固定化脂肪酶TLIM催化制備低芥酸文冠果甘油酯

徐春暉，王 瑤，杜俊民

（山西中醫(yī)藥大學(xué) 中藥與食品工程學(xué)院，山西 晉中 030619）

隨著全球人口老齡化，與年齡有關(guān)的神經(jīng)退行性疾病越來(lái)越普遍，阿爾茨海默癥（Alzheimer’s disease, AD）是老年人群中最常見(jiàn)的癡呆癥[1]。最近的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全世界約有5 000萬(wàn)人患有阿爾茨海默癥或其他類型的癡呆癥，影響著全球超過(guò)3 500萬(wàn)人，年輕人也可能患AD?；疾『髸?huì)導(dǎo)致海馬區(qū)以及大腦皮層大量淀粉樣斑塊沉積、神經(jīng)原纖維纏結(jié)和特定腦區(qū)選擇性神經(jīng)元和突觸丟失[2]。研究證明，神經(jīng)酸能夠恢復(fù)神經(jīng)末稍活性，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育，能夠明顯治療和預(yù)防阿爾茨海默病[3-4]。文冠果（Xanthoceras sorbifolia Bunge），別名文冠木、文官果、土木瓜、木瓜、溫旦革子，為無(wú)患子科（Sapindaceae）文冠果屬植物文冠果的木材或枝葉，是自然界富含神經(jīng)酸的植物資源[5]。文冠果油占種子仁的55%～65%，其中含有大約95%的甘油三酯，具有預(yù)防和治療高血壓、血管硬化等心血管病的作用。張東等[6]檢測(cè)到文冠果油芥酸含量為 8.41%，動(dòng)物試驗(yàn)表明大量攝入含芥酸的油脂，心臟會(huì)是主要的中毒器官，可致心肌纖維化引起心肌病變，引起動(dòng)物增重遲緩，發(fā)育不良?？赡軙?huì)對(duì)通過(guò)文冠果油攝取神經(jīng)酸的心臟病消費(fèi)者不利，同時(shí)限制了文冠果油的應(yīng)用。盡管還未有確切報(bào)道表明其對(duì)人體的有害作用，但為保障人群健康，更應(yīng)該加以重視文冠果油的質(zhì)量，并采取行動(dòng)[7]。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織及世界衛(wèi)生組織已規(guī)定油脂中的芥酸含量應(yīng)低于5%。

目前人們主要通過(guò)基因育種培育低芥酸植物，達(dá)到降低芥酸的目的，這種方法耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，操作要求高，不利于工業(yè)化生產(chǎn)，市場(chǎng)上還沒(méi)有出現(xiàn)低芥酸文冠果植物。相關(guān)文獻(xiàn)研究表明，海甘藍(lán)和高芥酸甘藍(lán)型油菜油中的長(zhǎng)碳鏈的芥酸主要位于甘油三酯的 Sn-1、Sn-3位，而 Sn-2位芥酸含量較低[8]。本實(shí)驗(yàn)選用了Sn-1,3位置專一性脂肪酶 TLIM[9]與文冠果油進(jìn)行反應(yīng)，脂肪酶TLIM 可把甘油骨架的 Sn-1,3位脂肪酸水解為游離脂肪酸。酶催化法具有催化效率高、反應(yīng)條件溫和、副反應(yīng)較少、產(chǎn)品質(zhì)量好和收率高等優(yōu)點(diǎn)，文冠果油的酶解脫除芥酸工藝的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

本文以文冠果油為原料，以芥酸含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用脂肪酶TLIM對(duì)酶解工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，為降低文冠果油中的芥酸含量提高一些參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

文冠果油實(shí)驗(yàn)室自行榨取。

甲醇鈉溶液（0.1 mol/L）、乙酸溶液（10%體積分?jǐn)?shù)）、硫酸甲醇溶液（0.1 mol/L）、正己烷、石油醚、無(wú)水乙醇、氫氧化鉀、酚酞：市售分析純；固定化脂肪酶Lipozyme TLIM：北京高瑞森科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A氣相色譜儀：美國(guó)Agilent公司；800-1離心機(jī)：惠智儀誠(chéng)（北京）科技發(fā)展有限公司；85-2B數(shù)顯恒溫磁力攪拌器：蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

精確稱量文冠果油，加入不同量的固定化脂肪酶TLIM和水，混勻，移入廣口瓶中。不同溫度條件下，反應(yīng)一段時(shí)間，取出油樣，使用離心機(jī)離心，取上層清液將甲酯化，利用氣相色譜檢測(cè)文冠果甘油酯的芥酸含量。

1.3.1 酸價(jià)的測(cè)定

水解前后的樣品其酸價(jià)用冷溶劑法測(cè)定。精確稱取約文冠果油5 g，溶解在50 mL石油醚和95%乙醇（體積比為1∶1）的混合溶液中，滴加0.15 mL的酚酞指示劑（10 g/L，10 g酚酞溶解在1 L95%的乙醇溶液中），用0.1 mol/L（實(shí)際濃度為0.098 mol/L）的氫氧化鉀乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液準(zhǔn)確中和滴定。三份試樣平行滴定，一份空白對(duì)照，取滴定所用氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)液的平均值，結(jié)果按以下公式計(jì)算。

式中：m—稱取油樣的質(zhì)量，mg；V—滴定所用氫氧化鉀溶液的體積，mL；C—?dú)溲趸浫芤旱膶?shí)際物質(zhì)的量濃度，mol/L；56.1—?dú)溲趸浀哪栙|(zhì)量。

1.3.2 不同甲酯化方法對(duì)比

取5 μL文冠果油或最佳條件酶解后產(chǎn)物放置于2支試管中，分別加入5滴硫酸甲醇溶液，制備成高酸價(jià)油脂甲酯化樣品（酸價(jià)大于3.0）；加入甲醇鈉溶液（0.1 mol/L）制備成低酸價(jià)甲酯化樣品（酸價(jià)小于3.0）。搖勻，室溫反應(yīng)30 min，加入 5滴乙酸溶液（10%體積分?jǐn)?shù)），搖勻終止反應(yīng)，加入5～10滴正己烷，搖勻，靜置15 min。

1.3.3 TLIM酶添加量對(duì)芥酸含量的影響

取10 g文冠果油，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1%、3%、5%、7%、9%TLIM 酶，根據(jù)水油摩爾比為40∶1加入水，在50 ℃下，反應(yīng)0.5 h。

1.3.4 溫度對(duì)芥酸含量的影響

取10 g文冠果油，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)7% TLIM酶，根據(jù)水油摩爾比為40∶1加入水，分別在40、45、50、55、60 ℃下，反應(yīng)0.5 h。

1.3.5 反應(yīng)時(shí)間芥酸含量的影響

取10 g文冠果油，根據(jù)水油摩爾比為40∶1加入水，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)7%TLIM酶，在45 ℃下分別反應(yīng)2、3、4、5、6 h。

1.3.6 水油摩爾比對(duì)芥酸含量的影響

取10 g文冠果油，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)7%TLIM酶，水油摩爾比分別控制為10∶1、20∶1、30 ∶1、40∶1、50∶1，在45 ℃下，反應(yīng)5 h。

1.3.7 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù) TLIM脂肪酶酶解條件的單因素測(cè)定結(jié)果，對(duì)酶添加量（A）、反應(yīng)溫度（B）、反應(yīng)時(shí)間（C）、水油摩爾比（D）4個(gè)因素分別展開(kāi)3個(gè)水平，進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，具體因素及水平見(jiàn)表 1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment

1.3.8 氣相色譜測(cè)定芥酸含量的色譜條件

色譜柱：30.0 m×320 μm 毛細(xì)管，膜厚0.25 μm，流速 1 mL/min。柱箱：初始溫度為180 ℃，平衡 1 min，以 20 ℃/min的速率保持4 min、運(yùn)行 4 min，以 10 ℃/min的速率保持8 min、運(yùn)行 15 min；檢測(cè)器：加熱器 250 ℃。采用面積歸一化法定量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)采用Origin2018進(jìn)行處理，正交設(shè)計(jì)助手專業(yè)版V3.1破解綠色版對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水解前后酸價(jià)的比較

根據(jù)圖 1文冠果油的酸價(jià)從 1.12 mgKOH/g升高到126.06 mgKOH/g。

圖1 文冠果油水解反應(yīng)酸價(jià)的變化Fig.1 Changes of acid value in the hydrolysis reaction of Xanthoceras sorbifolia Bunge oil

2.2 不同甲酯化方法對(duì)比

混合物中的甘油三酯、甘油二酯、單甘酯都是沸點(diǎn)較高的油脂類物質(zhì)，不容易氣化，要分析脂肪酸組成和含量，需要預(yù)先進(jìn)行衍生化，衍生化后的產(chǎn)物沸點(diǎn)變低，容易氣化[10]。本實(shí)驗(yàn)采用酸法和堿法兩種不同的甲酯化方法，對(duì)文冠果油進(jìn)行衍生化。

根據(jù)張浩對(duì)兩種甲酯化方法進(jìn)行對(duì)比的結(jié)果，堿法更適合甘油三酯的衍生化（酸價(jià)大于3.0），而酸法為游離脂肪酸的衍生化的最佳方法[11]。從圖2可以看出脂肪酶水解文冠果油后甘油三酯中的芥酸含量降低，游離脂肪酸中的芥酸含量升高，文冠果油的酸價(jià)從 1.12 mgKOH/g升高到126.06 mgKOH/g，說(shuō)明以甘油三酯為主的文冠果油轉(zhuǎn)變?yōu)橐杂坞x酸形式為主，脂肪酸存在形式發(fā)生轉(zhuǎn)變，同時(shí)檢測(cè)到游離酸中芥酸含量由水解前12.31%增加到水解后的17.51%，可以初步斷定芥酸從甘油三酯上水解下來(lái)，變?yōu)橛坞x芥酸。由于產(chǎn)品的最終形式為甘油三酯成分為主，所以本實(shí)驗(yàn)均采用堿法甲酯化，進(jìn)行衍生化。

圖2 兩種甲酯化方法比較Fig.2 Comparison of two methyl esterification methods

2.3 不同TLIM酶添加量對(duì)芥酸含量的影響

在水解的過(guò)程中起著催化作用的 TLIM酶具有位置專一性，能特異性水解甘油三酯Sn-1,3位上的脂肪酸，本實(shí)驗(yàn)研究了不同TLIM酶添加量對(duì)酶解文冠果油芥酸含量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 TLIM酶添加量對(duì)芥酸含量的影響Fig.3 Effect of TLIM enzyme addition on erucic acid content

圖3顯示，芥酸含量隨著加酶量的增加先緩慢降低，在TLIM酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%時(shí)達(dá)到最低后穩(wěn)定。分析原因可能是酶主要催化劑的作用，酶添加量較低時(shí)，脂肪酶水解程度不夠，當(dāng) TLIM酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%時(shí)，酶與文冠果油的接觸已經(jīng)達(dá)到飽和狀態(tài)，催化反應(yīng)趨于穩(wěn)定。因此，最佳TLIM酶添加量是質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%。

2.4 不同酶解溫度對(duì)芥酸含量的影響

在酶催化的過(guò)程中，溫度的變化不僅對(duì)酶的活性有很大的影響，還會(huì)致使反應(yīng)的熱力學(xué)、動(dòng)力學(xué)過(guò)程產(chǎn)生有很大的變化。實(shí)驗(yàn)研究了不同溫度對(duì)酶解文冠果油芥酸含量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 酶解溫度對(duì)芥酸含量的影響Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on erucic acid content

圖4顯示，芥酸含量呈現(xiàn)先下降后增加的趨勢(shì)。酶解溫度低于 45 ℃時(shí)，隨著酶解溫度的增加，芥酸含量不斷下降，45 ℃時(shí)芥酸含量達(dá)到最小，當(dāng)溫度超過(guò) 45 ℃芥酸含量逐漸上升。原因可能是 Sn-2位羥基與酶形成過(guò)度中間態(tài)所需的活化能要遠(yuǎn)高于Sn-1(3)位羥基，先增加是由于溫度升高加快了反應(yīng)速率，后減少便是因?yàn)槊傅倪x擇性降低，反應(yīng)速率會(huì)逐漸降低，芥酸含量逐漸升高。綜上考慮，最佳酶解溫度為45 ℃。

2.5 不同酶解時(shí)間對(duì)芥酸含量的影響

在催化反應(yīng)的過(guò)程中，反應(yīng)時(shí)間與芥酸含量密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)考察了不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶解文冠果油芥酸含量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 酶解時(shí)間對(duì)芥酸含量的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis time on erucic acid content

圖5顯示，隨著酶解時(shí)間的增大芥酸含量逐漸升高，5 h時(shí)達(dá)到最小值，隨后逐漸升高。分析原因可能是脂肪酶的水解反應(yīng)和酯化反應(yīng)為可逆反應(yīng)[12]，隨著酶解時(shí)間的增加，被水解下來(lái)的游離芥酸逐漸升高，與甘油、甘油一酯、甘油二酯發(fā)生酯化反應(yīng)導(dǎo)致文冠果油甘油三酯上結(jié)合的芥酸含量略上升，反應(yīng)平衡被打破，建立起新的平衡。因此，酶解反應(yīng)時(shí)間5 h為最佳。

2.6 不同水油摩爾比對(duì)芥酸含量的影響

本實(shí)驗(yàn)考察了不同水油摩爾比對(duì)酶解文冠果油芥酸含量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 水油摩爾比對(duì)芥酸含量的影響Fig.6 Effects of molar ratio of water to oil on erucic acid content

由圖6可知，隨著水油摩爾比的增加芥酸含量逐漸降低后又升高至平穩(wěn)，分析原因可能是脂肪酶的活性中心部位被一個(gè)α螺旋的“蓋子”結(jié)構(gòu)所覆蓋，當(dāng)脂肪酶作用于油水反應(yīng)界面時(shí)，脂肪酶分子的構(gòu)像發(fā)生變化[13]。α螺旋的“蓋子”打開(kāi)，催化中心與底物接觸，發(fā)生催化反應(yīng)。當(dāng)水油摩爾比較低時(shí)，文冠果油與TLIM脂肪酶的接觸少，大多數(shù)脂肪酶的活性中心沒(méi)暴露出來(lái)導(dǎo)致反應(yīng)速率低；隨著水油摩爾比的增加，TLIM脂肪酶與文冠果油可以充分接觸，脂肪酶活性中心充分暴露，水解速率就會(huì)加快，酶解程度升高，但位置選擇性會(huì)變差。綜上考慮，最佳水油摩爾比為30∶1。

2.7 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)酶添加量（A）、反應(yīng)溫度（B）、反應(yīng)時(shí)間（C）、水油摩爾比（D）4個(gè)因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表 2可知，RA＞RB＞RD＞RC可得出酶添加量是影響酶水解法降低芥酸含量的最主因素，各因素對(duì)酶水解法降低芥酸含量的影響從強(qiáng)到弱依次是：酶添加量＞反應(yīng)溫度＞水油摩爾比＞反應(yīng)時(shí)間。以芥酸含量為考察指標(biāo)，綜合分析四個(gè)因素及三組水平得到最優(yōu)條件應(yīng)為A1B2C2D3：酶添加量為（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）5%、反應(yīng)溫度45 ℃、反應(yīng)時(shí)間5 h、水油摩爾比為30∶1，得到芥酸含量最低4.86%。

表2 正交實(shí)驗(yàn)直觀表L9(34)Table 2 Intuitive Table of orthogonal experiment L9(34)

2.8 文冠果油酶解后脂肪酸組成

由表 3可知，文冠果油的主要脂肪酸為棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、二十碳烯酸、芥酸、神經(jīng)酸。圖7為文冠果油酶解前后氣相色譜對(duì)比圖，A為文冠果油色譜圖，B為最優(yōu)條件下酶解產(chǎn)物色譜圖。在固定化脂肪酶TLIM的催化水解下甘油三酯上芥酸含量從酶解前的 8.04%降低酶解后到了 4.86%，且神經(jīng)酸含量保持著 1%左右（酶解后為0.98%）。確定甘油三酯1,3位上的芥酸水解為游離芥酸，導(dǎo)致酸價(jià)升高，脫除游離酸后可得到低芥酸文冠果油，具體脫酸工藝實(shí)驗(yàn)室正在研究中。

圖7 文冠果油及其水解產(chǎn)物的氣相色譜圖Fig.7 Gas chromatogram of Xanthoceras sorbifolia Bunge oil and its hydrolysates

表3 酶解前后文冠果油組成成分Table 3 Components of Xanthoceras sorbifolia Bunge oil before and after enzymatic hydrolysis %

3 結(jié)論

利用脂肪酶對(duì)文冠果油中芥酸進(jìn)行水解，在酶添加量為（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）5%、反應(yīng)溫度45 ℃、反應(yīng)時(shí)間5 h、水油摩爾比為30∶1的優(yōu)化工藝條件下，文冠果油甘油三酯上芥酸含量從酶解前的8.04%降低酶解后到了4.86%，芥酸含量降低了約一半，達(dá)到了聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織及世界衛(wèi)生組織的規(guī)定，同時(shí)神經(jīng)酸的含量保持在1%左右，后期通過(guò)脫除游離酸可得到合格的低芥酸文冠果油。實(shí)驗(yàn)初步證明了芥酸分布在文冠果油的Sn-1, 3位，固定化脂肪酶 TLIM 能定向水解文冠果油的芥酸，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也為低芥酸文冠果油的開(kāi)發(fā)和工藝路線制定提供了可靠的支持。