生物活性玻璃對(duì)人工牙本質(zhì)齲再礦化的影響

岳陽(yáng)麗，劉翠麗，賀貴天，馬貴霞

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院牙體牙髓科 鄭州 450052

齲病是最常見的口腔疾病。齲損形成是脫礦與再脫礦的持續(xù)性動(dòng)力學(xué)反應(yīng)，當(dāng)脫礦作用大于再礦化作用時(shí)就會(huì)出現(xiàn)礦物質(zhì)的持續(xù)丟失繼而產(chǎn)生齲損[1-2]。因此，促進(jìn)鈣、磷等礦物質(zhì)沉積于正?；蛎摰V牙體硬組織中的再礦化是抑制齲損發(fā)生的有效途徑。

生物活性玻璃(bioactive glass,BAG)是一種以SiO2-CaO-Na2O-P2O5為基礎(chǔ)的硅酸鹽類材料[3]。BAG在液體環(huán)境中能夠快速釋放Ca2+、PO43-，與液體中的H3O+進(jìn)行離子交換，迅速提高周圍溶液的pH值，而后在材料表面形成大量Si(OH)4，Si-OH基團(tuán)縮聚，經(jīng)過離子遷移過程，最終生成羥基磷灰石(hydroxyapatite,HAP)層。BioMinF和奧敏清均為45S5型BAG。已有學(xué)者[4]證實(shí)兩者可促進(jìn)脫礦牙釉質(zhì)再礦化，但在牙本質(zhì)再礦化方面的研究較少。本實(shí)驗(yàn)采用Micro-CT分析BioMinF和奧敏清對(duì)人工牙本質(zhì)齲再礦化的影響，探索BAG和氟化物的聯(lián)合使用對(duì)牙本質(zhì)齲再礦化的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器BioMinF粉末(英國(guó)Biomin技術(shù)有限公司)，奧敏清粉末(D90，北京大清生物有限公司)，氟化鈉、醋酸、氯化鈣、氯化鉀、磷酸二氫鉀、碳酸氫鈉(分析純，北京謹(jǐn)明生物科技有限公司)，4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES，美國(guó)Anresco公司)，氯銨T(分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)，去離子水(希之夢(mèng)商貿(mào)有限公司)，紅色指甲油(廣州愛琳公司)。

去離子水溶解適量氟化鈉配制成20 g/L的氟化鈉溶液；酸性脫礦液由2.2 mmol/L 氯化鈣、2.2 mmol/L磷酸二氫鉀和50 mmol/L醋酸組成；酸性緩沖液：1.5 mmol/L氯化鈣、0.9 mmol/L磷酸二氫鉀和50 mmol/L醋酸混合，加入碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH至4.5；中性緩沖液由20 mmol/L HEPES、1.5 mmol/L氯化鈣，0.9 mmol/L磷酸二氫鉀和150 mmol/L氯化鉀混合，加入碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH至7.0。

低速精密切割機(jī)(明茲精密儀器上海有限公司)，恒溫水浴箱(北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠)，Micro-CT系統(tǒng)(德國(guó)Bruker公司)。

1.2 樣本制備收集完整無(wú)齲壞的新鮮離體人第三磨牙40顆，儲(chǔ)存于4 ℃氯銨T溶液中。使用低速精密切割機(jī)在釉牙骨質(zhì)界上方1.0 mm處以垂直于牙體長(zhǎng)軸的方向切割，最后制成6 mm×3 mm×1 mm大小的牙本質(zhì)塊，并用SiC砂紙打磨拋光至4 000目，使其形成平整、光滑的平面，超聲蕩洗10 min。

將每個(gè)樣本的表面等分為3個(gè)3 mm×2 mm的小區(qū)域，分別命名為a、b和c區(qū)。a區(qū)為單純脫礦區(qū)，僅脫礦處理；b區(qū)是再礦化區(qū)，進(jìn)行脫礦和再礦化處理；c區(qū)是對(duì)照區(qū)，為正常牙本質(zhì)，不進(jìn)行脫礦和再礦化處理[5]。除a和b區(qū)外，其他地方均涂布抗酸指甲油，干透后涂布第2層(圖1A)。然后將上述樣本置于pH 4.5的酸性脫礦液中96 h，每24 h換液1次。脫礦完成后，去離子水沖洗，并用抗酸指甲油覆蓋樣本的a區(qū)，干透后涂布第2層，以保持其單純脫礦狀態(tài)(圖1B)。

A:脫礦前;B:脫礦后

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與處理將制備好的樣本隨機(jī)分為4組，BioMinF組(A組)、奧敏清(B組)、奧敏清+氟化鈉(C組)、氟化鈉(D組)，每組10個(gè)樣本。A、B組分別用含去離子水的濕潤(rùn)小毛刷蘸取BioMinF或奧敏清粉末均勻涂抹于樣本b區(qū)，靜置5 min,去離子水沖洗，再浸入去離子水中5 min；C組用含有去離子水的濕潤(rùn)小毛刷蘸取奧敏清粉末均勻涂抹于b區(qū)，靜置5 min，去離子水沖洗，再浸入20 g/L 氟化鈉溶液中5 min；D組浸入20 g/L氟化鈉溶液中5 min，去離子水沖洗，再浸入去離子水中5 min。各組經(jīng)上述處理后，去離子水沖洗，于37 ℃恒溫水浴箱中進(jìn)行pH循環(huán)：酸性緩沖液作用30 min，中性緩沖液作用10 min。以上為一次再礦化流程，而后進(jìn)入下一個(gè)再礦化流程。每d 6次，共8 d。

1.4 Micro-CT檢測(cè)pH循環(huán)結(jié)束后，去除指甲油、沖洗，將樣本置于Micro-CT中，在100 kV、80 kA、9 μm層厚條件下進(jìn)行掃描，三維重建。重建后使用Dataviewer軟件保存樣本冠狀面數(shù)據(jù)，使用CT Analyzer軟件進(jìn)行可視化分析。掃描2個(gè)羥基磷灰石塊體模(250 mg/cm3和750 mg/cm3)，用于礦物質(zhì)密度值校正。在每個(gè)樣本a、b、c區(qū)各隨機(jī)選擇2個(gè)302 μm×302 μm大小的二維感興趣區(qū)域(volume of interest,VOI)測(cè)定礦物質(zhì)密度(dentin mineral density,DMD)。繪制每個(gè)樣本3個(gè)區(qū)域VOI的DMD隨深度變化的曲線。

在每個(gè)樣本a、b區(qū)分別選擇2個(gè)302 μm× 302 μm×225 μm大小的三維VOI測(cè)定DMD。ΔDMD=DMDb-DMDa。

從每個(gè)樣本重建的3D圖像中，隨機(jī)截取5個(gè)矢狀面圖像，測(cè)量a和b區(qū)域的病損深度(lesion depth,LD)，取均值。ΔLD=LDa-LDb。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理釆用SPSS 21.0分析。4組ΔDMD和ΔLD差異的比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 4組DMD-深度曲線4組a、b、c 3個(gè)區(qū)域典型的DMD-深度的變化曲線見圖1。在同一病損深度，各組b區(qū)的DMD均高于a區(qū)。隨著病損深度的增加，DMD增幅減小，在牙本質(zhì)表層下0～150 μm范圍內(nèi)DMD值的增幅較大，而在表層下150～300 μm的深度內(nèi)DMD值的增幅較小。A、B、C 3組b區(qū)牙本質(zhì)病損表層的DMD接近于c區(qū)表層的DMD；D組b區(qū)牙本質(zhì)病損表層的DMD則小于c區(qū)。

A、B、C、D：分別為A、B、C、D組

2.2 4組ΔDMD比較見表1。4組ΔDMD比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，C組大于A組和B組，D組小于A組和B組。

表1 4組ΔDMD的比較 mg/cm3

2.3 4組ΔLD比較見表2。4組ΔLD比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，C組大于B組，B組大于A組，A組大于D組。

表2 4組ΔLD的比較 μm

3 討論

BioMinF是一種新型的含氟45S5型BAG，它與水、唾液或其他人液體環(huán)境接觸后，經(jīng)五個(gè)無(wú)機(jī)化學(xué)相反應(yīng)，最終生成氟磷灰石，堵塞牙本質(zhì)小管，緩解牙本質(zhì)敏感癥狀[6-8]，而且BioMinF能緩慢釋放F-、Ca2+和PO43-，有效地減少牙齒脫礦、促進(jìn)牙體硬組織再礦化[9]，有效抑制人工早期釉質(zhì)齲的發(fā)展。奧敏清是一種不含氟的45S5型BAG，它能在唾液環(huán)境下發(fā)生迅速、持續(xù)的反應(yīng)，釋放Ca2+、PO43-成分，最終生成HAP層，使牙本質(zhì)實(shí)現(xiàn)再礦化[3,10]。

DMD值是評(píng)價(jià)礦物含量變化的一個(gè)重要指標(biāo)。Micro-CT是高分辨率3D X射線成像技術(shù)，該圖像分析方法可檢測(cè)牙體硬組織不同部位的DMD變化[11]。本實(shí)驗(yàn)采用Micro-CT測(cè)定牙本質(zhì)塊不同區(qū)域內(nèi)的DMD并計(jì)算差值，分析牙本質(zhì)礦物含量的變化及牙本質(zhì)再礦化的程度。為了避免不同牙齒牙本質(zhì)塊質(zhì)地差異的影響，本實(shí)驗(yàn)采用在同一牙本質(zhì)塊上涂布指甲油進(jìn)行分區(qū)[12]。

本研究結(jié)果顯示，4組樣本再礦化處理后病損部位的DMD均升高；隨著病損深度的增加，DMD增幅減小，病損最深部的DMD幾乎沒有變化。這一結(jié)果表明BAG與氟化鈉的礦物質(zhì)沉積特點(diǎn)一致，即距離病損表層越遠(yuǎn)，離子越難到達(dá)，因此再礦化作用越弱。但在牙本質(zhì)病損表層，A、B、C 3組樣本再礦化b區(qū)的DMD接近于正常c區(qū)，D組樣本再礦化b區(qū)的DMD則小于正常c區(qū)，提示BioMinF和奧敏清在牙本質(zhì)表層的再礦化作用優(yōu)于氟化鈉。

再礦化后各組的ΔDMD均值分別為70.19、72.83、87.93、60.22 mg/cm3，提示4種再礦化處理方式均可在一定程度上促進(jìn)脫礦牙本質(zhì)再礦化。C組ΔDMD最大，提示奧敏清與氟化鈉聯(lián)合作用后礦物質(zhì)含量增加最多；A組和B組ΔDMD差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示BioMinF與奧敏清在增加礦物質(zhì)含量方面作用無(wú)差異。D組的ΔDMD最小，提示氟化鈉作用最弱。

ΔLD越大，提示再礦化效果越好。各組ΔLD均值分別為40.53、48.91、52.08、33.42 μm，這一變化趨勢(shì)與ΔDMD的變化一致，提示奧敏清與氟化鈉聯(lián)合作用導(dǎo)致的病損深度變化最大，而奧敏清在此方面的作用略優(yōu)于BioMinF，氟化鈉組作用最弱。

本實(shí)驗(yàn)中奧敏清和氟化鈉的聯(lián)合使用顯示出最好的再礦化效果，這與陳麗薇等[13]的研究結(jié)果相似，他們發(fā)現(xiàn)奧敏清和氟化物涂膜聯(lián)合使用堵塞牙本質(zhì)小管的效果最佳，且具有較好的抗酸性和抗洗刷性能。可能原因如下：①奧敏清所形成的礦物質(zhì)沉積物為氟化鈉溶液的附著提供了支架，增加了其與牙本質(zhì)表面的接觸面積。②奧敏清能在唾液環(huán)境下發(fā)生迅速、持續(xù)的反應(yīng)，釋放大量的Ca2+、PO43-，氟化鈉與Ca2+、PO43-發(fā)生反應(yīng)在牙本質(zhì)表面形成球狀CaF2層，進(jìn)而形成HAP和氟磷灰石晶體。BioMinF只含有少量的氟元素，可能不足以使其在牙本質(zhì)表面形成大量的氟磷灰石。本研究結(jié)果提示BioMinF和奧敏清均能促進(jìn)牙本質(zhì)再礦化，BioMinF中由于含氟量低微，并未顯示出其成分優(yōu)勢(shì)。另外兩者作用的差異也可能與兩種物質(zhì)的硅酸鹽網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)、鈣磷含量的成分、制作工藝等不同有關(guān)。

綜上所述，BioMinF、奧敏清都能夠促使牙本質(zhì)發(fā)生再礦化，且它們與氟化鈉的礦物質(zhì)沉積特點(diǎn)一致。奧敏清和氟化鈉聯(lián)合使用的效果優(yōu)于BioMinF和奧敏清單獨(dú)應(yīng)用，提示奧敏清和氟化物在牙本質(zhì)再礦化作用中具有協(xié)同作用，但可能存在劑量依賴性，這有待于后期的進(jìn)一步研究。