高玉紅，戶春麗，馬燕芬，汪書哲，馬 云

（寧夏回族自治區(qū)反芻動(dòng)物分子細(xì)胞育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

牛肉是目前人們消費(fèi)的主要肉產(chǎn)品之一，且經(jīng)常食用牛肉有助于防止糖尿病、 心血管疾病的發(fā)生［1］。 脂肪細(xì)胞增殖、分化過程涉及轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)、信號(hào)傳導(dǎo)及網(wǎng)絡(luò)式調(diào)控［2-3］。 CAP2 蛋白是蛋白環(huán)化酶相關(guān)蛋白 （adenylate cyclase-associated protein，CAP）家族的成員之一，CAP 蛋白在釀酒酵母中被鑒定為腺苷酸環(huán)化酶結(jié)合蛋白［4］，其功能豐富， 含有2 個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，CAP2 基因的缺失可導(dǎo)致傳導(dǎo)異常和擴(kuò)張型心肌?。╠ilated cardiomyopathy，DCM）以致心臟猝死［5-7］，肌原纖維分化延遲和新生骨骼肌的運(yùn)動(dòng)功能缺陷［8］、先天性異常、心臟缺陷等［9］。 此外，CAP2 基因的有害突變，導(dǎo)致嚴(yán)重的DCM 和致命的充血性心力衰竭［10］。 CAP2基因調(diào)控肌原纖維肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架分化， 對(duì)骨骼肌結(jié)構(gòu)和功能發(fā)揮至關(guān)重要的作用［8］。 CAP2 蛋白磷酸化影響能量代謝， 影響脂肪沉積［11］， 推測CAP2 基因與脂肪細(xì)胞分化有關(guān)， 但尚未報(bào)道CAP2 基因在牛上的功能機(jī)制。該研究選擇秦川牛脂肪組織為材料， 擴(kuò)增CAP2 基因的編碼區(qū)序列（CDS），利用生物信息學(xué)方法分析CAP2 基因編碼蛋白的理化性質(zhì)，應(yīng)用qPCR 方法探析CAP2 基因在秦川牛組織和原代脂肪細(xì)胞中的時(shí)序表達(dá)，為進(jìn)一步探索CAP2 基因調(diào)控秦川牛特有的脂肪發(fā)育的功能提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 組織及細(xì)胞來源

秦川牛各組織由寧夏回族自治區(qū)反芻動(dòng)物分子細(xì)胞育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室采集凍存， 該試驗(yàn)采用秦川牛心、肝、脾、肺、腎、脂肪和肌肉組織為材料；秦川牛原代脂肪細(xì)胞來自牛背部脂肪組織， 現(xiàn)用現(xiàn)分離。

1.1.2 主要試劑

Trizol 試劑、 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×phanta max master mix、2×SYBRRPremix Ex TaqTM（2×）、pMD-18T 載體購自Takara 公司；DL 2 000 DNA Marker、膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA 公司；DH5α 感受態(tài)細(xì)胞購自北京索萊寶科技有限公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基、Ⅰ型膠原酶、青霉素/鏈霉素抗體、胰蛋白消化酶、1×PBS 購自?？寺∩锘瘜W(xué)制品（北京）有限公司；胎牛血清購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司； 羅格列酮、 地塞米松和IBMX 均購自Singma 公司；國產(chǎn)無水乙醇、異丙醇、氯仿、甲醛等試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 牛CAP2 基因CDS 區(qū)克隆

依據(jù)GenBank（登錄號(hào)：NC_037350.1）上公布的牛CAP2 基因序列， 設(shè)計(jì)CAP2 基因特異性引物。 提取脂肪組織和細(xì)胞總RNA，檢測總RNA 的質(zhì)量及濃度，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA， 于-20 ℃冰箱保存。 以脂肪組織cDNA原液為模板進(jìn)行基因擴(kuò)增，引物信息見表1。 PCR擴(kuò)增體系15 μL：2×phanta max master mix 7.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 模板1.5 μL，ddH2O 4 μL。 運(yùn)用Touch down PCR 反應(yīng)程序： 預(yù)變性3 min （95 ℃），變性30 s（95 ℃），復(fù)性30 s（62 ℃），退火30 s （72 ℃），28 個(gè)循環(huán)；變性45 s（95 ℃），延伸35 s （52 ℃），退火30 s（72 ℃），延伸10 min（72℃）。 用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物以驗(yàn)證擴(kuò)增條帶， 膠回收純化后用pMD18-T 載體16℃連接4 h， 將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，選取陽性菌液送至北京奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行測序驗(yàn)證，運(yùn)用DNAMAN 軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析［12-14］。

表1 引物信息

1.2.2 牛CAP2 基因生物信息學(xué)分析

通過NCBI 中的BLAST 模塊將克隆得到的牛CAP2 基因序列進(jìn)行同源性分析。 運(yùn)用ProtPram（https：//web.expasy.org/protparam/） 分 析CAP2 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)； 運(yùn)用ProtScal（https：//web.expasy.org/protscale/） 分析CAP2 蛋白的親疏水性； 運(yùn)用TMHMM （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測CAP2 蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)； 運(yùn)用NetPhos 3.1 Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）預(yù)測CAP2 蛋白中潛在的磷酸化位點(diǎn)；運(yùn)用SOPMA分析CAP2 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)；運(yùn)用SWISSMODEL 分析CAP2 蛋白三級(jí)空間構(gòu)型。

1.2.3 牛CAP2 基因組織表達(dá)模式

以各組織樣品cDNA（原液稀釋10 倍）為模板，以GAPDH 基因?yàn)閮?nèi)參進(jìn)行qPCR， 檢測牛CAP2基因在秦川牛7 種組織中的表達(dá)水平， 引物信息見表1，體系參照文獻(xiàn)［13］。 反應(yīng)程序：95 ℃3 min；95 ℃5 s，60 ℃30 s，39 個(gè)循環(huán)；95 ℃30 s，95 ℃15 s。 每組待測樣品設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。

作為中國鉀肥事業(yè)的參與者、傳播者和守望者，中國農(nóng)資傳媒“鉀肥觀察家”對(duì)于當(dāng)前中國鉀肥市場也有一定的思考。我們認(rèn)為，鉀肥聯(lián)合談判機(jī)制是中國市場的必然選擇，應(yīng)當(dāng)由各行業(yè)組織牽頭，以聽證會(huì)的方式進(jìn)行摸底，聽取下游用戶企業(yè)建議，形成共識(shí)、協(xié)調(diào)采購。供給方面跟蹤國內(nèi)資源勘探信息、采集國內(nèi)鉀肥企業(yè)產(chǎn)量化數(shù)據(jù)，需求方面了解復(fù)合肥企業(yè)采購意愿、針對(duì)生產(chǎn)規(guī)模調(diào)研和摸底。

1.2.4 牛原代脂肪細(xì)胞分離培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化

采用組織塊分離法分離培養(yǎng)牛脂肪細(xì)胞，具體操作步驟如下： 樣品運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后需行無菌操作，剝除外層表皮、表皮膜、肉眼可見的結(jié)締組織及血管；將脂肪組織分離成直徑4～5 mm 黃豆大小的組織塊，接種于90 mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿，將培養(yǎng)皿倒置，放入37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h；加入8 mL 含10%FBS 血清、1%雙抗的DMEM 高糖培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)10 d；約10 d 后觀察組織塊附近是否游離出大量細(xì)胞； 去除組織塊，PBS 沖洗，胰蛋白酶消化5 min，1 000 r/min 離心5 min，根據(jù)試驗(yàn)需要進(jìn)行傳代或凍存。具體方法參照文獻(xiàn)［15］。對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)：細(xì)胞密度達(dá)到約90%時(shí)，更換誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基； 誘導(dǎo)2 d 后， 更換維持分化培養(yǎng)基； 接下來每隔2 d 需要更換1 次維持分化培養(yǎng)基。 并收集誘導(dǎo)0、2、6、8、10 d 的細(xì)胞用于qPCR分析，方法參照文獻(xiàn)［14］。

1.2.5 油紅O 染色

牛原代脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化結(jié)束后，10%福爾馬林室溫固定5 min；棄原有福爾馬林，加入等量的10%福爾馬林，室溫孵育30 min；棄福爾馬林，60%異丙醇清洗，靜置干燥培養(yǎng)皿；避光加入抽濾過的提前配制好的油紅O 工作液， 室溫孵育20～30 min； 棄油紅O 染液，PBS 立即清洗3～4 次，顯微鏡下觀察拍照。 具體方法可以參照文獻(xiàn)［16］。

1.2.6 細(xì)胞總RNA 的提取及CAP2、FABP4 和PPARγ 基因時(shí)序表達(dá)譜分析

細(xì)胞總RNA 的提取、檢測及保存方法同組織提取法。 采用qPCR 技術(shù)檢測牛脂肪細(xì)胞分化0、2、6、8、10 d 中CAP2、FABP4 和PPARγ 基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

利用2-ΔΔCt法分析qPCR 的結(jié)果，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”的形式表示。運(yùn)用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析 （One-Way ANOVA）和Student′s t 檢驗(yàn)，P＜0.01 為差異極顯著，P＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛CAP2 基因CDS 區(qū)分析

圖1 秦川牛CAP2 基因克隆

2.2 秦川牛CAP2 基因與不同物種CAP2 基因同源性分析

利用ProtPram 分析可知， 克隆得到的秦川牛CAP2 基因CDS 區(qū)全長為1 461 bp，編碼486 個(gè)氨基酸（見表2）。將秦川牛CAP2 基因及氨基酸序列與北美野牛（Bison）、水牛（Bubalus bubalis）、羚羊（Oryx dammah）、駱駝（Camelus ferus）、豬（Sus scrofa）、人（Homo sapiens）和家鼠（Mus musculus）等物種進(jìn)行同源性分析， 發(fā)現(xiàn)在家畜中該基因與水牛（Bubalus bubalis）、 羚羊 （Oryx dammah）、 駱駝（Camelus ferus）等的同源性都很高，核苷酸和氨基酸同源性達(dá)90 %以上；與斑馬魚（Danio rerio）同源性較低，核苷酸同源性為54%，氨基酸同源性為65%（見表3）。同時(shí)根據(jù)氨基酸序列，構(gòu)建物種進(jìn)化樹（見圖2），與序列比對(duì)結(jié)果一致，在家畜中秦川牛與北美野牛（Bison）的親緣關(guān)系最近，與斑馬魚（Danio rerio）的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖2 秦川牛與其他物種CAP2 基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹

表2 CAP2 的氨基酸組成

表3 秦川牛CAP2 基因與其他已知物種的核苷酸、氨基酸序列比對(duì)結(jié)果

2.3 牛CAP2 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)的預(yù)測

運(yùn)用ProtPram 在線分析發(fā)現(xiàn)該基因的氨基酸主要為疏水性殘基（見圖3A），說明該蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；TMHMM 2.0 Server v. 分析結(jié)果顯示，CAP2 基因的編碼產(chǎn)物不存在跨膜螺旋（TMHs）結(jié)構(gòu)（見圖3B）；NetPhos 3.1 Server 分析發(fā)現(xiàn)CAP2 蛋白中存在46 處潛在的磷酸化位點(diǎn)， 包括Ser22、Thr73、Tyr95 等（見圖3C）。運(yùn)用SOPMA 在線軟件分析發(fā)現(xiàn)CAP2 蛋白序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為α-螺旋（alpha helix， 藍(lán)色長豎線區(qū)） 和無規(guī)則卷曲（random coil，紫色短豎線區(qū)），分別占比36.63%、44.24%；延伸鏈（extended strand，紅色豎線區(qū)）和β-轉(zhuǎn)角（beta turn，綠色豎線區(qū)）占15.02 %、4.12 %（見圖3D）。 運(yùn)用SWISSMOD-EL 軟件進(jìn)一步預(yù)測CAP2蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)（見圖3E），分析發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)主要由無規(guī)則卷曲和α-螺旋構(gòu)成，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致。

圖3 牛CAP2 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

2.4 牛CAP2 基因在不同組織中的表達(dá)分析

以秦川牛肝臟平均Cq 值為對(duì)照， 檢測CAP2基因在秦川牛各組織中的相對(duì)表達(dá)水平。 結(jié)果表明（見圖4）：CAP2 基因在各組織中都表達(dá)，其中在脂肪組織中表達(dá)量最高（P＜0.01），心組織次之（P＜0.05）。

圖4 秦川牛CAP2 基因組織表達(dá)分析

2.5 牛原代脂肪細(xì)胞的分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化

采用組織塊法分離培養(yǎng)牛脂肪細(xì)胞， 將組織塊接種至90 mm 培養(yǎng)皿，9 d 后可觀察到組織塊周圍游離出大量細(xì)胞（見圖5A），隨即消化、融合培養(yǎng)細(xì)胞，待密度達(dá)到90%以上（見圖5B）后凍存，備用。 試驗(yàn)細(xì)胞繼續(xù)傳代培養(yǎng)6 d（見圖5C）后將二代細(xì)胞傳代繼續(xù)培養(yǎng)至融合度達(dá)到90%以上，然后傳代至90 mm 培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)3 d 后（見圖5D）細(xì)胞基本融合用于誘導(dǎo)分化。

圖5 牛原代脂肪細(xì)胞分離培養(yǎng)（40×）

2.6 牛原代脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化鑒定及CAP2、PPARγ 和FABP4 基因細(xì)胞時(shí)序表達(dá)分析

油紅O 結(jié)果顯示，誘導(dǎo)分化組（見圖6A）比對(duì)照組（見圖6B）脂滴數(shù)增加，說明牛脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)成功。 qPCR 檢測PPARγ、FABP4 和CAP2 基因在牛脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá) （見圖6C～E）。CAP2 基因隨細(xì)胞分化時(shí)間的推移，表達(dá)量逐漸上升，第10 天時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大（P＜0.001）；PPARγ和FABP4 表達(dá)量也隨時(shí)間上調(diào)（P＜0.01）。 三者表達(dá)趨勢(shì)一致， 說明CAP2 基因可能促進(jìn)牛脂肪細(xì)胞分化。

圖6 牛原代脂肪細(xì)胞分化過程中PPARγ（C）、FABP4（D）和CAP2（E） 基因的表達(dá)量

3 討論

CAP2 基因最初是在酵母中發(fā)現(xiàn)的，能夠調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞骨架，與細(xì)胞遷移相關(guān)，是腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，能為分子靶向治療提供依據(jù)［17］。在肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）、乳腺癌中CAP2 基因均呈高表達(dá)［17］， 且在HCC 中上調(diào)，參與HCC 的發(fā)展過程，可作為HCC 診斷的分子標(biāo)記物［18］。 研究表明CAP2 基因在惡性黑色素瘤中過表達(dá)，參與了惡性黑色素瘤的侵襲行為，是其預(yù)后的一種新標(biāo)志物［19］。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，從秦川牛中獲得的CAP2 基因序列與水牛（Buffalo）同源相近，與同為反芻動(dòng)物的駱駝（Camelus ferus）、綿 羊（Ovis aries）和 鹿（Cervus elaphus）同 源 性 達(dá)90%以上，與家鼠（Mus musculus）同源性達(dá)80%以上，如果蛋白質(zhì)功能類似，那么可以將小鼠作為模式動(dòng)物， 進(jìn)一步探索CAP2 在脂肪沉積中的調(diào)控作用。 蛋白編碼分析顯示CAP2 基因共編碼486個(gè) 氨 基 酸，Ala、Glu、Gly、His、Met 的 占 比 超 過 了5%；CAP2 基因編碼蛋白的分析顯示，CAP2 蛋白屬于疏水性蛋白，不具有膜蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能；磷酸化位點(diǎn)分析后顯示，牛CAP2 蛋白存在46 處潛在的磷酸化位點(diǎn)。研究報(bào)道，大部分蛋白可通過磷酸化與去磷酸化的方式實(shí)現(xiàn)核質(zhì)穿梭等亞細(xì)胞定位的改變［20］。 綜上所述，秦川牛CAP2 基因在物種間高度保守，可將小鼠作為模式動(dòng)物，進(jìn)一步挖掘CAP2 基因在脂肪代謝中的調(diào)控作用。

CAP2 基因在心、腦、肌肉等組織中表達(dá)較高且在心肌細(xì)胞中具有關(guān)鍵功能并能調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖活性［21-22］，這與該研究組織表達(dá)結(jié)果基本一致。 還有研究表明，CAP2 基因通過促進(jìn)LRP5/6 磷酸化，參與Wnt 信號(hào)調(diào)節(jié)。 Wnt 基因是調(diào)控脂肪細(xì)胞分化增殖的調(diào)節(jié)因子， 推測CAP2 基因?qū)χ景l(fā)育起重要作用， 但目前CAP2 基因研究主要集中在疾病方面， 還未見關(guān)于CAP2 基因在脂肪生成作用上的報(bào)道，因此，該試驗(yàn)分離培養(yǎng)牛原代脂肪細(xì)胞，并進(jìn)行誘導(dǎo)分化，檢測CAP2 和成脂標(biāo)志基因PPARγ 和FABP4 基因在細(xì)胞分化過程中的表達(dá)量， 結(jié)果顯示，CAP2 基因在誘導(dǎo)分化的0 d 表達(dá)較低，此后表達(dá)量逐漸上升，于第10 天表達(dá)量最高（P＜0.01），由此推測，細(xì)胞內(nèi)脂滴聚集可能導(dǎo)致CAP2 基因的高表達(dá)。 PPARγ 和FABP4 基因的表達(dá)量隨牛脂肪細(xì)胞分化逐漸增加， 且在分化的第10 天達(dá)到最大（P＜0.01）。 這與先前有研究者報(bào)道得到的結(jié)果一致［23］。 綜上所述，CAP2 基因在牛脂肪組織中特異性高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制將是后續(xù)研究的重點(diǎn)。

4 結(jié)論

該試驗(yàn)成功克隆出了秦川牛CAP2 基因全長1 461 bp 的編碼區(qū)，共編碼486 個(gè)氨基酸。 利用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)CAP2 蛋白是一種無規(guī)則卷曲和α-螺旋、磷酸化的疏水性結(jié)構(gòu)蛋白。 同時(shí)利用qPCR 技術(shù)檢測了CAP2 基因在秦川牛心、 肝、脾等7 個(gè)組織和牛脂肪細(xì)胞中的表達(dá)量， 分析發(fā)現(xiàn)CAP2 基因在牛脂肪組織中以較高水平表達(dá)，在脂肪細(xì)胞分化過程中呈現(xiàn)逐漸上升的變化趨勢(shì)，揭示了CAP2 基因可能參與脂肪生成與分化過程，為進(jìn)一步挖掘秦川牛CAP2 基因在脂肪發(fā)育和能量代謝方面的功能提供前期基礎(chǔ)。