包靜飄 李彬 吳江紅 吳增楷 沈杰 宋鵬麗 彭琪 胡國勇

上海市胰腺疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一人民醫(yī)院消化科，上海 200080

腺泡細(xì)胞死亡是AP的重要特征之一，其中壞死和凋亡是腺泡細(xì)胞死亡的兩種主要方式[1]。AP的嚴(yán)重程度與腺泡細(xì)胞的死亡方式密切相關(guān)，重癥急性胰腺炎時(shí)通常伴隨大量的腺泡細(xì)胞壞死，可引起強(qiáng)烈的胰腺局部炎癥反應(yīng)，并導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征和遠(yuǎn)端臟器損傷，而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡則可減輕胰腺損傷[2-4]。本課題組前期研究證實(shí)胰腺腺泡細(xì)胞壞死和凋亡的比例決定了AP的嚴(yán)重程度[5]。因此，在AP發(fā)生的早期重塑腺泡細(xì)胞死亡方式可能是治療及預(yù)防AP重癥化演變的有效手段。為尋找有效調(diào)控AP時(shí)腺泡細(xì)胞死亡方式的藥物，本課題組利用Sigma-Aldrich藥理活性小分子化合物庫進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑喜樹堿與腺泡細(xì)胞凋亡相關(guān)。喜樹堿是一種特異性拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑，通過形成穩(wěn)定的喜樹堿-拓?fù)洚悩?gòu)酶I-DNA復(fù)合物導(dǎo)致DNA損傷，使細(xì)胞周期停滯在S期，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]。本研究通過建立小鼠AP模型，觀察喜樹堿對(duì)AP嚴(yán)重程度和腺泡細(xì)胞死亡方式的影響，旨在探討喜樹堿在AP及腺泡細(xì)胞死亡中的作用，為尋找新型有效的AP治療藥物提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、動(dòng)物模型制備及分組

18只雄性8周齡Balb/C小鼠，體重20～25 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。將小鼠按數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組、AP組和喜樹堿干預(yù)組(喜樹堿組)，每組6只。AP組采用腹腔注射雨蛙肽(100 μg/kg，10次，美國MCE公司)，每次間隔1 h，末次雨蛙肽注射后再注射脂多糖(5 mg/kg，美國Sigma公司)的方法制備AP模型；喜樹堿組于AP造模前0 h腹腔注射喜樹堿(美國Sigma公司)；對(duì)照組小鼠腹腔注射等體積生理鹽水。為確定喜樹堿在AP時(shí)發(fā)揮作用的最佳濃度，先應(yīng)用25 mg/kg和50 mg/kg的劑量對(duì)AP造模組小鼠進(jìn)行干預(yù)。各組于首次注射雨蛙肽后12 h處死小鼠，眼眶取血，剖腹取胰腺和肺組織。

二、觀察指標(biāo)

1.胰腺和肺組織病理學(xué)檢查：胰腺和肺組織置于4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅染色。胰腺組織根據(jù)水腫、炎癥和壞死程度進(jìn)行病理評(píng)分[7]，肺組織根據(jù)肺泡壁水腫和炎癥細(xì)胞浸潤程度進(jìn)行病理評(píng)分[8]。

2.血清淀粉酶和脂肪酶檢測(cè)：采用ELISA試劑盒測(cè)定血清淀粉酶和脂肪酶水平，按說明書操作。

3.胰腺組織IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)檢測(cè)：采用Trizol試劑(日本Takara公司)提取胰腺組織總RNA，并按PrimeScript RT Master Mix試劑盒(日本Takara公司)說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒(日本Takara公司)進(jìn)行RT-PCR。IL-1β上游引物序列為5′-ATGCCACCTTTTGACAGTGATG-3′，下游引物序列為5′-TGATGTGCTGCTGCGAGATT-3′；IL-6上游引物序列為5′-CCGGAGAGGAGACTTCACAG-3′，下游引物序列為5′-CATTTCCACGATTTCCCAGA-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物序列為5′-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′，下游引物序列為5′-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3′。PCR反應(yīng)條件：95℃ 30 s、95℃ 5 s、60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。采用公式2-△△CT計(jì)算IL-1β、IL-6 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

4.胰腺和肺組織CD45+細(xì)胞和程序性壞死標(biāo)志蛋白混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein, MLKL)磷酸化表達(dá)水平檢測(cè)：采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)胰腺及肺組織CD45+細(xì)胞數(shù)量及胰腺組織磷酸化MLKL蛋白表達(dá)量，按照試劑盒說明書操作。CD45單克隆抗體(美國CST公司)和磷酸化MLKL單克隆抗體(美國Abcam公司)工作濃度均為1∶100。CD45陽性表現(xiàn)為胰腺間質(zhì)、肺間質(zhì)或肺泡腔內(nèi)出現(xiàn)紫紅色顆粒，光鏡下每個(gè)樣本隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野(200倍)，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中CD45陽性細(xì)胞數(shù)量。磷酸化MLKL蛋白表達(dá)陽性為腺泡細(xì)胞胞質(zhì)呈棕色，每個(gè)樣本隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野，根據(jù)腺泡細(xì)胞棕色染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞率進(jìn)行評(píng)分。無染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細(xì)胞率0～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76～100%為4分。兩評(píng)分相乘為總評(píng)分。

5.胰腺組織凋亡細(xì)胞檢測(cè)：采用TUNEL法檢測(cè)胰腺組織細(xì)胞凋亡。凋亡試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，按照說明書操作。凋亡指數(shù)=(凋亡細(xì)胞總數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、喜樹堿減輕AP小鼠胰腺和肺組織損傷

對(duì)照組小鼠胰腺和肺組織均無明顯病理改變。AP組小鼠胰腺組織呈現(xiàn)明顯的間質(zhì)水腫、炎癥細(xì)胞浸潤和腺泡細(xì)胞壞死，肺組織見肺泡壁明顯水腫、增厚，炎癥細(xì)胞浸潤增加。腹腔注射50 mg/kg喜樹堿干預(yù)的AP小鼠胰腺和肺組織的上述病理變化較AP組和25 mg/kg喜樹堿干預(yù)組均有明顯改善(圖1)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用50 mg/kg劑量進(jìn)行干預(yù)。

AP組胰腺、肺組織病理評(píng)分均明顯高于對(duì)照組，而喜樹堿組顯著低于AP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05，表1)。AP組小鼠血清淀粉酶和脂肪酶水平較對(duì)照組均顯著升高，喜樹堿組淀粉酶和脂肪酶水平較AP組均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05，表1)。提示喜樹堿能有效減輕AP小鼠胰腺和肺組織損傷。

表1 3組小鼠胰腺和肺組織病理評(píng)分及血清淀粉酶和脂肪酶水平的比較

二、喜樹堿緩解AP小鼠胰腺和肺組織的炎癥反應(yīng)

對(duì)照組、AP組、喜樹堿組小鼠胰腺組織中IL-1 mRNA表達(dá)量分別為1.39±1.12、212.35±80.61、95.79±48.11，IL-6 mRNA表達(dá)量分別為1.11±0.55、1006.80±509.06、255.50±213.32，AP組均較對(duì)照組顯著升高，喜樹堿組較AP組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P值均<0.05)。

對(duì)照組、AP組、喜樹堿組小鼠胰腺組織CD45+細(xì)胞浸潤的數(shù)量分別為(0.33±0.58)、(59.83±13.67)、(14.25±5.32)個(gè)/高倍視野，肺組織CD45+細(xì)胞浸潤的數(shù)量分別為(45.00±4.24)、(58.24±5.91)、(29.20±4.44)個(gè)/高倍視野，AP組均顯著高于對(duì)照組，而喜樹堿組顯著低于AP組(圖2)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。提示喜樹堿能顯著減輕AP小鼠胰腺和肺組織的炎癥反應(yīng)。

圖2 對(duì)照組、急性胰腺炎組、喜樹堿組小鼠胰腺組織(2A～2C)和肺組織(2D～2F)CD45+細(xì)胞浸潤(免疫組織化學(xué)染色 ×200)

三、喜樹堿誘導(dǎo)AP小鼠胰腺細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞壞死

對(duì)照組、AP組、喜樹堿組小鼠胰腺腺泡細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為(0.58±0.43)%、(1.92±0.29)%、(3.64±1.16)%，喜樹堿組較AP組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示喜樹堿能顯著誘導(dǎo)AP小鼠胰腺腺泡細(xì)胞凋亡。

對(duì)照組、AP組、喜樹堿組小鼠胰腺磷酸化MLKL蛋白的免疫組織化學(xué)評(píng)分分別為(0.56±0.19)、(4.53±1.28)、(1.75±0.20)分，喜樹堿組顯著低于AP組(圖3)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示喜樹堿能顯著抑制AP小鼠胰腺腺泡細(xì)胞壞死。

注：MLKL為混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白

討 論

本課題組前期研究證實(shí)[5]，AP的嚴(yán)重程度與腺泡細(xì)胞壞死呈正相關(guān)，與凋亡呈負(fù)相關(guān)。為進(jìn)一步探究調(diào)控腺泡細(xì)胞死亡方式的分子機(jī)制，本課題組通過藥理活性小分子化學(xué)庫篩選影響腺泡細(xì)胞存活的潛在靶點(diǎn)。篩選結(jié)果提示拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑喜樹堿可能參與調(diào)控AP時(shí)腺泡細(xì)胞凋亡。喜樹堿是拓?fù)洚悩?gòu)酶I的特異性抑制劑，多項(xiàng)研究表明喜樹堿能夠誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[9-14]。早期研究發(fā)現(xiàn)，喜樹堿在活化的人外周血淋巴細(xì)胞中可以促進(jìn)細(xì)胞周期從G1期向S期轉(zhuǎn)變，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]。Liu等[15]在人角質(zhì)形成細(xì)胞中的研究提示，喜樹堿能夠抑制端粒酶活性，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。另外，研究表明喜樹堿能通過增加胞質(zhì)內(nèi)Ca2+和降低線粒體膜電位影響線粒體功能，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞凋亡[16-17]。Zeng等[18]在腫瘤細(xì)胞中證實(shí)喜樹堿促進(jìn)Bak1和Mcl1蛋白的表達(dá)，通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。喜樹堿還可以引起細(xì)胞內(nèi)活性氧水平和DNA損傷顯著增加，促進(jìn)氧化應(yīng)激，從而調(diào)控細(xì)胞死亡[19]。此外，Kobayashi等[20]研究結(jié)果顯示，喜樹堿誘導(dǎo)人中性粒細(xì)胞凋亡的同時(shí)，能顯著下調(diào)IL-18和Toll樣受體-6等炎癥相關(guān)分子的表達(dá)，抑制其促炎作用。然而，拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑對(duì)AP及腺泡細(xì)胞死亡的影響，尚無文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示，喜樹堿能有效減輕AP小鼠胰腺病理損傷，減少胰腺組織CD45+細(xì)胞浸潤數(shù)量和降低炎癥細(xì)胞因子表達(dá)量；同時(shí)，經(jīng)喜樹堿干預(yù)后，AP小鼠胰腺炎相關(guān)肺損傷顯著減輕，肺組織CD45+細(xì)胞浸潤數(shù)量也明顯減少。提示喜樹堿能有效減輕AP小鼠胰腺損傷及相關(guān)肺損傷，減輕局部和全身炎癥反應(yīng)。此外，為研究拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑對(duì)AP腺泡細(xì)胞死亡的影響，本研究進(jìn)一步檢測(cè)了小鼠胰腺腺泡細(xì)胞凋亡指數(shù)和程序性壞死標(biāo)志蛋白MLKL的磷酸化水平，結(jié)果顯示喜樹堿干預(yù)組小鼠胰腺細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯升高，而MLKL磷酸化水平明顯降低。

綜上所述，拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑喜樹堿可能通過重塑AP小鼠腺泡細(xì)胞死亡方式減輕胰腺局部損傷及相關(guān)肺損傷，從而為AP的臨床治療提供新的思路和靶點(diǎn)。鑒于拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑能通過多種途徑調(diào)控細(xì)胞死亡，未來的研究將聚焦于其在AP時(shí)腺泡細(xì)胞死亡中的具體機(jī)制。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明包靜飄、吳江紅、李彬：實(shí)驗(yàn)操作、論文撰寫；吳增楷、沈杰、宋鵬麗、彭琪：數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；胡國勇：研究指導(dǎo)、論文修改、經(jīng)費(fèi)支持