楊波, 賴燕舞, 周強, 成美玲, 唐丹, 程建斌, 李果, 周應(yīng)敏, 羅波, 張貴權(quán), 黃炎*

(1. 中國大熊貓保護研究中心，四川都江堰611830；2. 大熊貓國家公園珍稀動物保護生物學(xué)國家林業(yè)和草原局重點實驗室，四川都江堰611830)

大熊貓是我國特有的孑遺物種，具有重要的學(xué)術(shù)研究價值。為了穩(wěn)定與發(fā)展大熊貓種群數(shù)量，除了保護野生大熊貓的棲息地外，還應(yīng)強化完善飼養(yǎng)管理手段，科學(xué)促進圈養(yǎng)大熊貓的繁殖。1963年，世界上第一只大熊貓幼仔誕生于北京動物園。成功解決圈養(yǎng)大熊貓繁育中的“三難”問題(張和民，王鵬彥，2003)后，圈養(yǎng)種群數(shù)量快速增長，截至2020年全球圈養(yǎng)大熊貓數(shù)量已超過600只(https://www.forestry.gov.cn/main/5904/20210102/002252617123874.html)，為野化培訓(xùn)與放歸奠定了扎實基礎(chǔ)。大熊貓為季節(jié)性單次發(fā)情動物，一般在2—5月發(fā)情，發(fā)情配種期只有24～72 h，甚至更短。雌性大熊貓一般一年只排卵一次，有效監(jiān)測排卵時間成為繁育成功的關(guān)鍵，也是圈養(yǎng)種群繁育的難點。國內(nèi)外專家學(xué)者圍繞大熊貓發(fā)情鑒定和排卵監(jiān)測進行了多學(xué)科的探討，包括行為學(xué)、細胞學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)、生物化學(xué)、微生物學(xué)、光譜化學(xué)和組織學(xué)等。本文旨在總結(jié)論述圈養(yǎng)雌性大熊貓發(fā)情鑒定和排卵監(jiān)測的方法，并探討可能出現(xiàn)及應(yīng)用的新方法，以期為把握大熊貓發(fā)情配種的最佳時機提供更好的參考，為大熊貓圈養(yǎng)種群的繁育奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 行為研究

1.1 雌性發(fā)情行為表現(xiàn)

國內(nèi)外學(xué)者開展了大量雌性大熊貓的發(fā)情行為研究，為大熊貓的配種提供了更多、更可靠的行為數(shù)據(jù)(Bonney.，1982；曾國慶等，1984；Murata.，1986；Masui.，1989；黃翔明，葉志勇，1991；Swaisgood.，2003；張和民，王鵬彥，2003；陳琳，李果，2006；楊勝林等，2007；陳超，2015；Kersey.，2016；劉敏，2016)。大熊貓的發(fā)情期分為前期、高峰期和后期(曾國慶等，1984；張和民，王鵬彥，2003)。雌性在發(fā)情期的行為表現(xiàn)為：前期，食欲減退，活動量增加，開始有咩叫、蹭陰、戲水、嗅氣味等行為，對雄性不感興趣或帶有攻擊行為，隨著發(fā)情繼續(xù)，減食明顯，活動量和活動時間明顯增加，戲水、咩叫和蹭陰的頻率增加，開始對雄性感興趣；高峰期，食欲大減，對雄性的反應(yīng)增強并主動接近雄性，見到雄性站立不動(呆立)或用臀部頂撞雄性，翹尾，作交配姿勢，常伴有自慰行為，其中，翹尾(觸碰時或自發(fā))是最能體現(xiàn)雌性愿意接受交配的行為表現(xiàn)(Bonney.，1982；Murata.，1986；Masui.，1989；Laura.，2002)，這也可能是一個排卵信號的行為指示(Laura.，2002)；后期，所有發(fā)情表現(xiàn)逐漸消失，活動量減少，食欲逐漸恢復(fù)正常。

大多數(shù)雌性與雄性進行交配的時間發(fā)生在發(fā)情高峰期，一般持續(xù)1～3 d。但某些個體發(fā)情高峰期的行為表現(xiàn)時間很短，僅持續(xù)1～2 h(鄧世全，陳猛，1997)，少數(shù)個體甚至未表現(xiàn)出明顯的發(fā)情高峰期行為。由此可見，雌性發(fā)情行為有明顯特征，對于發(fā)情行為典型的雌性大熊貓，觀察其發(fā)情行為是判斷發(fā)情程度的有效方法。

1.2 雄性發(fā)情行為表現(xiàn)

雄性為被動發(fā)情，當受到發(fā)情雌性求偶行為或特殊氣味刺激后才被激發(fā)(鄧世全，陳猛，1997)。雄性具有辨別雌性是否發(fā)情和是否處于發(fā)情高潮的能力，并根據(jù)雌性發(fā)情程度調(diào)節(jié)性興奮強度(李德生等，2001；張和民，王鵬彥，2003)。在雌性發(fā)情前期，雄性會表現(xiàn)出輕度興奮，如活動量增加、少量的標記和低頻率咩叫；當雌性處于發(fā)情高峰期時，雄性會非常興奮，不停地走動并發(fā)出頻繁的咩叫求偶聲，還時常伴有標記、戲水、尿頻等行為，喜歡舔舐雌性尿液并且跟隨和靠近雌性，有時還用前掌搔抓雌性臀部和尾部，可爬跨進行交配，某些雄性會露出陰莖(高鳳歧等，1994；鄧世全，陳猛，1997；李德生等，2001)。放對交配時，雄性爬跨雌性背部，進行“站立式”交配。陰莖插入后，將姿勢調(diào)整為“坐抱式”直到交配結(jié)束。射精時，雄性會同步雌性發(fā)出低而粗、頻率較高的咩叫。交配結(jié)束后，兩者分開，雄性停止咩叫(王雄清，1987；胡錦矗，魏輔文，1989；高鳳歧等，1994)。因此，可以根據(jù)雄性發(fā)情行為表現(xiàn)來辨別雌性發(fā)情程度和確定配種時機。對能進行自然交配的個體，在實踐中綜合雌性與雄性的發(fā)情行為表現(xiàn)，可以較直觀地判斷雌性發(fā)情程度并指導(dǎo)適時配種。

1.3 發(fā)情通訊行為

動物經(jīng)過長期的繁殖進化已形成一種雌雄能相互識別交配行為的特殊信號。大熊貓在生活中常用化學(xué)通訊與聽覺通訊2種通訊方式(Schaller.，1985)。大熊貓的肛周腺和尿液中攜帶有關(guān)年齡、性別、社會地位和親緣關(guān)系等用于個體識別的信息(Swaisgood.，2002；White.，2004；Liu.，2006；Tian.，2007；Liu.，2008)。大熊貓的咩叫和鳥叫聲中也攜帶了關(guān)于身份、親緣關(guān)系及發(fā)情狀態(tài)等信息(北京動物園，1974；Kleiman & Peters，1990；Charlton.，2009a，2009b，2010)。大熊貓在發(fā)情時會利用嗅覺、視覺和聽覺進行交流，多模式信號(化學(xué)信號和聲音信號)是提示雌性發(fā)情程度及排卵的最佳預(yù)測器(Owen.，2016)。徐蒙等(2011)也證實了大熊貓通過標記行為做出對聲音信號(異性的叫聲)刺激的行為響應(yīng)。大熊貓在求偶期間會使用多模態(tài)信號宣傳發(fā)情及生理狀況，并在更長的時間促進影響潛在的配偶(Owen.，2013)。因此，隨著雌性發(fā)情程度的遞進，雌雄個體都會交替地表現(xiàn)出咩叫、鳥叫和標記等行為(黃翔明，葉志勇，1991；Swaisgood.，2000；張和民等，2000；李德生等，2001)。

大熊貓在發(fā)情期擁有較為復(fù)雜的聲音類型，是性行為的一種直接表達。有6～12種聲音與發(fā)情相關(guān)，包括咩叫、鳥叫、狗吠、嗥叫、嗷嗷叫、咆哮、哼叫等(朱靖，孟智斌，1987；張和民，王鵬彥，2003；周小平等，2005；徐蒙等，2011)。其中，咩叫和鳥叫屬于非攻擊性、表達友好親近的叫聲，在交配季節(jié)可用于吸引異性和協(xié)調(diào)雌雄同步發(fā)情(Kleiman & Peters，1990)。

有關(guān)雌性大熊貓咩叫行為的研究最多，咩叫常用來鑒定雌性發(fā)情程度及判斷配種時間(北京動物園，1974；曾國慶等，1984；朱靖，孟智斌，1987；黃翔明，葉志勇，1991；邱賢猛，1993；Lindburg.，2001；Charlton.，2009a；徐蒙等，2011)。研究表明，隨著發(fā)情高峰期的到來，雌性咩叫的音調(diào)和持續(xù)時間會增加(Lindburg.，2001)；高峰期的頻率可達22～51次/10 min(曾國慶等，1984；朱靖，孟智斌，1987)或33.2～83.2次/10 min(黃翔明，葉志勇，1991)。咩叫高峰常發(fā)生在自然交配時或交配后(朱靖，孟智斌，1987；黃翔明，葉志勇，1991；邱賢猛，1993)。發(fā)情后期的咩叫明顯減少或無，頻率會下降至0～1次/10 min(曾國慶等，1984)。

雌性大熊貓的鳥叫也含有表明其發(fā)情程度的潛在信號，叫聲頻率和聲學(xué)特點可以表征其發(fā)情和排卵狀態(tài)(Charlton.，2010)。雌性會在交配前1周開始鳥叫，在交配前2 d出現(xiàn)峰值，直到交配后2 d都會出現(xiàn)較高的頻率(Zhang.，2004)。聲學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，具有生育能力的雌性鳥叫持續(xù)時間較長，具有較高的抖動和刺耳性。叫聲抖動的增加可能是排卵前雌激素增加所致(Lindburg.，2001；Charlton.，2010)。Charlton等(2010)也證實了具有生育能力與不具有生育能力的雌性所發(fā)出的鳥叫存在聲學(xué)差異，雄性傾向于具有生育能力雌性所發(fā)出的鳥叫。因此，雌性發(fā)出高頻率的叫聲可能是為了吸引雄性，引起雄性產(chǎn)生強烈性欲并與其順利完成交配。因此也可將鳥叫視為雌性處于發(fā)情高峰或排卵期的重要信號。

除了叫聲行為以外，標記也是一種通訊方式。雌性大熊貓的化學(xué)信號主要通過蹭陰(尿液或肛周腺分泌物標記)的方式傳播。蹭陰遺留物中含有大量用于生殖聯(lián)系的氣味信息，能夠促使雌、雄生理與發(fā)情行為同步，作交配前準備。因此，雌性會通過蹭陰來預(yù)示其發(fā)情期的到來，以達到吸引雄性的目的。雌性蹭陰主要發(fā)生在交配前，高峰期一般發(fā)生在咩叫高峰期前，頻率可達60～106次/100 min(黃翔明，葉志勇，1991)。隨著發(fā)情遞進，蹭陰頻率逐漸增加，在交配發(fā)生前的1～5 d達到頂峰，而雌性很少會在交配時或交配后再發(fā)生該行為(Murata.，1986；Lindburg.，2001；Laura.，2002；Swaisgood.，2003；Zhang.，2004)。

從前人研究成果及實踐應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，量化叫聲和標記行為，根據(jù)叫聲或行為的頻率強度來推測及判斷雌性的發(fā)情高峰期或排卵時間。但目前存在研究個體不足、數(shù)據(jù)量偏少、研究結(jié)果有偏差和個體差異性等現(xiàn)狀，不足以建立一個較為精確的評估標準，值得深入研究。

2 外陰形態(tài)及陰道細胞學(xué)研究

2.1 外陰形態(tài)

雌性外陰(外生殖器官)形態(tài)會在發(fā)情期發(fā)生特殊性變化，與發(fā)情程度存在關(guān)聯(lián)性。雌性外陰的顏色、水腫程度及開口大小是主要的發(fā)情鑒定指標。綜合相關(guān)文獻(邱賢猛，1987，1988；施少清等，1988；Durrant.，2003；陳琳，李果，2006；周應(yīng)敏等，2013，2020；劉敏，2016)得出：雌性在發(fā)情前期，外陰呈粉紅色或淺紅，外翻及開口程度小；隨著發(fā)情繼續(xù)，色紅而潮潤，陰門開始紅腫并逐漸顯著，陰道黏膜腫脹，開口逐漸張至最大；發(fā)情高峰期，色呈玫瑰紅，陰道黏膜腫脹但松弛，開口外翻程度有開始變小的趨勢，有分泌物流出；發(fā)情后期，紅色褪去偏白，陰門紅腫消失，開始回收、縮小。將雌性外陰形態(tài)與發(fā)情行為結(jié)合來判斷大多數(shù)圈養(yǎng)雌性大熊貓斷發(fā)情程度或選擇配種時間仍然是一個簡捷而有效的方法。

2.2 陰道細胞

湯純香等(2000)描述了雌性大熊貓陰道細胞(文中所稱“陰道”實際為“尿生殖前庭”)的形態(tài)學(xué)變化：非發(fā)情期的細胞呈深藍色，細胞與細胞核均很??；發(fā)情前期的細胞呈藍色而略帶粉紅，細胞核仍很小。隨著發(fā)情發(fā)展，細胞大多數(shù)呈粉紅色，多邊形，細胞與細胞核開始膨大漸至破裂；發(fā)情高峰期的細胞大多數(shù)呈橙黃色，細胞角質(zhì)化，細胞核消失，呈多邊形且很薄。Durrant等(2002，2003)利用巴氏染色法染色陰道細胞后得出：在排卵前 8～9 d，大部分脫落的陰道細胞由嗜堿性(藍色)轉(zhuǎn)變?yōu)槭人嵝?粉紅色)，沒有伴隨核或細胞質(zhì)變化；排卵前2 d，大多數(shù)陰道細胞由角質(zhì)化(橙色)細胞取代嗜酸細胞。

陰道細胞在發(fā)情期會角質(zhì)化，而且細胞角化率會隨著發(fā)情程度的推移呈現(xiàn)出同步增長的趨勢。因此，陰道細胞角化率對大熊貓發(fā)情鑒定及配種時機確定具有良好的指示性，在早期大熊貓生產(chǎn)中得到過很好的驗證和應(yīng)用(潘秀森等，1984；陳玉村等，1985；邱賢猛，1987，1988，1993；陳猛等，1998；湯純香等，2000；Durrant.，2002，2003)。在發(fā)情期多數(shù)雌性大熊貓的陰道細胞角化率會從非發(fā)情期的35%以下(湯純香等，2000)，上升至60%及以上(陳猛等，1998；湯純香等，2000)。在發(fā)情高峰期或自然交配時，陰道細胞角化率最高，上升至70%及以上，有的甚至可達97%(邱賢猛，1987，1988，1993；陳猛等，1998；湯純香等，2000；Durrant.，2002)。但陰道細胞角化率分析存在個體差異，有報道顯示最高角化率只有55%左右(潘秀森等，1984；鄧世全，陳猛，1997)，甚至還有 1例異常：發(fā)情個體在整個發(fā)情期的角化率并未發(fā)生變化，均小于20%(周應(yīng)敏等，2013)。不僅如此，上述研究中的采樣頻率為每日一次，這或許能夠滿足參與自然交配個體的配種，但這樣的采樣頻率在人工授精(artificial insemination，AI)中偏低。

通過外陰形態(tài)變化和陰道上皮細胞角化率，能判斷雌性大熊貓的發(fā)情程度，但外陰形態(tài)的判斷很大程度依賴觀察者的經(jīng)驗，陰道上皮細胞角化率監(jiān)測也受限于較為困難的頻繁采樣。因此，這2種判斷方法在繁殖生產(chǎn)中有效，但在應(yīng)用上會受到一定程度的限制。

3 內(nèi)分泌

3.1 類固醇性激素

類固醇性激素與動物繁殖密切相關(guān)，性激素的變化對生殖系統(tǒng)的活動具有調(diào)控作用，性激素水平可以反映出性腺的活動規(guī)律及繁育狀態(tài)(Lasley & Kirkpatrick，1991)。目前對發(fā)情期雌性大熊貓的類固醇性激素研究集中于雌性激素：雌酮-3-葡萄糖醛酸苷(E1G)、雌酮-3-硫酸鹽、17β-雌二醇以及雌三醇(李復(fù)東等，1993；Laura.，2002；Narushima.，2003；楊勝林等，2007；Kersey.，2010；Wauters.，2018；沈潔娜等，2020)和孕激素：孕酮、孕二醇-3-葡萄糖苷酸(Monfort.，1989；彭世媛，葉志勇，1993；Narushima.，2003；Hama.，2009)。早期主要利用放射免疫測定法(radio immunoassay，RIA)測定大熊貓血清及尿液中性激素水平(Bonney.，1982；曾國慶等，1984；李復(fù)東等，1993；謝鐘等，1994；Lindburg.，2001；Narushima.，2003；Owen.，2005；MacDonald.，2006)。RIA的局限性在于：使用放射性元素，不僅對實驗人員及環(huán)境產(chǎn)生一定的危害，而且對實驗室及實驗人員的要求較高，價格較昂貴(鄧濤等，2013)。酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)逐漸替代RIA，且研究也證實了ELISA與RIA所得出的結(jié)果存在一致性(黃炎等，2001)。因此，ELISA被廣泛應(yīng)用到大熊貓尿液、糞便、毛發(fā)等非損傷性樣品的類固醇性激素水平測定中，尤其被應(yīng)用在大熊貓尿液類固醇性激素水平的測定，為大熊貓發(fā)情配種及排卵監(jiān)測提供了可靠的技術(shù)支持(彭世媛，葉志勇，1993；黃炎等，2001；Laura.，2002；喻述容等，2003；楊勝林等，2007；Kersey.，2010；Huang.，2012a，2012b；劉敏，2016；Wauters.，2018；沈潔娜等，2020)。

在雌性大熊貓發(fā)情期，無論是血清中雌激素水平還是尿液中雌激素代謝產(chǎn)物含量均呈現(xiàn)出“緩升快降”的變化，即雌激素隨著發(fā)情開始從基礎(chǔ)水平緩慢上升，直到峰值的出現(xiàn)，隨后劇降至基礎(chǔ)水平(Bonney.，1982；曾國慶等，1984；施少清等，1988；彭世媛，葉志勇，1993；Laura.，2002；喻述容等，2003；楊勝林等，2007；Kersey.，2010；沈潔娜等，2020)。雌激素對發(fā)情行為具有觸發(fā)作用，且雌激素在排卵前似乎能夠很好地預(yù)測發(fā)情行為(Chaudhuri.，1988；Lindburg.，2001；Hama.，2009)。雌性發(fā)情高峰期發(fā)生在雌激素峰值出現(xiàn)的前1 d、當日或激素峰后第1天，最高的配種率均發(fā)生在雌激素峰后(Bonney.，1982；Monfort.，1989；彭世媛，葉志勇，1993；馮文和等，1994；Lindburg.，2001；董武子，竇忠英，2003；Czekala.，2003；楊勝林等，2007；Huang.，2012a；劉敏，2016；沈潔娜等，2020)。雌性大熊貓的自然交配或AI時間應(yīng)控制在雌激素峰出現(xiàn)的當日或之后的第1～3天(Bonney.，1982；Hodge.，1984；施少清等，1988；曾國慶等，1990；李復(fù)東等，1993；彭世媛，葉志勇，1993；謝鐘等，1994；董武子，竇忠英，2003；Czekala.，2003；楊勝林等，2007；Huang.，2012a，2012b)。

除此以外，孕激素從雌性發(fā)情開始一直處于最低水平，在雌激素峰前或峰后開始上升，隨后保持在一個較高的水平，直到產(chǎn)仔后才降至基礎(chǔ)水平(曾國慶，劉維新，1994；Laura.，2002；Kersey.，2010；沈潔娜等，2020)。因此配種時間應(yīng)選擇在雌激素下降且孕激素逐步升高期間(李復(fù)東等，1993；沈潔娜等，2020)。有研究指出，大熊貓在排卵后孕激素的分泌量會大量增加(Monfort.，1989)。雌激素峰后第7天的孕激素水平是基礎(chǔ)水平的4倍，孕激素水平可作為確定排卵的方法(Czekala.，2003)。

雌激素和孕激素的變化趨勢只能明確大熊貓的排卵發(fā)生在雌激素峰后和孕激素上升的這段時間，但不能確定排卵與雌激素峰發(fā)生的時間關(guān)系(Lindburg.，2001)，或許可以通過配種時間與受孕情況的相關(guān)性來探討。喻述容等(2003)根據(jù)成都大熊貓繁育研究基地1997—2001年39例大熊貓繁殖情況，得出雌激素峰后12 h內(nèi)進行首次自然交配、AI或混合配種，受孕率達100%；峰后12～24 h，受孕率為83.3%；峰值下降24 h后，受孕率為0。根據(jù)中國大熊貓保護研究中心2017年繁育情況總結(jié)得出：雌激素峰后12 h內(nèi)，受孕率為84.6%(=13)；峰后12～24 h，受孕率為75%(=8)；峰值下降24 h后(≤37.8 h)，受孕率為85.7%(=7)(內(nèi)部資料)。大熊貓的生育窗口期定義為雌激素峰值后的48 h內(nèi)，在此期間需要進行自然交配和/或AI 1次或2次(Kersey.，2016)。侯蓉等(2012)報道在雌激素真實峰出現(xiàn)后24～48 h內(nèi)進行首次AI，完成后6～8 h進行第二次AI，妊娠率可達42.11%。Huang等(2012a)在2004—2010年對 14只成年雌性進行AI，首次在雌激素峰值當天，受孕率為75%，在峰后第1天內(nèi)的受孕率為29%，超過1 d的受孕率為0，整體為25%。沈潔娜等(2020)也報道首次AI平均時間為雌激素峰后29.8 h的受孕率高達46.7%(=16)。

雌激素可以直接反映卵泡發(fā)育程度，且不易受外界因素影響，其監(jiān)測較為準確、穩(wěn)定。雌激素監(jiān)測在大熊貓發(fā)情配種實踐中得到廣泛應(yīng)用，并獲得了較好的監(jiān)測效果。該方法促使自然交配的受孕率達75%以上，AI的受孕率在25%以上，甚至有接近50%的受孕率。目前國內(nèi)外研究機構(gòu)均將雌激素峰發(fā)生時間作為定義大熊貓生育窗口期的主導(dǎo)時間指標，并將該方法應(yīng)用于指導(dǎo)適時配種。

3.2 促黃體生成素(LH)與促卵泡激素(FSH)

LH與FSH均是由腦垂體前葉嗜堿性細胞分泌的糖蛋白激素，受下丘腦促性腺激素釋放激素控制，同時也受卵巢的正負反饋調(diào)控。LH對卵泡發(fā)育成熟和卵母細胞發(fā)育潛力獲得具有重要作用。FSH可促進卵泡顆粒層細胞增生分化，并促進卵巢發(fā)育。LH和FSH是調(diào)控卵泡生長的主要激素。類固醇性激素的產(chǎn)生依賴LH和FSH的協(xié)同作用，卵子的成熟和排出與LH 密切相關(guān)。

早期有學(xué)者利用生物測定法(施少清等，1988；曾國慶等，1990)和碘標人類LH雙抗法(林增云，1991)測定大熊貓LH含量。分析得出，血清LH峰與血清雌激素峰出現(xiàn)在同一天或者后1～2 d，而尿液LH峰與血清LH峰在同一天或后1 d出現(xiàn)(施少清等，1988；曾國慶等，1990)，尿液LH峰與尿液雌激素峰在同一天(施少清等，1988；林增云，1991；周杰瓏等，2007)或后 1～2 d出現(xiàn)(曾國慶等，1990；周杰瓏等，2007)。綜上，LH峰在雌激素峰后發(fā)生，并且在雌激素峰出現(xiàn)的當日或峰后1～2 d發(fā)生。

隨著ELISA的研發(fā)，LH的測定更方便、快捷。蔡志剛等(2010)利用與大熊貓同源最高動物的商業(yè)化ELISA試劑盒測定大熊貓尿液LH，發(fā)現(xiàn)LH峰與雌激素峰相差±8 h(產(chǎn)仔個體=4)，或者LH峰在雌激素峰后15～26 h出現(xiàn)(非產(chǎn)仔個體=2)。蔡開來等(2016)發(fā)明大熊貓LH檢測試劑盒并提供了檢測方法，通過尿液LH檢測可以實現(xiàn)對大熊貓發(fā)情及排卵的監(jiān)測。隨后，Cai等(2017)發(fā)現(xiàn)大熊貓個體間LH峰和雌激素峰的間隔時間不同，但尿液LH峰總是在雌激素峰之后出現(xiàn)，大多數(shù)產(chǎn)仔雌性在LH峰后10 h內(nèi)(受孕率為85.71%)或10～28 h(受孕率為33.33%)進行首次AI，尿液LH峰出現(xiàn)在雌激素峰后11.2 h±5.4 h(懷孕組)和14.8 h±7.4 h(非懷孕組)，LH大量分泌標志著排卵的發(fā)生，LH峰出現(xiàn)時間最適宜進行自然交配或AI。

測定發(fā)情期雌性大熊貓尿液FSH含量發(fā)現(xiàn)，從基礎(chǔ)值到峰值的間隔期約10 d，此持續(xù)時間即為大熊貓的卵泡期(約10 d)；同時，尿液FSH峰與尿液雌激素峰出現(xiàn)的時間一致(Monfort.，1989)。

與大熊貓類固醇性激素研究相比，LH與FSH的研究和報道較少、深度與廣度不夠，但在未來有很大的應(yīng)用前景，需要繼續(xù)研究。

4 生化分析

繁殖季節(jié)大熊貓肛周腺及尿液中很可能含有觸發(fā)生殖行為或與生殖有關(guān)的揮發(fā)性物質(zhì)。劉定震等(2003)利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測大熊貓尿液中揮發(fā)與半揮發(fā)性物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)性活躍的雄性尿液中含有更多揮發(fā)性強、相對分子質(zhì)量小的酸性物質(zhì)，在整個繁殖期的揮發(fā)性成分較非繁殖期多。發(fā)情期雌性尿液中的中鏈脂肪酸含量隨雌激素增加而增加(Dehnhard.，2006)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，雌性尿液中癸酸含量隨雌激素升高而顯著上升，進而激發(fā)雌性的發(fā)情行為，表明該物質(zhì)可能作為一種信息素來讓雌性吸引雄性，在排卵前會及時釋放(Dehnhard.，2016)。

劉俊英等(2000)已證實氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)也可以被應(yīng)用于大熊貓肛周腺性外激素的檢測。郭俊良(2020)研究顯示，發(fā)情期雌性肛周腺分泌物中含有122種化合物，其中2種脂肪酸酯(ethyl oleate和ethyl9-hexadecenoate)呈現(xiàn)出顯著差異性，并隨著發(fā)情的推進顯著增加，表明這2種化合物可能是雌性大熊貓?zhí)幱诎l(fā)情期特殊信號物，與發(fā)情狀態(tài)存在一定的關(guān)聯(lián)性。

大熊貓體液(尿液和肛周腺)生化的研究進展較緩慢，研究深度不夠，無法建立標準化的評估體系，且測試時間較長、費用較高。目前尚不能直接應(yīng)用在大熊貓適時配種上，但在大熊貓繁殖生理學(xué)研究中起著重要的作用，需要進一步研究。

5 微生物

生殖道內(nèi)的微生態(tài)系統(tǒng)是維持生殖道內(nèi)穩(wěn)態(tài)以及抵御外來有害病原重要的非特異性免疫系統(tǒng)，可以有效防御生殖道感染。雌性大熊貓的生殖道感染會引起繁殖障礙，甚至流產(chǎn)。早期已有學(xué)者對非發(fā)情狀態(tài)下雌性大熊貓生殖道內(nèi)的菌落結(jié)構(gòu)做了探究(雷蕾等，2001；胡國全等，2005)。劉燕等(2012)發(fā)現(xiàn)，在發(fā)情高峰期AI時陰道黏液中的鏈球菌屬、乳酸桿菌屬和大腸桿菌為主要菌群。馬曉平等(2016a，2016b)在發(fā)情期雌性陰道分泌物中獲得并鑒定出18株產(chǎn)HO的乳酸菌和30種真菌(包含25種霉菌和5種酵母菌)。近期也有研究表明，隨著發(fā)情繼續(xù)，雌性肛周腺中未分類假單胞菌屬__和彎曲桿菌屬等菌落的豐富度明顯增加，而考克氏菌屬、短狀桿菌屬、短桿菌屬及葡萄球菌屬等菌落的豐富度降低，推測發(fā)情期雌性會通過增加假單胞菌等和降低短桿菌、短狀桿菌豐富度的方式，以增加固醇類及脂肪酸酯類化合物的合成，進而釋放出發(fā)情期的氣味信號，有利于增加與異性的交流機會，達到發(fā)情配種的目的(郭俊良，2020)。微生物學(xué)方面的研究重點在于探討大熊貓發(fā)情期生殖道內(nèi)微生物群落特性，進一步證實微生物會參與大熊貓發(fā)情期某些化合物的合成，并揭示了特定微生物群落在發(fā)情期雌性大熊貓化學(xué)通訊中的作用。但微生物學(xué)研究與大熊貓發(fā)情評估及排卵監(jiān)測的關(guān)聯(lián)度較低，不具備指導(dǎo)適時配種的能力。

6 光譜化學(xué)

Kinoshita等(2012)利用近紅外光譜對3只發(fā)情周期個體進行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)雌性發(fā)情狀態(tài)與尿液中氫鍵水結(jié)構(gòu)的增加有關(guān)；水帶內(nèi)的E1G標準濃度與雌激素水平有較高的相關(guān)性；在E1G峰值前后即排卵前后，尿樣中強氫鍵水(S2、S3、S4)水平升高，弱氫鍵水(S0、S1)水平下降。近紅外光譜可用于快速、無創(chuàng)地檢測雌性發(fā)情程度。該檢測方法或許開辟了一個新的監(jiān)測領(lǐng)域，為大熊貓的發(fā)情配種提供了新的技術(shù)支持。但樣品量少，未來需要進一步調(diào)查，以完善這一新方法。

7 其他方法學(xué)研究

Wallach等(1980)報道了6只大熊貓在發(fā)情時陰道黏液分泌量最多可達15 mL，pH5.5～6.5,同時黏液中NaCl含量會增加，從而引起電阻值的改變。李惠福等(1983)、朱本仁和陳遠飛(1987)對 8只個體的11個發(fā)情周期進行研究，發(fā)現(xiàn)尿液中的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶在發(fā)情期的特異性變化與性行為高峰密切相關(guān)，且其第一峰與大部分雌性的行為高峰期吻合。侯蓉等(1998)發(fā)現(xiàn)4只正常發(fā)情大熊貓的陰道黏液電阻值會呈現(xiàn)出“V”形曲線，且其低谷值與尿液雌激素峰值對應(yīng)，配種可控制在電阻值回升時進行。除此以外，劉玉良等(2009)在10只個體的 23個發(fā)情周期中發(fā)現(xiàn)，宮頸黏液(麻醉采集)結(jié)晶在發(fā)情前期呈水草狀，排卵期(雌激素峰后0～1 d)呈典型的羊齒狀，排卵后的第2天消失。宮頸黏液中呈現(xiàn)出典型的羊齒狀結(jié)晶可能是判斷雌性排卵的一個參考指標，而在雌性唾液里同樣也發(fā)現(xiàn)了該現(xiàn)象(劉玉良等，2009；王無雙等，2013)。但現(xiàn)有研究中的個體數(shù)偏少、研究深度不夠、個體差異較大，甚至需要麻醉操作，宮頸黏液的生理學(xué)分析對大熊貓適時配種的應(yīng)用有待進一步驗證。在今后或許可以加強唾液生理學(xué)分析的深度與廣度，以替代宮頸黏液用于發(fā)情鑒定與排卵監(jiān)測。

除上述方法外，雌性大熊貓在發(fā)情期的基礎(chǔ)體溫(38.2～38.8 ℃)比正常體溫(非發(fā)情期體溫，36.5～37.5 ℃)高1 ℃以上，并在發(fā)情期前和發(fā)情后期出現(xiàn)低于正常體溫的現(xiàn)象(陳玉村，陳玉華，1983；陳玉村等，1985)。邱賢猛(1987)發(fā)現(xiàn)發(fā)情期雌性陰道黏膜層組織切片比非發(fā)情期厚10～15倍。邱賢猛(1988)進一步發(fā)現(xiàn)，隨著體內(nèi)雌激素水平的升高，雌性大熊貓陰道復(fù)層扁平上皮的中層細胞大量增生，發(fā)情個體的陰道復(fù)層扁平(鱗狀)上皮比非發(fā)情個體厚7～14倍。

綜上所述，基礎(chǔ)體溫監(jiān)測法與組織學(xué)分析僅能用于判斷大熊貓是否處于發(fā)情期，而無法確定發(fā)情程度，更不能判斷排卵時間，不足以指導(dǎo)大熊貓適時配種。發(fā)情期的體溫監(jiān)測在操作上也存在較大的難度。陰道活組織切片技術(shù)會對機體造成損傷，不提倡該方法的大量應(yīng)用。

8 總結(jié)及討論

國內(nèi)外研究者在大熊貓發(fā)情配種及排卵監(jiān)測上開展了大量的科學(xué)試驗及應(yīng)用實踐工作，本文論述了正在使用的監(jiān)測方法和評判標準。研究結(jié)果表明每種方法各有利弊，其指導(dǎo)實踐的成效也各有不同。這種差異性歸因于發(fā)情期及排卵期的生理反應(yīng)在細胞、組織、器官及系統(tǒng)中的響應(yīng)時間不同，以及各檢測方法的靈敏度及準確性不同。

大量實踐證實，行為和外陰觀察法是判定大熊貓發(fā)情程度最易操作且直觀的方法。但此方法易受觀察者的經(jīng)驗及其他主觀因素的影響，缺少穩(wěn)定性。對于發(fā)情行為典型的雌性大熊貓，依靠這2種方法能較準確地判斷和確定其配種時機。但對發(fā)情行為較隱蔽的個體，此方法的效能不足。除了行為觀察法外，陰道上皮細胞角化率也是早期較常用的監(jiān)測手段，但也存在個體差異性、發(fā)情高峰期樣品不易收集、采樣時會對雌性造成不同程度的外在刺激等問題，最終使得檢測的準確性和時效性降低。若在沒有其他監(jiān)測手段(如激素監(jiān)測)的情況下，陰道上皮細胞角化率監(jiān)測仍是不錯的選擇，可以同時結(jié)合行為和外陰形態(tài)判斷大熊貓的配種時機。

ELISA試劑盒的商業(yè)化及不斷改進，可以有效地測定大熊貓尿液、糞便等非損傷性樣品中的激素水平，從而避免麻醉、采血等應(yīng)激刺激對大熊貓繁殖機能的不利影響。同時ELISA兼具實驗條件簡單、操作便捷、價格不高、檢測時間較短(2～3 h)等特點。利用ELISA測定大熊貓雌激素水平在人工繁育中得到有效應(yīng)用，目前雌激素監(jiān)測被證明是確定自然交配或AI時間最準確的方法(彭世媛，葉志勇，1993；黃炎等，2001；Laura.，2002；喻述容等，2003；楊勝林等，2007；Kersey.，2010；Huang.，2012a，2012b；劉敏，2016；Wauters.，2018；沈潔娜等，2020)。

綜合前人研究(Bonney.，1982；Hodge.，1984；施少清等，1988；曾國慶等，1990；李復(fù)東等，1993；彭世媛，葉志勇，1993；謝鐘等，1994；Czekala.，2003；董武子，竇忠英，2003；Kersey.，2006；楊勝林等，2007；Huang.，2012a，2012b)，自然交配時間應(yīng)控制在雌激素峰出現(xiàn)的當天或峰后1～3 d內(nèi)；AI控制在雌激素峰后48 h內(nèi)進行1次或2次。由于以上的大部分研究數(shù)據(jù)僅基于每日1次的采樣頻率，對于雌激素真實峰發(fā)生時間的判斷會出現(xiàn)較大偏差，進而影響到配種時間的精準確定，導(dǎo)致分析結(jié)果差異。因此，為了確定尿液中雌激素真實峰的發(fā)生時間，應(yīng)將尿液采集頻率控制在3～6 h采樣1次。結(jié)合雌激素與受孕率的關(guān)系(周杰瓏等，2007；Huang.，2012a；侯蓉等，2012；Cai.，2017；沈潔娜等，2020)，自然交配控制在雌激素峰后36 h內(nèi)進行1～2次；首次AI時間在雌激素峰后12 h內(nèi)，12～24 h后進行第2次。若首次AI時間在峰后12～24 h，則6～12 h后進行第2次。

LH大量分泌標志著排卵即將發(fā)生，理論上LH峰出現(xiàn)時間是最適宜進行自然交配或AI。但由于大熊貓LH的ELISA試劑盒的商業(yè)化還在進行中，現(xiàn)階段無法普及應(yīng)用，數(shù)據(jù)量也還需進一步積累以進行更多的實踐驗證。而其他監(jiān)測方法，如生化分析、微生物學(xué)分析、光譜化學(xué)分析、組織學(xué)分析、基礎(chǔ)體溫監(jiān)測、宮頸黏液生理學(xué)分析等，由于研究關(guān)聯(lián)度低、數(shù)據(jù)少、采樣困難、費用較高、試驗時間較長、方法不夠成熟等，對大熊貓繁殖生產(chǎn)實踐的指導(dǎo)意義不大，可作基礎(chǔ)性研究。

綜上所述，行為監(jiān)測、外陰評估、雌激素監(jiān)測和陰道細胞角化率是較有效的雌性大熊貓發(fā)情程度鑒定及排卵監(jiān)測的方法，尤其是前三者更為常用。各繁育機構(gòu)可根據(jù)自身實際條件選擇其中一種或多種，建立切實有效的發(fā)情監(jiān)測體系，比如：以雌激素為主，行為、外陰為輔的評估體系；或行為、外陰與陰道細胞角化率三者共同評估的體系。其他監(jiān)測方法需進一步完善。

9 展望

在人類和其他哺乳動物上發(fā)現(xiàn)，發(fā)情期宮頸黏液中酶、蛋白質(zhì)及碳水化物等物質(zhì)均存在生理性的變化(王紅等，1994；曹纘孫，1995；杜小麗，趙青云，1996)。根據(jù)宮頸黏液物理特性和化學(xué)組分隨卵巢激素分泌變化而出現(xiàn)周期改變的特點，宮頸黏液評分應(yīng)用于評價卵巢功能和預(yù)測排卵具有可行性(曹纘孫，1995)，因此未來大熊貓宮頸黏液評分的應(yīng)用對發(fā)情鑒定、排卵判斷和卵巢功能評估或許具有較為可行的參考價值。此外，可以利用影像技術(shù)(B超或腹腔鏡)監(jiān)測發(fā)情期大熊貓卵巢狀態(tài)，找到卵泡發(fā)育與性激素水平的協(xié)同關(guān)系，以此推測排卵時間。從目前大熊貓發(fā)情鑒定和排卵監(jiān)測方法的研究進展來看，生殖內(nèi)分泌學(xué)和醫(yī)學(xué)影像學(xué)是今后研究新監(jiān)測方法的主要領(lǐng)域。