中華蜜蜂OBP19的克隆與時(shí)空表達(dá)分析

馬秀梅，杜亞麗，劉晉佳，姚慧敏，張宇昊，馬衛(wèi)華，姜玉鎖*

(1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801；2. 山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，太原 030031)

蜜蜂作為自然界主要的授粉者，是人類不可或缺的優(yōu)良生物資源(陳瑜和馬春森, 2010)，它作為一種重要的社會(huì)性昆蟲，主要依賴其靈敏的嗅覺系統(tǒng)來識(shí)別并區(qū)分外界環(huán)境中的各種化學(xué)信號(hào)(杜亞麗等, 2019)。通過嗅覺感知外界環(huán)境中的花香物質(zhì)、信息素和其它氣味揮發(fā)物等各種氣味物質(zhì)來搜尋食物來源、躲避敵害、產(chǎn)卵和交配等一系列生命活動(dòng)(Fanetal., 2011)。氣味分子與受體蛋白特異性結(jié)合，并將氣味復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)到相應(yīng)受體使昆蟲的嗅覺受體精確識(shí)別并區(qū)分不同氣味復(fù)合物完成整個(gè)嗅覺過程均離不開氣味結(jié)合蛋白家族的參與(陳藝杰等, 2020)。

OBPs是一類低分子量可溶性蛋白(Pelosi, 1994)，一般由130～150個(gè)氨基酸組成，呈酸性，承擔(dān)外界環(huán)境與氣味受體(olfactory receptors, ORs)之間互相連接的任務(wù)(Zhou, 2010; Liuetal., 2018)。當(dāng)昆蟲觸角表面的感器微孔中有氣味分子滲入，這些氣味分子就會(huì)被OBPs結(jié)合，形成氣味結(jié)合蛋白-氣味分子復(fù)合體，然后這些復(fù)合體會(huì)通過感器淋巴液，激活感器樹突膜上的ORs，引起嗅覺神經(jīng)元的興奮(Britoetal., 2016)。OBPs還可以通過結(jié)合疏水性化學(xué)信息素作為載體，將其傳遞給嗅覺受體或感覺神經(jīng)元膜蛋白發(fā)揮作用(Marchetal., 2014; Gongetal., 2015)。

蜜蜂OBPs的種類可分為觸角特異性結(jié)合蛋白、普通氣味結(jié)合蛋白和信息素結(jié)合蛋白(張升祥等, 2010)。也有根據(jù)保守半胱氨酸Cys的模式將OBPs分為Classical OBPs、Minus-C OBPs、Plus-C OBPs、Dimer OBPs和Atypical OBPs。通過半胱氨酸位點(diǎn)的數(shù)量大致把OBPs氨基酸序列中含有6個(gè)保守Cys位點(diǎn)，有3個(gè)二硫鍵的歸為Classical OBPs。把含有4或5個(gè)保守Cys位點(diǎn)，僅含有2個(gè)二硫鍵的歸為Minus-C OBPs。含有至少2～3個(gè)額外的Cys，并且在第6個(gè)Cys之后有存在1個(gè)保守的脯氨酸位點(diǎn)的歸為Plus-C OBPs(Liuetal., 2017)。將具有由2個(gè)典型的Cys基序聚合在一起特征的歸為Dimer OBPs(Campaninietal., 2016; Yangetal., 2019)。OBPs有較為典型的N端區(qū)域，而C端區(qū)域較長且特征不明顯的歸為Atypical OBPs(Malinietal., 2013; 杜亞麗等, 2020)。大量研究表明，OBPs的主要功能包括： 選擇性結(jié)合氣味分子及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)； 協(xié)助氣味分子的運(yùn)送；降解和清除氣味分子及有毒物質(zhì)；以及使受到氣味分子刺激后的受體迅速失活，避免嗅覺神經(jīng)元因持續(xù)的刺激而過度興奮(Yangetal., 2018; 杜亞麗等,2019)。

研究表明OBPs除了在昆蟲的氣味感知和傳遞中起著重要作用，很可能還發(fā)揮其他生理功能(Guoetal., 2020)。研究發(fā)現(xiàn)OBPs不僅在觸角等嗅覺器官中表達(dá)，還在口器、足和翅等味覺器官中表達(dá)，這說明OBPs在行使嗅覺功能的同時(shí)也可能參與對呈味物質(zhì)的識(shí)別過程(谷少華, 2013; 楊葉青等, 2017)，如中華蜜蜂足中特異性高表達(dá)的AcerOBP15在采集花蜜和花粉時(shí)參與味覺識(shí)別過程(Duetal., 2021)。也有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)OBPs在中腸和腺體等其它非嗅覺器官中廣泛表達(dá)，推測它們不僅只參與嗅覺感知功能，還有可能參與其他生理功能(Picimbonetal., 2001; Gongetal., 2007; Danietal., 2011; Liuetal., 2014)。

中華蜜蜂(Apisceranaceran,簡稱中蜂)作為我國的獨(dú)有蜂種，廣泛活動(dòng)在我國山林地區(qū)，因其嗅覺靈敏、抗病抗逆能力強(qiáng)、采集性優(yōu)良及善于利用零星分散蜜粉源等優(yōu)點(diǎn)，在這些地區(qū)發(fā)揮著不可替代的作用(蘇松坤等, 2005; 王鳳鶴等, 2007; Zhaoetal., 2014; 陳藝杰等, 2020)。目前有關(guān)中華蜜蜂OBPs的研究相對匱乏，鑒于OBPs在中蜂生理功能上具有重要意義，本研究通過克隆獲得中蜂的AcerOBP19的ORF序列，對該蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析并預(yù)測其蛋白結(jié)構(gòu)，明確在不同發(fā)育階段該基因在觸角、足、口器、毒腺和中腸的表達(dá)水平，以期為蜜蜂的嗅覺識(shí)別機(jī)制的研究及氣味結(jié)合蛋白在味覺功能上的深入探究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)樣本

試驗(yàn)用樣本由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)蜂場提供，所有樣品采集時(shí)間為2020年6-7月。

樣本的采集：從健康無疾病、無自然分蜂傾向、群勢強(qiáng)的中蜂巢中取出兩張整齊的封蓋子脾放于人工培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)(培養(yǎng)溫度35±0.2℃，相對濕度50%～70%)，當(dāng)蜜蜂出房后在其背部用無味無毒的油漆進(jìn)行標(biāo)記，待油漆干后放回原蜂巢，采樣時(shí)期為成蜂1、5、10、15、20、25日齡，組織為觸角、足、口器、中腸和毒腺。100頭工蜂的組織混合樣作為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)。克隆樣本的采集：隨機(jī)抓取一日齡工蜂3頭。當(dāng)樣品采集后放入研缽中研磨，隨后將粉末倒入裝有1 mL TRIzol的離心管中，震蕩混勻后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2主要試劑

TRIzol RNA分離試劑購自賽默飛世爾科技有限公司(中國)；熒光定量試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTM II (Tli RNaseH Plus)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser (perfect real time)、Trans5α和克隆載體pMDTM19-T等購自TaKaRa寶生物工程有限公司(大連)；2×M5 HiPer plus HiFi PCR mix (with bye dye)購自聚合美生物科技有限公司(北京)；D2000 DNA Ladder、50×TAE Buffer、固相RNase清除劑、DNase/RNase-free water、異丙醇、氯仿和購自索萊寶科技有限公司(北京)；DNA Gel/PCR Purification Miniprep Kit凝膠回收試劑盒購自杭州倍沃醫(yī)學(xué)科技有限公司。

1.1.3供試儀器

HWS0358人工智能氣候培養(yǎng)箱(江南儀器廠，中國寧波)，DYCP-31DN瓊脂糖水平電泳儀(六一，中國北京)，F(xiàn)orma 700超低溫冰箱(Thermo，美國)，SIM-F124制冰機(jī)(Sanyo，日本)，5430R臺(tái)式高速離心機(jī)(Eppendorf，德國)，ND-1000核酸蛋白儀(NanoDrop，美國)，熒光定量PCR儀(Bio-Rad，美國)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1總RNA的提取和cDNA的合成

根據(jù)TRIzol試劑說明書提取1.1.1中收集的不同發(fā)育時(shí)期成蜂各組織的總RNA，用核酸濃度測定儀測定濃度。用1 μg總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將合成的cDNA測定濃度后置于-20℃保存。

1.2.2引物設(shè)計(jì)

通過課題組前期所獲得的序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增目的基因cDNA序列的引物。用克隆獲得的序列和內(nèi)參基因Arp1(GenBank登錄號(hào)：NM_ 001185145.1)的ORF序列，設(shè)計(jì)用于qRT-PCR的特異性引物。引物由生工生物工程股份有限公司(上海)合成，引物信息見表1。

1.2.3OBP19基因的克隆

以1.2.1保存的中蜂cDNA為模板對AcerOBP19基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系(10 μL)如下：2×M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix(with blue dye) 5 μL，上游引物(10 μM)、下游引物(10 μM)，各0.3 μL，cDNA模板1.0 μL(<1 μg)，RNase Free dH2O 3.4 μL。最優(yōu)反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性4 min；35個(gè)循環(huán)：95℃變性 26 s，58℃退火26 s，72℃延伸16 s；72℃終延伸5 min；4℃ ∞。以Marker DL 2000作為參照，將PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外凝膠成像系統(tǒng)中檢測目的條帶。檢測后將擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化，連接至pMDTM19-T載體，將載體轉(zhuǎn)化到Trans5α感受態(tài)細(xì)胞，通過藍(lán)白斑篩選，挑出單一飽滿的白色菌落放入LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。菌液PCR鑒定后，把陽性克隆產(chǎn)物送華大基因科技有限公司(北京)進(jìn)行測序。

表1 試驗(yàn)所用引物

1.2.4OBP19基因的序列分析

利用在線軟件ORF Finder(http://www. ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)查找序列的開放閱讀框，用EditSeq預(yù)測其編碼的氨基酸序列。氨基酸序列的同源性通過NCBI中的Protein BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)工具進(jìn)行分析；從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載與其同源性較高的昆蟲OBPs序列，使用MEGA-X軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，選擇鄰接法Neighbor-Joining(Bootrap為1 000次)。蛋白生物信息學(xué)分析參考杜亞麗等(2016)。

1.2.5熒光定量PCR檢測

以各日齡的組織cDNA(濃度稀釋到200 ng/μL)為模板，使用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR，每個(gè)樣品進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。反應(yīng)體系為10 μL：SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ 5 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3.2 μL；反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s，接著進(jìn)行45個(gè)循環(huán)：95℃ 30 s，60℃ 34 s。測定溶解曲線的反應(yīng)條件為：以0.5℃的溫度從60℃到95℃。

1.2.6數(shù)據(jù)處理與分析

以15日齡中蜂觸角的表達(dá)量為基準(zhǔn)，根據(jù)熒光曲線的Ct值，用2-△ △ Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，顯著性差異用SPSS 22.0軟件中的單因素方差分析(ANOVA)。結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示，通過GraphPad Prism 9.0軟件進(jìn)行圖形分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因的克隆與測序

根據(jù)設(shè)計(jì)的特異性引物，以中蜂cDNA為模板對AcerOBP19基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳圖顯示擴(kuò)增的目的片段和預(yù)測的長度(420 bp)一致(圖1)。

圖1 AcerOBP19基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis of the PCR products of AcerOBP19 gene注：M，DNA分子量Marker；1，PCR產(chǎn)物。Note: M, DNA Marker; 1, PCR product.

2.2 基因的序列分析

在NCBI中將測序所得序列進(jìn)行Blastn比對，結(jié)果顯示與西方蜜蜂AmelOBP19(GenBank登錄號(hào)：NM_ 001040209)的核苷酸序列相似性為83.58%。AcerOBP19基因的ORF序列長為 420 bp，編碼139個(gè)氨基酸，其序列(圖2)中含有4個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn)，屬于Mins-C亞家族。

圖2 AcerOBP19 cDNA核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of AcerOBP19 cDNA注：大寫字母為開放閱讀框ORF；起始密碼子和終止密碼子用斜體標(biāo)識(shí)，信號(hào)肽序列用下劃線標(biāo)注，保守半胱氨酸位點(diǎn)用黑色方框標(biāo)注。Note: ORF was described by uppercase letters; Initiation codon was indicated by italic, sequence of signal peptide was underlined, conserved cysteine sites were labeled by black box.

2.3 生物信息學(xué)分析

2.3.1蛋白的基本理化性質(zhì)

使用在線軟件ProtParam預(yù)測AcerOBP19理化性質(zhì)(表2)。該蛋白分子量為16.11 kDa，為小分子蛋白；理論等電點(diǎn)pI為4.47，為酸性蛋白；不穩(wěn)定系數(shù)為23.02(<40)，較穩(wěn)定；總平均系數(shù)為-0.375，為親水性蛋白；脂溶系數(shù)為82.66(<90)，為水溶性蛋白。

表2 AcerOBP19蛋白的理化性質(zhì)

2.3.2信號(hào)肽預(yù)測

信號(hào)肽位于分泌蛋白的N端，一般將其作為判斷蛋白質(zhì)是否為分泌蛋白的一個(gè)主要依據(jù)。將本試驗(yàn)所得到的AcerOBP19的氨基酸序列用SignalP-4.1進(jìn)行信號(hào)肽的預(yù)測，結(jié)果表明(圖3)該蛋白的第1～16位氨基酸為其信號(hào)肽序列，其剪切位點(diǎn)在第16和第17位氨基酸之間，故推測AcerOBP19為分泌蛋白。

圖3 AcerOBP19信號(hào)肽的預(yù)測Fig.3 Predicted results for singal peptide in AcerOBP19

2.3.3跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

在TMHMM-2.0軟件上對AcerOBP19進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測，預(yù)測的期望跨膜螺旋數(shù)為0，表明該蛋白不是跨膜蛋白(圖4)。

圖4 AcerOBP19跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Prediction of transmembrane structure of AcerOBP19

2.3.4保守結(jié)構(gòu)區(qū)域與功能結(jié)構(gòu)域的分析

使用NCBI Conserved Domains對AcerOBP19的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，它具有PBP-GOBP superfamily家族的保守結(jié)構(gòu)域，其保守結(jié)構(gòu)區(qū)域位于第17～130位氨基酸之間，E-value為2.73e-08。AcerOBP19存在一個(gè)PhBP功能結(jié)構(gòu)域，位于第132～139位氨基酸之間，E-value為0.00598(圖5)。

圖5 AcerOBP19保守結(jié)構(gòu)域Fig. 5 Functional structure domain of AcerOBP19

2.3.5疏水性分析

AcerOBP19氨基酸序列的疏水性通過Hphob./Kyte & Doolittle方法進(jìn)行分析(圖6)，該序列中，最高Score值在第8位氨基酸為3.533，第79位最低為-2.456，總平均親水性為-0.375。這說明AcerOBP19為親水性蛋白。

2.3.6亞細(xì)胞定位分析

AcerOBP19蛋白亞細(xì)胞定位在PSORTⅡ分析，結(jié)果表明(表3)該蛋白主要出現(xiàn)在分泌途徑上，結(jié)合LOCTREE 2.0分析的結(jié)果，該蛋白主要分布在胞外區(qū)(GO：0005576)，說明該蛋白屬于分泌型蛋白。

圖6 AcerOBP19的氨基酸序列疏水性分析Fig.6 Predicted hydrophobicity profiles for amino acid sequences of AcerOBP19

表3 AcerOBP19的亞細(xì)胞定位分析

2.3.7高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

以西方蜜蜂氣味結(jié)合蛋白ApismelliferaOBP14(PDB登錄號(hào)：3s0g.1.A)為模板對AcerOBP19進(jìn)行3D結(jié)構(gòu)的預(yù)測(圖7)，結(jié)果表明該蛋白與AmelOBP14的結(jié)構(gòu)相似度達(dá)49.58%，含有6個(gè)α螺旋和2對二硫鍵，二硫鍵分別是Cys33-Cys66和Cys105-Cys126。

2.3.8系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫中將獲得的氨基酸序列進(jìn)行Blastp分析，選取與AcerOBP19同源性高的昆蟲OBPs氨基酸序列在MEGA-X軟件上構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖8)，采用鄰位法Neighborjoining進(jìn)行1 000次重復(fù)。從圖中可以看出，AcerOBP19與大蜜蜂ApisdorsataOBPs、小蜜蜂ApisfloreaOBPs和西方蜜蜂ApismeliferaOBPs的氨基酸序列一致性較高，表明它們之間在進(jìn)化關(guān)系上更加同源。

圖7 AcerOBP19的3D結(jié)構(gòu)預(yù)測模型Fig.7 Three-dimensional prediction structure of AcerOBP19

圖8 基于昆蟲OBPs與AcerOBP19的氨基酸序列構(gòu)建的的系統(tǒng)進(jìn)化樹(鄰接法)Fig.8 Phylogenetic tree of the amino acid sequences of insect OBPs and AcerOBP19 based on aminoacid sequence with Neighbor-joining method

2.4 AcerOBP19基因mRNA水平表達(dá)分析

以15日齡工蜂觸角的AcerOBP19基因表達(dá)量為基準(zhǔn)，通過qRT-PCR技術(shù)分析AcerOBP19在中蜂不同時(shí)期各組織中mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)。AcerOBP19在中蜂不同發(fā)育時(shí)期的觸角、口器、足、毒腺中均有不同程度的表達(dá)，在中腸中呈微量表達(dá)(圖9)。

AcerOBP19在1、5、10、20和25日齡中華蜜蜂足中的表達(dá)量極顯著高于其它組織(P<0.01)，15日齡中華蜜蜂觸角中的表達(dá)量極顯著高于其它組織(P<0.01)。在不同的發(fā)育階段，在足中1日齡時(shí)相對表達(dá)量最高，5日齡時(shí)呈下降趨勢，10日齡時(shí)又呈上升趨勢，15日齡時(shí)又下降為最低相對表達(dá)量，整體呈先減后增“波浪”式趨勢；在口器中1、5和10日齡的相對表達(dá)量呈緩慢下降趨勢，15日齡時(shí)驟增，20日齡和25日齡時(shí)又呈下降趨勢，整體呈先降，中間增，后又趨于下降模式；在觸角中1至5日齡時(shí)的相對表達(dá)量呈下降趨勢，5至15日齡時(shí)呈上升趨勢，20日齡時(shí)呈下降趨勢，25日齡時(shí)又緩慢上升；在毒腺中相對表達(dá)量整體呈先降后升的“波浪”式趨勢，10日齡時(shí)相對表達(dá)量最高，25日齡時(shí)最低。

圖9 AcerOBP19在中蜂不同發(fā)育時(shí)期各組織中的相對表達(dá)量Fig.9 Expression of AcerOBP19 in different developmental stages and tissues of Apis cerana cerana注：An，觸角；P，毒腺；Mo，口器；L，足；Mi，中腸；1 d～25 d：成年工蜂的日齡。不同大寫字母表示成蜂相同時(shí)期不同組織之間的表達(dá)量差異極顯著(P<0.01)。Note: An, Antenna; P, Poison gland; Mo, Mouthparts; L, Legs; Mi, Midgut; 1 d～25 d: Days-old of adult worker bees. Different uppercase letters showed extremely significant differences in the expression in different tissues of the same stage (P<0.01).

3 結(jié)論與討論

蜜蜂嗅覺系統(tǒng)及其靈敏，不僅對蜜蜂的各種生物行為發(fā)揮作用，還對維持蜂群內(nèi)部穩(wěn)定起著重要作用(Carey and Carlson, 2011; Zhaoetal., 2015)。本試驗(yàn)克隆獲得了AcerOBP19的完整ORF序列，其長420 bp，編碼139個(gè)氨基酸，預(yù)測分子量介于13～17 kDa，含有4個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn)，屬于Mins-C亞家族，與之前研究一致(吳少英等, 2005)。信號(hào)肽是位于分泌蛋白的N端，且N端部位具有具有15～35個(gè)氨基酸的短肽鏈，一般將其作為判斷蛋白質(zhì)是否為分泌蛋白的一個(gè)主要依據(jù)(彭佳師等, 2011)。AcerOBP19蛋白的第1～16位氨基酸為其信號(hào)肽序列，其剪切位點(diǎn)在第16和17位氨基酸之間，亞細(xì)胞定位也主要在分泌途徑上，因此說明AcerOBP19蛋白為分泌型蛋白。進(jìn)化樹結(jié)果顯示AcerOBP19與大蜜蜂OBPs、小蜜蜂OBPs和西方蜜蜂OBPs的氨基酸序列一致性較高，表明它們之間在進(jìn)化關(guān)系上更加同源，且AcerOBP19具有PBP-GOBP superfamily家族的保守結(jié)構(gòu)域，說明AcerOBP19符合氣味結(jié)合蛋白家族的特征，可能在嗅覺系統(tǒng)中承擔(dān)著氣味的識(shí)別和轉(zhuǎn)運(yùn)的任務(wù)。

昆蟲OBPs廣泛存在于其各個(gè)組織中，這與它復(fù)雜的生物學(xué)功能密切聯(lián)系(Hulletal., 2014)。起初有研究表明昆蟲OBPs在觸角中特異性地表達(dá)，如家蠶Bombyxmori的Bmor OBPs、亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis的Ofur PBP3、小菜蛾P(guān)lutellaxylostella的Pxyl PBP1、水稻二化螟Chilosuppressalis的Csup OBP2(張治科等, 2017)。隨后，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，一些OBPs也在昆蟲的頭、胸、腹、足、翅、下顎須、喙、口器、性腺、精囊、氣門等其它組織部位中表達(dá)(Lietal., 2008; Vogeletal., 2010; Huaetal., 2012; 陳玲等, 2013; 魏丹等, 2013; Zhuetal., 2013; 吉挺等, 2014; 秦贈(zèng)等, 2014; 宋月芹等, 2014; 趙雪等, 2014)。組織表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，AcerOBP19在中蜂的觸角、足、口器、毒腺和中腸中都有表達(dá)，這與上述研究相符。昆蟲的足上分布著許多與味覺相關(guān)的感受器，而氣味結(jié)合蛋白在味覺器官中高表達(dá)，可能與昆蟲攝食和營養(yǎng)吸收等功能有關(guān)(Sanchez-Graciaetal., 2009)。在本次試驗(yàn)中除15日齡外，AcerOBP19在其它日齡時(shí)足中的相對表達(dá)量極顯著于其它組織，由此可以推測，AcerOBP19除了在中蜂嗅覺調(diào)控機(jī)制中發(fā)揮作用，也與感知蜜粉源植物的非揮發(fā)性物質(zhì)等味覺功能相關(guān)聯(lián)，如在采集花粉花蜜時(shí)參與味覺識(shí)別過程，與AcerOBP15一致(Duetal., 2021)。在15日齡時(shí)，AcerOBP19在觸角中的表達(dá)量極顯著高于其它組織，與杜亞麗等人研究結(jié)果相同(Duetal., 2019)。通過比較分析AcerOBP19在觸角、足和口器中的相對表達(dá)量可知，AcerOBP19在足中的表達(dá)量1日齡時(shí)達(dá)到峰值，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在觸角中的表達(dá)，這可能是由于作為新生蜂其嗅覺系統(tǒng)尚未完全發(fā)育成熟，推測AcerOBP19在味覺器官中的高表達(dá)可能與新生蜂在巢中哺育幼蟲釀制蜂蜜等味覺及其它功能相聯(lián)系。AcerOBP19在觸角中的表達(dá)量在15日齡時(shí)達(dá)到峰值，此時(shí)AcerOBP19在足與口器中的表達(dá)量都低于觸角，這可能是15日齡為中華蜜蜂從內(nèi)勤蜂向外勤蜂轉(zhuǎn)變的過渡階段而發(fā)生了改變，詳細(xì)原因還需進(jìn)一步論證。AcerOBP19在口器中的表達(dá)量在10日齡時(shí)達(dá)到峰值，眾所周知，蜜蜂的味覺器與味覺神經(jīng)相連，對糖漿等物質(zhì)的濃度有很高的識(shí)別能力，結(jié)合在足中的表達(dá)模式，對此現(xiàn)象可以做出推測，AcerOBP19基因在糖漿和花蜜濃度的識(shí)別過程中有可能發(fā)揮了一定的作用，可能參與了中蜂的采集過程。

雖然許多OBPs是化學(xué)感覺特異性的，但有些OBPs可能具有更一般的生理作用(Gongetal., 2009)。為了驗(yàn)證在此結(jié)果上的推測，本課題組將會(huì)繼續(xù)進(jìn)行表達(dá)純化其蛋白，通過熒光競爭結(jié)合等實(shí)驗(yàn)明確該氣味結(jié)合蛋白的結(jié)合譜，在蛋白水平上進(jìn)一步檢測該基因在嗅覺與味覺器官中的表達(dá)與定位情況等后續(xù)試驗(yàn)。