo)準(zhǔn)號ISO 23293-2020）。

3.2 SDS-PAGE

1959年Raymond等人利用人工合成的凝膠進(jìn)行電泳分析,創(chuàng)建了聚丙烯酰胺凝膠電泳。直至今日，聚丙烯酰胺凝膠電泳被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域中對蛋白質(zhì)、多肽、核酸等生物大分子的檢測鑒定。Robert G.E等[39]在SDS-PAGE過程中，使用陽離子染料結(jié)晶紫代替考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色，染色蛋白可以轉(zhuǎn)移到硝基纖維素上，western染色蛋白用酶偶聯(lián)抗體檢測。實驗中結(jié)晶紫能夠染色到16 ng的蛋白質(zhì)且無需脫色過程，比考馬斯亮藍(lán)染色低5倍，兩者具有相同的線性動態(tài)范圍。賈宏信等[40]在實驗過程中，使用成像儀代替檢測凝膠條帶的光密度計，通過chemiDoc XRS與成像系統(tǒng)的Quantity One圖像處理軟件根據(jù)條帶顏色深淺計算蛋白含量，最終檢測值的RSD在1.85%~4.35%之間。

3.3 氨基酸折算法

氨基酸折算法是根據(jù)牛奶和乳清蛋白含有的獨特氨基酸圖譜，通過特定的氨基酸的差異來計算乳清蛋白含量的一種方法。Wesley等[41-42]對多種乳制品中乳清蛋白檢測的精確度進(jìn)行檢測評估。比對實際值與檢測質(zhì)，其重復(fù)性的估計值在0.3%~2.5%之間，平均回收率在97%~100%之間。

由于該方法的氨基酸含量對蛋白含量的計算轉(zhuǎn)化是通過經(jīng)驗總結(jié)的，并沒有對蛋白進(jìn)行直接的測定。李爽等[43]對氨基酸折算法計算奶粉中乳清蛋白含量的方法進(jìn)行評估，對國內(nèi)外品牌嬰幼兒配方粉檢測發(fā)現(xiàn)，一階段奶粉中乳清蛋白的檢測值高于標(biāo)示值5%~10%，二、三段的奶粉乳清蛋白也與商品標(biāo)示值有所偏差。實驗另一結(jié)果顯示，在對添加有大豆分離蛋白的奶粉使用該方法檢測時，乳清蛋白的檢測結(jié)果會發(fā)生明顯的升高，當(dāng)配方奶粉中添加20%的大豆蛋白時，乳清蛋白的檢測量從27.78%增加至63.99%。

3.4 高效液相色譜

高效液相色譜是根據(jù)樣品混合物中各組分之間結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的不同，在流動相和固定相之間作用大小不同，從而使各組分形成滯留時間的差異。在1971年由科克蘭提出之后，該方法被廣泛用于化工，環(huán)境，生物，藥物和食品等領(lǐng)域。HPLC對配方乳粉中乳清蛋白的檢測僅適用于某些蛋白，無法廣泛應(yīng)用于全部乳清蛋白的分析，Xiaojing Ding等[44]在實驗過程中發(fā)現(xiàn)α-La與乳鐵蛋白在檢測中峰形會出現(xiàn)重疊從而干擾α-La檢測結(jié)果，建立了HPLC對乳制品中β-Lg的檢測，β-Lg A和β-Lg B的線性系數(shù)分別為0.9998和0.9997，濃度范圍內(nèi)的回收率在90.7%至116.8%之間。Farid M等[45]開發(fā)了針對配方乳粉中骨橋蛋白檢測方法，通過反相色譜原理在HPLC上在214 nm處檢測分析，其結(jié)果線性大于0.999，檢出限與定量限分別為0.14 mg/L和0.41 mg/L，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)＜0.2%。

3.5 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

20世紀(jì)80年代末，John Fenn發(fā)現(xiàn)了電噴霧電離(ESI)，使液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)技術(shù)獲得巨大發(fā)展。LC-MS技術(shù)將LC的物理分離能力與MS的質(zhì)量分析能力相結(jié)合，以其無與倫比的高靈敏度和高選擇性的混合分析能力成為蛋白質(zhì)組學(xué)中最重要的一部分[46-48]。Ke Xing等[49]使用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用，對以牛乳或羊奶為乳基的配方乳粉中兩種乳清蛋白（α-la，β-lg）與4種酪蛋白（αS1-cs，αS1-cs，β-cs，κ-cs）進(jìn)行定量分析，目標(biāo)蛋白的定量限為0.01%~0.05%日內(nèi)和日間精密度的RSD分別為2.8%~6.2%和3.3%~9.8%，回收率范圍為82.3%~116.6%，在不同的加標(biāo)水平下具有很好的重現(xiàn)性（RSD＜12%）。Wang Z等[50]使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法評估乳清蛋白分析中牛α-La肽及其同位素標(biāo)記的肽之間的相互干擾。其中α-La肽的濃度對其相應(yīng)的同位素標(biāo)記肽段在正電噴霧源(ESI)下的MS響應(yīng)值有顯著影響，而β-Lg對其同位素標(biāo)記肽段的MS強度影響不大。研究對實驗的前處理操作材料（移液器/注射器，過膜材料）進(jìn)行評估，在經(jīng)過注射器后α-La肽于其標(biāo)記肽的信號強度降低了50%，在經(jīng)過過濾器之后α-La肽與其標(biāo)記肽信號強度變化不大，β-Lg信號強度降低了50%。

3.6 其他方法

近幾年研究者們提出了通過學(xué)科交叉開發(fā)蛋白檢測新技術(shù)。王士峰等[51]根據(jù)膠體金免疫層析技術(shù)，通過膠體金標(biāo)記的β-Lg單克隆抗體和IgG制成免疫層析試紙，進(jìn)而完成對配方羊奶粉中β-Lg的快速檢測。根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合的特點檢測目的蛋白的酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA）對乳清蛋白中的牛血清蛋白和乳鐵蛋白也具有很好的檢測效果[52-53]。

2005年，Indyk等[54-57]將生物感應(yīng)器與乳清蛋白檢測相結(jié)合，提出通過光學(xué)生物傳感器檢測乳制品中蛋白的方法，使用表面等離子共振技術(shù)(Surface Plasmon Resonance，SPR)檢測乳制品中乳鐵蛋白和Ig的檢測方法。Jagan M.Billakanti等[58]在其之后對SPR檢測進(jìn)一步優(yōu)化調(diào)整，測定原料奶、加工奶和各種奶制品中的蛋白時具有相對較好的準(zhǔn)確性。與光學(xué)生物傳感器檢測不同，Eissa等[59]針對乳制品中過敏原β-Lg的實時檢測，開發(fā)了一種基于適體/石墨烯的電化學(xué)生物傳感器，能夠同步，低成本的檢測β-Lg，且具有較高的靈敏度。除此之外，由于單一的檢測技術(shù)具有各自的優(yōu)缺點，通過兩種或多種技術(shù)相結(jié)合也是研究者關(guān)注的熱點。De Carvalho等[60]將分光光度法與多元校正法相結(jié)合建立了快速檢測乳清蛋白中糖巨肽蛋白的檢測方法，實現(xiàn)了對奶粉中乳清摻假的快速、低成本檢測。

4 結(jié)果與展望

本文結(jié)合近幾年國內(nèi)外文獻(xiàn)，綜述了目前配方乳粉中乳清蛋白定量檢測的研究進(jìn)展，對各檢測方法優(yōu)缺點以及各方法的優(yōu)化改善研究進(jìn)行了總結(jié)；歸納了乳清蛋白組成與其受熱條件下，蛋白空間結(jié)構(gòu)的變化；解釋了乳清蛋白變性對其定量檢測的影響。以期為嬰幼兒配方乳粉加工前后乳清蛋白定量檢測提供參考。

當(dāng)前可用于生產(chǎn)實踐中的乳清蛋白檢測技術(shù)并不多，大多數(shù)的檢測技術(shù)由于其成本，操作和儀器等問題僅能在實驗室內(nèi)進(jìn)行。各定量方法中質(zhì)譜檢測技術(shù)被大多數(shù)研究者認(rèn)可，在其基礎(chǔ)上進(jìn)一步降低成本，簡化操作，應(yīng)是乳清蛋白定量研究的一個方向；另外乳清蛋白作為一個蛋白組，檢測過程中往往僅是對其主要的幾種子蛋白進(jìn)行單獨定量，最終計算乳清蛋白含量。不定量單個蛋白，直接將乳清蛋白當(dāng)作整體來進(jìn)行定量分析（如Ping Feng，毛細(xì)管電泳法）或許是種不錯的選擇；另一方面對乳清蛋白的檢測應(yīng)盡量在肽段或者氨基酸的水平進(jìn)行，使其能夠避免蛋白質(zhì)自身結(jié)構(gòu)變化對檢測結(jié)果的影響。以質(zhì)譜技術(shù)為基礎(chǔ)，在不使用同位素標(biāo)記的情況下對乳清蛋白整體進(jìn)行相對定量，有可能得到我們所期待的方法。