德國洋甘菊精油納米膠囊的制備及抗真菌性能研究

王紫薇 袁藝 梁雪萍 陳友慧

摘要 [目的]為拓寬德國洋甘菊精油在抑菌方面的應(yīng)用，以德國洋甘菊精油為芯材，殼聚糖為壁材制備德國洋甘菊精油納米膠囊。[方法]采用離子凝膠法制備德國洋甘菊精油納米膠囊，并對所制備的德國洋甘菊精油納米膠囊進行包埋率測定;同時采用菌絲生長速率法測定德國洋甘菊精油納米膠囊對水稻紋枯病菌、小麥赤霉病菌、玉米彎孢病菌的抗菌性能。[結(jié)果]德國洋甘菊精油納米膠囊的包埋率為36.33%，抑菌試驗表明德國洋甘菊精油納米膠囊對水稻紋枯病菌、小麥赤霉病菌、玉米彎孢病菌均有抑制作用，EC50值分別為4.61、15.51、12.20 mg/mL。[結(jié)論]德國洋甘菊精油納米膠囊對植物病原真菌有一定的抑制作用，具有開發(fā)為天然殺菌劑的潛力。

關(guān)鍵詞 德國洋甘菊精油;納米膠囊;制備;抑菌活性

中圖分類號 R285.5? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2022）10-0157-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.10.035

Study on Preparation and Antifungal Properties of Matricaria chamomilla Essential Oil Nanocapsules

WANG Zi-wei，YUAN Yi，LIANG Xue-ping et al （School of Life Sciences，Anhui Agricultural University，Hefei，Anhui 230036）

Abstract [Objective]In order to broaden the application of Matricaria chamomilla essential oil in antibacterial，Matricaria chamomilla essential oil nanocapsules were prepared with Matricaria chamomilla essential oil as the core material and chitosan as the wall material.[Method]The Matricaria chamomilla essential oil nanocapsules were prepared by ionic gelation method，and the encapsulation rate of the prepared Matricaria chamomilla essential oil nanocapsules was measured.At the same time，the mycelial growth rate method was used to determine the antibacterial properties of Matricaria chamomilla essential oil nanocapsules against Rhizoctonia solani，F(xiàn)usarium graminearum and Curvularia lunata.[Result]The encapsulation rate of Matricaria chamomilla essential oil nanocapsules was 36.33%，and the inhibition experiments showed that Matricaria chamomilla essential oil had the inhibitory effect on Rhizoctonia solani，F(xiàn)usarium graminearum and Curvularia lunata with the EC50 values of 4.61，15.51 and 12.20 mg/mL，respectively.[Conclusion]Matricaria chamomilla essential oil nanocapsules have a certain inhibitory effect on phytopathogenic fungi and have the potential to be developed as natural fungicides.

Key words Matricaria chamomilla essential oil;Nanocapsules;Preparation;Antifungal activity

基金項目 2020年國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（202010364053）。

作者簡介 王紫薇（1999—），女，安徽蕭縣人，從事生物制藥研究。通信作者，教授，碩士，博士生導師，從事植物細胞工程、植物次生代謝、植物資源的開發(fā)與利用研究。

收稿日期 2021-11-24;修回日期 2022-03-14

小麥、水稻和玉米是我國主要糧食作物，但由于各種病蟲害的侵襲常造成3種農(nóng)作物減產(chǎn)。赤霉病是大田里小麥容易感染的病菌之一[1]，擔子類立枯絲核菌引發(fā)的水稻紋枯病是大田里危害最為嚴重的水稻真菌病害之一[2-3]，玉米彎孢菌葉斑病是我國玉米生產(chǎn)上重要的葉部病害，作物一旦感染上這幾種病菌，就會導致產(chǎn)量和品質(zhì)下降[4]。目前對于這3種菌的防治主要采用化學農(nóng)藥，通過藥劑噴灑、淋灌的方式來進行防治。但是大量的使用化學試劑對環(huán)境造成很大的危害，甚至破壞了生態(tài)的平衡。隨著化學藥劑使用年限的增加，植物病原真菌對化學藥劑的抗性變得越來越明顯[5]，急需尋找環(huán)境友好型生物農(nóng)藥。

德國洋甘菊（Matricaria chamomilla L.），菊科母菊屬植物，有很高的藥用價值[6]。洋甘菊精油含有多種抗炎抗菌的藥效成分，具有復合抗菌作用[7]。由于精油安全無污染、無毒副作用，故是一種極具開發(fā)潛力的植物源殺菌劑[8-10]。但由于德國洋甘菊精油具有易揮發(fā)的特性，在儲存和使用過程中容易造成損失，限制了它在抗菌方面的應(yīng)用[11]。

殼聚糖是一種天然高分子物質(zhì)，成本低廉，來源廣泛，常用來作為增稠劑和被膜劑，同時它還具有抗菌、可降解性、無毒無害等一系列優(yōu)良的生物學特性[12-13]。將殼聚糖作為壁材包裹精油可以提高精油的穩(wěn)定性和流動性，控制有效成分的揮發(fā)速率，使其更有效地發(fā)揮生物學活性。

該研究采用離子凝膠法[14]制備德國洋甘菊精油納米膠囊，并對其進行包埋率測定，同時探究德國洋甘菊精油納米膠囊對水稻紋枯病菌、小麥赤霉病菌、玉米彎孢病菌的抗菌性能，為植物精油類新型殺菌物質(zhì)的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試材。德國洋甘菊干燥花序購買于宣城市躍平生態(tài)科技開發(fā)有限責任公司;水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）、小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）由安徽農(nóng)業(yè)大學植物保護學院提供，玉米彎孢病菌（Curvularia lunata）由安徽農(nóng)業(yè)大學生命科學學院提供。

1.1.2 主要試劑。殼聚糖（脫乙酰度≥95%，MW≈70 000），酷爾化學科技（北京）有限公司;微孔濾膜（孔徑0.45 μm），海寧市創(chuàng)偉過濾設(shè)備器材廠;吐溫-80，無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司;三聚磷酸鈉，西隴科學股份有限公司。

1.1.3 主要儀器。

85-2恒溫磁力攪拌器，常州越新儀器制造有限公司;冰凍離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司;UV-2102PCS型紫外可見分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司;紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司;立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 德國洋甘菊精油的提取。

采用水蒸氣蒸餾法[15]提取德國洋甘菊精油。稱取80 g粉碎后的德國洋甘菊干燥花序裝入2 000 mL蒸餾瓶中，加入1 200 mL蒸餾水。搭好蒸餾裝置，持續(xù)蒸餾約7 h后，收集精油，放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 德國洋甘菊精油最大吸收波長的確定。

配制1 mg/mL的德國洋甘菊精油儲備液，備用。用無水乙醇稀釋儲備液，配制成某一濃度的德國洋甘菊精油溶液，并以無水乙醇作為空白對照，190～900 nm進行掃描，確定最大吸收波長。

1.2.3 德國洋甘菊精油標準曲線繪制。

從1 mg/mL德國洋甘菊精油儲備液中分別吸取1 250、2 500、3 750、5 000、6 250 μL于5個50 mL容量瓶中，用無水乙醇定容，分別配制成濃度為0.025、0.050、0.075、0.100、0.125 mg/mL的德國洋甘菊精油溶液，測定吸光度。

1.2.4 德國洋甘菊精油納米膠囊的制備。

參照文獻[16-18]的方法。將0.18 g殼聚糖加至60 mL體積分數(shù)為1%的冰醋酸中，60 ℃恒溫磁力攪拌60 min，形成殼聚糖溶液，并用0.45 μm 微孔濾膜過濾。取50 mL濾液，加入3～4滴吐溫-80，60 ℃攪拌30 min，冷卻。稱取80 mg德國洋甘菊精油，用4 mL無水乙醇溶解，并逐滴加至殼聚糖/吐溫-80溶液中，常溫攪拌30 min。稱取0.06 g三聚磷酸鈉，加入10 mL蒸餾水溶解，調(diào)節(jié)pH約為4.5，并逐滴加至上述溶液中，常溫攪拌1 h，得到納米膠囊分散液。納米膠囊分散液在4 ℃，12 000 r/min 離心5 min后倒去上清液，沉淀置于冷凍干燥機中，冷凍干燥12 h后拿出，收集凍干粉。

1.2.5 德國洋甘菊精油納米膠囊包埋率的測定。

納米膠囊分散液在4 ℃、12 000 r/min離心5 min后，測量上清液體積，取上清液200 μL用無水乙醇稀釋50倍后在最大吸收波長處測量吸光度，計算出未包埋的德國洋甘菊精油質(zhì)量。包埋率計算公式如下：

包埋率=m1-m2m1×100%（1）

式中，m1為德國洋甘菊精油添加量（mg）;m2為未包埋精油質(zhì)量（mg）。

1.2.6 德國洋甘菊精油納米膠囊的抗菌性能評價。用不同量的德國洋甘菊精油納米膠囊和德國洋甘菊精油與滅菌后的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（ PDA） 培養(yǎng)基混合均勻，分別取直徑為5 mm的水稻紋枯病菌、小麥赤霉病菌、玉米彎孢病菌的菌塊接種，3組平行。在28 ℃下，分別培養(yǎng)至對照組長滿后，采用十字交叉法測量菌絲體直徑[19]。根據(jù)公式（2）計算菌絲生長的抑制率，并根據(jù)概率值分析法求毒力回歸方程和半數(shù)有效濃度EC50。

抑制率=（D1-5）-（D2-5）D1-5×100%（2）

式中，5為接種的菌塊直徑（mm），D1為空白對照菌落直徑（mm），D2為藥劑處理的菌落直徑（mm）。

2 結(jié)果與分析

2.1 德國洋甘菊精油最大吸收波長 由圖1可知，德國洋甘菊精油的最大吸收波長為289 nm。

2.2 德國洋甘菊精油標準曲線

以德國洋甘菊精油濃度為X軸、吸光度為Y軸繪制的標準曲線如圖2所示，德國洋甘菊精油標準曲線方程為y=7.86x+0.016 3（R2=0.998 3），表明在0.025～0.125 mg/mL，德國洋甘菊精油濃度與吸光度的線性關(guān)系良好。

2.3 德國洋甘菊精油納米膠囊包埋率

通過包埋率計算公式（1）可得，德國洋甘菊精油納米膠囊的包埋率為36.33%。梁英等[20]通過Box-Behnken和響應(yīng)面優(yōu)化，在得出的最佳制備條件下制得的龍蒿精油納米膠囊的包埋率為43.67%，高于該試驗納米膠囊的包埋率。在后續(xù)試驗中，可以通過改進制備條件來提高納米膠囊的包埋率。

2.4 德國洋甘菊精油納米膠囊的抗菌性能

2.4.1 德國洋甘菊精油抗真菌性能。

由圖3和表1可知，同一處理濃度對不同植物病原真菌的抑制作用差異顯著，對同種植物病原真菌的抑制率隨著德國洋甘菊精油濃度的增加而增加。各處理濃度間對水稻紋枯病菌的抑制作用差異顯著;處理濃度2.500 mg/mL與5.000 mg/mL對小麥赤霉病菌的抑制作用無明顯差異，其余濃度間對小麥赤霉病菌的抑制作用差異顯著;處理濃度1.250 mg/mL與2.500 mg/mL對玉米彎孢病菌的抑制作用無顯著差異，其余各處理濃度間對玉米彎孢病菌的抑制作用差異顯著。

由表2可知，德國洋甘菊精油對水稻紋枯病菌、小麥赤霉病菌和玉米彎孢病菌的EC50分別為0.16、0.37、0.35 mg/mL，說明德國洋甘菊精油對水稻紋枯病菌的毒力最強。毒力方程中斜率與德國洋甘菊精油作用于病原真菌的敏感度相關(guān)，兩者呈正比。3種病原真菌的斜率從大到小依次為水稻紋枯病菌、玉米彎孢病菌、小麥赤霉病菌，表明水稻紋枯病對德國洋甘菊精油最敏感。由此可見，敏感度與它們的EC50值結(jié)果是相一致的。

2.4.2 德國洋甘菊精油納米膠囊抗真菌性能。

由圖4和表3可知，當精油納米膠囊濃度為0.625 mg/mL時，藥劑濃度低，

德國洋甘菊精油納米膠囊對3種真菌均無抑制作用。當處

理濃度為1.250 mg/mL時，對不同植物病原真菌的抑制作用無顯著差異。德國洋甘菊精油納米膠囊對同一植物病原真菌的抑制率隨著納米膠囊濃度的增大而增大。各處理濃度間對水稻紋枯病菌、小麥赤霉病菌、玉米彎孢病菌的抑制作用差異顯著。

由表4可知，德國洋甘菊精油納米膠囊對水稻紋枯病菌、小麥赤霉病菌和玉米彎孢病菌的EC50值分別為4.61、15.51、12.20 mg/mL，說明德國洋甘菊精油納米膠囊對水稻紋枯病菌的毒力最強，對小麥赤霉病菌的毒力最弱。3種病原真菌的斜率從大到小依次為水稻紋枯病菌、玉米彎孢病菌、小麥赤霉病菌，表明水稻紋枯病菌對洋甘菊精油納米膠囊最敏感，其次為玉米彎孢病菌，小麥赤霉病菌敏感性最低。由此可見，敏感度與它們的EC50值結(jié)果是相一致的。

3 討論

德國洋甘菊精油的密度在0.90 g/mL左右，因此試驗中所設(shè)精油與納米膠囊的濃度梯度相當。德國洋甘菊精油和德國洋甘菊精油納米膠囊對3種植物病原真菌水稻紋枯病

菌、小麥赤霉病菌、玉米彎孢病菌的EC50比較可知，納米膠囊

對3種植物病原真菌的EC50大于德國洋甘菊精油，原因可能：一是在制備德國洋甘菊精油納米膠囊時，包埋率低，只有36.33%，納米膠囊中所包埋的精油質(zhì)量少;二是其具有緩釋性，在相同培養(yǎng)時間內(nèi)精油沒有完全釋放出來。德國洋甘菊精油在被殼聚糖包裹制成納米膠囊時，其穩(wěn)定性大大提高，但是還要考慮其包埋率和緩釋性的影響，這二者會使德國洋甘菊精油的有效釋放量降低，從而會降低抑制率，但是盡管在精油含量已經(jīng)降低的情況下，仍然對這3種植物病原真菌有一定的抑制作用，所以在未來的試驗中，要不斷優(yōu)化試驗方法，提高包埋率。

4 結(jié)論

該研究采用離子凝膠法制備德國洋甘菊精油納米膠囊，測得其平均包埋率為36.33%。抑菌試驗表明德國洋甘菊精油和德國洋甘菊精油納米膠囊對水稻紋枯病菌、小麥赤霉病菌、玉米彎孢病菌均有抑制作用。將凍干成粉的納米膠囊與培養(yǎng)基混勻制備成含藥培養(yǎng)基，觀察測定其對3種植物病原真菌的抑菌效果，與德國洋甘菊精油對3種植物病原真菌的抑菌效果排序順序一致，從強到弱依次為水稻紋枯病菌、玉米彎孢病菌、小麥赤霉病菌。

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