劉世梁， 林玉成*

(1. 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610065；2. 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川省瀕危野生動(dòng)物保護(hù)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610065)

洞穴是一個(gè)相對(duì)封閉的特殊生態(tài)系統(tǒng)，幾乎沒(méi)有陽(yáng)光、沒(méi)有植物生長(zhǎng)，有較為恒定且通常低于地表的溫度和有限的食物供應(yīng)(Culver.，2009)。由于受洞穴極端環(huán)境的影響，生活在其中的專性洞穴物種結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，并在時(shí)間和空間上相互隔離(Poulson & White，1969)。因此，在研究島嶼模型的進(jìn)化過(guò)程、物種形成以及生物地理學(xué)等方面，洞穴被認(rèn)為是天然的實(shí)驗(yàn)室(Cooper.，2007；Page.，2008)。中國(guó)西南山地有世界上面積最大的喀斯特地區(qū)，是全球34個(gè)生物多樣性熱點(diǎn)地區(qū)之一(Luo.，2016)。云貴高原是中國(guó)南方喀斯特地區(qū)的核心地帶，地下有數(shù)千個(gè)洞穴，但洞穴中的主要生物群——陸生節(jié)肢動(dòng)物卻很少被研究(Zhang & Li，2014)。其中洞穴蜘蛛在洞穴生態(tài)系統(tǒng)中擔(dān)任頂級(jí)捕食者的角色(Mammola.，2016)，并產(chǎn)生了多種對(duì)洞穴環(huán)境的功能適應(yīng)性(Cardoso.，2011)，被認(rèn)為是一個(gè)用來(lái)了解動(dòng)物在極端環(huán)境下適應(yīng)進(jìn)化及過(guò)程的理想模型。對(duì)云貴高原的洞穴類球蛛的生物地理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，類球蛛科Nesticidae Simon, 1894小類球蛛屬Lehtinen & Saaristo, 1980起源于始新世，中新世時(shí)期的氣候變化迫使地表蜘蛛種群遷移到洞穴中，并隨著時(shí)間的推移定居下來(lái)(Ballarin & Li，2018)。許多地區(qū)正面臨著氣候變化、旅游開(kāi)發(fā)和地下水污染等威脅，而分布在熱帶洞穴和大多數(shù)巖溶地區(qū)內(nèi)的洞穴動(dòng)物群幾乎未被研究過(guò)，迫切需要進(jìn)行密集和廣泛的生物調(diào)查(Howarth，1983；Shu.，2013)。

在動(dòng)物種群遺傳研究方面，由于母系遺傳、在不同物種間的同源性、受到強(qiáng)烈的選擇壓力而快速進(jìn)化等特點(diǎn)，線粒體基因是適合用來(lái)探究遺傳多樣性的工具(Avise，2009)，其中，線粒體細(xì)胞色素c氧化酶亞基Ⅰ()基因已被成熟應(yīng)用于蜘蛛的分子系統(tǒng)學(xué)研究(劉名信等，2012)。

云南洞密蛛隸屬蛛形綱Arachnida蜘蛛目Araneae密蛛科Mysmenidae，是一種個(gè)體微小的洞穴蜘蛛，最早發(fā)現(xiàn)于云南省個(gè)舊市郊的飛霞洞，宋大祥和朱明生(1994)將其命名為云南困蛛，放入球蛛科Theridiidae。Lin和Li(2008)根據(jù)云貴高原多個(gè)洞穴采獲的樣本，將其描述為齒勺洞密蛛并置于密蛛科。此后，二者被認(rèn)為是同物異名(Li & Lin，2019)，根據(jù)國(guó)際動(dòng)物命名法規(guī)的優(yōu)先律原則，該種有效學(xué)名應(yīng)為。

在地下相對(duì)穩(wěn)定的極端環(huán)境條件下，洞穴隔離怎樣維持洞穴蜘蛛的種群穩(wěn)定，對(duì)洞穴物種的遺傳多樣性有何影響等問(wèn)題的研究較少，尚未得到合理的解釋。云南洞密蛛僅在云貴高原的8個(gè)洞穴中分布(宋大祥，朱明生，1994；Lin & Li，2008；Li & Lin，2019)，作為相互獨(dú)立的地理種群，其種群結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性及演化歷史等方面的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究選取6個(gè)相互隔離的云南洞密蛛地理種群[關(guān)牛洞(GN)、野佬大洞(YLD)、清虛洞(QX)、十里大洞(SLD)、仙人洞(XR)、白巖洞(BY)]，通過(guò)分析、比較不同種群的遺傳多樣性和種群分化，以期探討洞穴隔離對(duì)云南洞密蛛種群遺傳結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 研究材料

2020年8月在云貴高原的6個(gè)洞穴中采獲503號(hào)樣本(表1)。所有樣本均用95%的分析純乙醇浸泡，-20 ℃凍存。標(biāo)本保存于四川大學(xué)自然博物館(NHMSU)動(dòng)物標(biāo)本室。

表1 云南洞密蛛樣本采集位點(diǎn)基本信息Table 1 Basic information about sampling sites of Trogloneta yunnanense

1.2 基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增和測(cè)序

每個(gè)洞穴種群選取20～30只個(gè)體作為分子材料，用于開(kāi)展種群遺傳研究。每個(gè)采集位點(diǎn)隨機(jī)選取包含雌雄和幼體在內(nèi)的個(gè)體樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，為避免腹部腸道內(nèi)容物帶來(lái)的外源基因影響，僅取每只個(gè)體的頭胸甲用于分子實(shí)驗(yàn)。使用QIAGEN血液和組織提取試劑盒(Qiagen；P/N：69506)提取基因組DNA。雄性的觸肢器和雌、雄腹部均保留作為分子憑證?；虻臄U(kuò)增和測(cè)序引物為L(zhǎng)COI490(5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’)和HCO2198(5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAA TCA-3’)。PCR反應(yīng)體系25 μL：模板4 μL，引物各0.5 μL(10 mmol·L)，ddHO 7.5 μL，2×M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix(with blue dye)12.5 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃ 30 min；94 ℃ 30 s,48.95 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 6 min。PCR產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，送北京擎科生物科技有限公司成都分公司純化和測(cè)序。

1.3 序列分析

測(cè)序數(shù)據(jù)使用Bioedit 7.2.5(Hall，1999)進(jìn)行檢查和編輯。MEGA X(Kumar.，2018)用于翻譯和對(duì)齊序列，并基于Kimura雙參數(shù)距離模型計(jì)算堿基組成、轉(zhuǎn)換與顛換值。基于-distance計(jì)算種群間的遺傳距離，并構(gòu)建鄰接(NJ)樹(shù)。利用DNAsp 6.0(Rozas.，2017)計(jì)算平均核苷酸差異數(shù)(k)、單倍型數(shù)量(h)、單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(π)，并進(jìn)行中性檢驗(yàn)和核苷酸錯(cuò)配分布檢驗(yàn)。使用PopArt 1.7(Leigh & Bryant，2015)構(gòu)建Templeton-Crandall-Sing(TCS)網(wǎng)絡(luò)(Clement.，2000)。利用Arlequin 3.5(Excoffier.，2005)進(jìn)行分子方差分析，并計(jì)算種群遺傳分化指數(shù)()和種群間基因流(Nm)。

利用貝葉斯推斷(BI)和最大似然法(ML)重建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)?；贏IC準(zhǔn)則使用PartitionFinder2(Lanfear.，2017)選擇最適合的核苷酸替換模型為GTR+G，并使用MrBayes(Ronquist.，2012)構(gòu)建BI系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，4個(gè)馬爾可夫鏈蒙特卡羅(MCMCs)采用默認(rèn)參數(shù)運(yùn)行200萬(wàn)代，抽樣頻率為200代一次，獨(dú)立運(yùn)行2次?；贏IC準(zhǔn)則使用ModelFinder(Kalyaanamoorthy.，2017)選擇的最適合核苷酸替換模型為TIM3+F+I+G4，使用IQTREE 1.6.12(Nguyen.，2015)構(gòu)建ML系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，節(jié)點(diǎn)支持值使用1 000次自展分析重復(fù)檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 COⅠ基因序列變異分析

共獲得159個(gè)樣本部分基因，序列長(zhǎng)度為630 bp，變異位點(diǎn)32個(gè)，包括2個(gè)單變異位點(diǎn)和30個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)。轉(zhuǎn)換/顛換比為20.09，堿基組成為：T(44.00%)、A(26.16%)、C(11.89%)、G(17.95%)。A+T含量高于C+G含量。159個(gè)樣本共包含16個(gè)單倍型(GenBank登錄號(hào)分別為MZ577427、MZ577392、MZ577393、MZ577418、MZ577440、MZ577446、MZ577404、MZ577405、MZ577410、MZ577379、MZ577417、MZ577425、OM920931、OM920932、OM920935、OM920975)。

2.2 種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)

6個(gè)地理種群間未發(fā)現(xiàn)共享單倍型，種群內(nèi)單倍型之間的差異不超過(guò)4個(gè)核苷酸。QX遺傳多樣性最高(k=1.305，Hd=0.553，π=0.002 07)，其次為BY(k=1.073，Hd=0.607，π=0.001 70)。而遺傳多樣性最低的是GN，僅有1個(gè)單倍型(表2)。整體而言，云南洞密蛛總體的k為10.021，Hd為0.888，π為0.015 91。

表2 云南洞密蛛種群內(nèi)的遺傳多樣性指數(shù)Table 2 Genetic diversity indices of Trogloneta yunnanense within populations

以單倍型構(gòu)建的NJ樹(shù)與TCS單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)相符，6個(gè)地理種群可分為2個(gè)大的譜系，其中YLD、GN與XR聚為一支；SLD、BY與QX聚為一支(圖1)，2大譜系下的次級(jí)分支顯示各個(gè)地理種群均為獨(dú)立的譜系，它們之間不存在共享單倍型。

圖1 基于種群遺傳距離構(gòu)建的NJ樹(shù)(左)和單倍型構(gòu)建的TCS網(wǎng)絡(luò)(右)Fig. 1 NJ tree (left) based on the population genetic distance and TCS network (right) based on haplotypes

2.3 云南洞密蛛的種群分化與基因流

6個(gè)地理種群中，YLD和GN之間的遺傳距離最近(=0.005 10)，最遠(yuǎn)的是BY和GN(=0.026 29)，其他種群間的遺傳距離在0.011 70～0.025 48之間(表3)。6個(gè)種群間的值均在0.9以上,存在極顯著差異(<0.01)(表4)。AMOVA分析顯示，種群間變異占總變異的95.75%，種群內(nèi)變異占總變異的4.25%，并且統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)極顯著(<0.001；表5)。根據(jù)Hudson等(1992)的基因多樣性算法，6個(gè)種群間的遺傳分化指數(shù)為0.953 4，說(shuō)明總變異的95.34%來(lái)自不同種群間的差異。

表3 基于COⅠ基因云南洞密蛛6個(gè)種群間的遺傳距離Table 3 The genetic distance among 6 Trogloneta yunnanense populations based on COⅠ gene

表4 云南洞密蛛6個(gè)種群間的遺傳分化指數(shù)Table 4 Genetic differentiation index among 6 Trogloneta yunnanense index populations

表5 云南洞密蛛6個(gè)種群的分子方差分析Table 5 AMOVA analysis among 6 Trogloneta yunnanense populations

2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

使用BI法和ML法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本相同。除YLD外(PP=0.45，BP=43)，其他種群的支持率都較高(PP>0.6，BP>50)。云南洞密蛛的6個(gè)種群分化為6個(gè)相互獨(dú)立的地理譜系，第1支為BY，第2支為SLD，第3支為QX，第4支為XR，第5支為YLD，第6支為GN(圖2)。

圖2 基于6個(gè)云南洞密蛛種群COⅠ基因構(gòu)建的貝葉斯樹(shù)Fig. 2 Bayes inference tree based on COⅠgenes from 6 Trogloneta yunnanense populations

2.5 云南洞密蛛種群歷史動(dòng)態(tài)分析

使用中性檢驗(yàn)和核苷酸錯(cuò)配分布檢驗(yàn)并推測(cè)云南洞密蛛的種群歷史動(dòng)態(tài)。中性檢驗(yàn)結(jié)果顯示Tajima’值為2.23(=0.941)，F(xiàn)u’s值為7.512(=0.995)。核苷酸錯(cuò)配分布圖顯示(圖3)，觀測(cè)值呈多峰分布，與期望值不符。

圖3 云南洞密蛛的錯(cuò)配分布圖Fig. 3 Mismatch distribution test of Trogloneta yunnanense

3 討論與結(jié)論

迄今為止，云南洞密蛛的分布記錄僅來(lái)自云貴高原的8個(gè)地下洞穴(宋大祥，朱明生，1994；Lin & Li，2008；Li & Lin，2019)，目前未發(fā)現(xiàn)在地表有分布。

3.1 云南洞密蛛的遺傳多樣性與種群分化

云南洞密蛛的遺傳多樣性總體上較高，但各種群內(nèi)的遺傳多樣性較低。6個(gè)種群間高遺傳分化指數(shù)、不存在共享單倍型和低基因流表明，云南洞密蛛在洞穴之間沒(méi)有發(fā)生遷移，6個(gè)種群間的 Nm值總體為0.01，幾乎不存在基因交流，形成各自獨(dú)立演化的“島嶼”種群。這與Snowman等(2010)對(duì)洞穴類球蛛遺傳結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果相似。種群間高度分化、種群內(nèi)序列相似性較高的模式，與破碎生境下的種群模型預(yù)期結(jié)果一致(Hedin，1997)。受困于洞穴中的種群個(gè)體無(wú)法與外界交流，導(dǎo)致各洞穴種群進(jìn)一步的遺傳分化(Snowman.，2010)。由于封閉的洞穴環(huán)境的特殊性和相對(duì)較小的種群規(guī)模，洞穴動(dòng)物群可能形成極端的遺傳結(jié)構(gòu)(Hedin，1997)。

系統(tǒng)發(fā)育分析表明，云南洞密蛛不同地理種群的單系性支持良好，6個(gè)種群遺傳分化明顯。在地理上相鄰的地區(qū)觀察到高度分化的譜系，這表明“島嶼”化的溶洞限制了種群間個(gè)體的遷移。從云貴高原整個(gè)地理區(qū)域來(lái)看，該物種的6個(gè)譜系并未表現(xiàn)出明顯的地理分布格局。云南洞密蛛種群的地理分布可能與洞穴隔離有關(guān)，而與地表的地理距離無(wú)關(guān)。另外，本研究?jī)H使用基因作為遺傳標(biāo)記，如果使用更多的基因序列，可能會(huì)得到更理想的結(jié)果。

3.2 云南洞密蛛的種群歷史動(dòng)態(tài)

本研究中使用Tajima’、Fu’s2種中性檢驗(yàn)方法和核苷酸錯(cuò)配分布檢驗(yàn)，推測(cè)了云南洞密蛛種群歷史動(dòng)態(tài)。2種中性檢驗(yàn)結(jié)果均為正值，且值不顯著，這與核苷酸錯(cuò)配分布檢驗(yàn)結(jié)果相符，表明云南洞密蛛自進(jìn)入洞穴拓殖適應(yīng)之后，未經(jīng)歷過(guò)種群擴(kuò)張，群體大小保持穩(wěn)定。推測(cè)造成這一歷史動(dòng)態(tài)的原因可能是，互不連通的洞穴系統(tǒng)將多洞穴分布的物種切割成為各自獨(dú)立的“島嶼”種群，這種地理阻隔促進(jìn)了物種種群間的遺傳分化；與此同時(shí)，由于相對(duì)封閉的黑暗洞穴中的環(huán)境條件極端穩(wěn)定，云南洞密蛛無(wú)法實(shí)現(xiàn)種群擴(kuò)張。

3.3 云貴高原地下洞穴的物種形成

云貴高原位于中國(guó)地勢(shì)的第二階梯，受青藏高原造山運(yùn)動(dòng)的影響，氣候復(fù)雜多變。Ballarin和Li(2018)的研究發(fā)現(xiàn)，在云貴高原范圍內(nèi)分布的小類球蛛屬大多為洞穴類群，根據(jù)分化時(shí)間推斷，其起源于始新世末期的地表，中新世的氣候變冷促使小類球蛛遷入地下洞穴避難并定殖。體型更小的云南洞密蛛目前已知僅在洞穴中有分布，其地下棲息生境與小類球蛛相似。猜測(cè)它可能與小類球蛛有著相似的演化適應(yīng)模式，不同的是它的地表種群可能已經(jīng)絕滅，只有地下離散分布的洞穴種群得以保留，因洞穴“島嶼”隔離效應(yīng)，阻斷了該物種種群之間的基因交流，各種群的基因突變累積增加了整體的遺傳多樣性。

云南洞密蛛種群間高水平的分化程度支持Barr(1968)的假說(shuō)：在洞穴殖民過(guò)程中，在初創(chuàng)事件之后，多樣性會(huì)減少，隨著一個(gè)物種在新的空白的地下生境拓殖定居，拓展了其種群在各自洞內(nèi)的分布范圍，通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的演化，可累積增加遺傳多樣性，同時(shí)洞穴隔離和極端的生境條件會(huì)加大不同地理種群的遺傳分化，有利于種群加速分化，最終形成新物種。

感謝西華師范大學(xué)的李云春博士在野外幫助采集樣本，四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的李亞和何懌婷在野外工作和樣本鑒定方面提供的幫助。