高 永

(曲靖師范學(xué)院 生物資源與食品工程學(xué)院，云南 曲靖 655011)

0 引 言

魔芋屬(Amorphophallus)屬于天南星科多年生草本植物，該屬物種的地下球莖富含可溶性膳食纖維—葡甘露聚糖，對(duì)人體降血脂、降血糖、減肥等具有一定功效，在很多東亞國家被作為綠色健康食品[1].在我國，魔芋作為藥用植物及食物的來源有近2000年的栽培和利用歷史[2].我國魔芋的主栽種為花魔芋(A.konjac)，該種因產(chǎn)量高、葡甘聚糖含量較高、生長適應(yīng)性廣，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值.而其它魔芋種由于適應(yīng)性及品質(zhì)等原因，在我國栽培范圍相對(duì)較窄[3].魔芋屬各物種之間的形態(tài)差異較小且不穩(wěn)定，一般只能依據(jù)花形態(tài)才能對(duì)各種進(jìn)行可靠判定，但魔芋通常四到五年才開花，這對(duì)利用花形態(tài)對(duì)其進(jìn)行物種鑒定造成了一定困難(圖1).近年來，農(nóng)民種植過程中選錯(cuò)魔芋種，造成生長不適應(yīng)、品質(zhì)產(chǎn)量低等現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，使芋農(nóng)蒙受了不必要的經(jīng)濟(jì)損失[4].

隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記手段被越來越多地運(yùn)用到物種分類鑒定上.其中，SSR分子標(biāo)記具有共顯性、分布廣泛、多態(tài)性豐富、通用性好等優(yōu)點(diǎn)，被研究者認(rèn)為是動(dòng)植物研究中最強(qiáng)大、信息含量最豐富的分子標(biāo)記之一[5].目前很多重要作物，如小麥、水稻、玉米、馬鈴薯、棉花等的SSR標(biāo)記已被完整開發(fā)[5-8].但由于魔芋是相對(duì)小眾的作物，該屬的SSR標(biāo)記開發(fā)相對(duì)較少，影響了種質(zhì)資源的分子鑒定與遺傳評(píng)價(jià).

我國的魔芋研究主要集中于魔芋的栽培管理、葡甘聚糖的化學(xué)特性等方面，對(duì)魔芋的分子生物學(xué)研究起步較晚[9].目前僅有少量研究利用ISSR、RAPD、AFLP等分子標(biāo)記，探討了魔芋部分野生種和栽培品種的親緣關(guān)系[4, 10].但這些分子標(biāo)記的開發(fā)難度相對(duì)較大，穩(wěn)定性較差，不是物種鑒定的最優(yōu)選項(xiàng).二代測(cè)序技術(shù)(next-generation sequencing, NGS)的發(fā)展，為從非模式物種中開發(fā)大量分子標(biāo)記提供了可能.本研究通過滇魔芋的簡(jiǎn)化基因組測(cè)序(restriction site-associated DNA sequencing, RAD-seq)數(shù)據(jù)開發(fā)SSR標(biāo)記，篩選可在滇魔芋(A.yunnanensis)、西盟魔芋(A.krausei)、東京魔芋(A.tonkinensis)、白魔芋(A.albus)4個(gè)物種間通用的SSR引物，并利用SSR分子標(biāo)記對(duì)4個(gè)種進(jìn)行分子鑒定，為魔芋種質(zhì)資源的栽培利用奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 樣本采集及保存

自2018年以來，對(duì)我國魔芋屬植株形態(tài)接近的4個(gè)物種進(jìn)行了調(diào)查采樣，共采集到17個(gè)種群(圖1，表1).采樣過程中，對(duì)每株魔芋分別取5g葉片，置于-20℃冰箱保存，以備后續(xù)的基因組DNA提取.

表1 本研究的魔芋物種群體編號(hào)及采樣地點(diǎn)

圖1 本研究四種魔芋的植株及花形態(tài)

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1 魔芋DNA提取及檢測(cè)

使用植物基因組DNA試劑盒(天根，北京)提取魔芋葉片的總基因組DNA，DNA提取步驟按照試劑盒規(guī)定的操作流程進(jìn)行.為評(píng)估DNA的質(zhì)量，將提取的基因組DNA用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè).

1.2.2 SSR開發(fā)和引物設(shè)計(jì)

為開發(fā)魔芋的基因組SSR標(biāo)記，從三個(gè)滇魔芋種群(SZFHG、BNGD、BMHC)各挑選1個(gè)樣本(共3個(gè)樣本)進(jìn)行簡(jiǎn)化基因組測(cè)序.使用STACKS v 1.47[11]對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，用MISA軟件檢測(cè)序列中的SSR位點(diǎn)，并使用primer 3設(shè)計(jì)每個(gè)位點(diǎn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reation, PCR)擴(kuò)增引物[12].

1.2.3 魔芋通用SSR標(biāo)記的篩選

為篩選多態(tài)性SSR標(biāo)記，研究隨機(jī)選取了105對(duì)SSR引物，首先采用25個(gè)滇魔芋樣本進(jìn)行多態(tài)性SSR標(biāo)記初篩，樣本取自5個(gè)種群(SZFHG、BNGD、BMMH、LCYDYL和YSXS)，每個(gè)種群選擇5個(gè)樣本.PCR反應(yīng)體系為30 μL，包括1 ×PCR Mix(Genestar，北京)，0.025 μM的M13加尾的正向引物，0.5 μM 的5’-6-FAM或HEX熒光標(biāo)記的M13引物，0.5 μM的反向引物和50 ng的模板DNA.擴(kuò)增采用梯度降落式PCR(Touchdown PCR)方法，經(jīng)過95℃變性之后，首先將退火溫度設(shè)置為62℃，然后每循環(huán)降低1℃，進(jìn)行5個(gè)擴(kuò)增循環(huán)；然后將退火溫度設(shè)定為56℃，運(yùn)行30個(gè)擴(kuò)增循環(huán).隨后將得到的PCR產(chǎn)物在ABI 3730XL基因測(cè)序儀(Applied Biosystems, USA)進(jìn)行毛細(xì)管電泳分離，并使用GeneMarker2.3(Applied Bioscience)對(duì)電泳峰圖進(jìn)行SSR基因分型.

將最終篩選得到的多態(tài)性引物在滇魔芋剩余樣本中進(jìn)行群體擴(kuò)增.此外，為了獲得魔芋物種間通用的SSR標(biāo)記，將多態(tài)性良好的引物在西盟魔芋、白魔芋和東亞魔芋中進(jìn)行樣本擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增及檢測(cè)條件同上.

1.2.4 基于SSR的魔芋種間分子鑒定

對(duì)篩選出的魔芋種間通用的SSR標(biāo)記，將4個(gè)魔芋物種的SSR基因分型數(shù)據(jù)用GenAlex軟件計(jì)算各SSR標(biāo)記的遺傳多樣性參數(shù)，包括等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀察雜合度(Ho)和預(yù)期雜合度(He)[13].然后利用GenAlex軟件計(jì)算各群體之間的遺傳距離矩陣，并用MEGA軟件構(gòu)建4個(gè)魔芋物種間的非加權(quán)組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means, UPGMA)聚類樹[14].

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 基因組DNA質(zhì)量及簡(jiǎn)化基因組測(cè)序

基因組DNA電泳結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)中所提取的DNA 條帶清晰明亮，沒有明顯的拖尾現(xiàn)象，DNA 質(zhì)量較好、純度較高，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求(圖 2).滇魔芋3個(gè)樣本的簡(jiǎn)化基因組測(cè)序數(shù)據(jù)量分別為6.14 Gb、7.35 Gb和5.18 Gb，經(jīng)過組裝，最終獲得總長度為184 Mb的組裝序列.

圖2 部分樣本基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 SSR標(biāo)記開發(fā)及引物篩選

在組裝基因組中共檢測(cè)到18,336個(gè)SSR標(biāo)記位點(diǎn)，其中9,005個(gè)位點(diǎn)可以順利設(shè)計(jì)出PCR引物.對(duì)于隨機(jī)選出的PCR驗(yàn)證的105對(duì)引物，73對(duì)可成功在滇魔芋群體中擴(kuò)增出預(yù)期條帶，其中12對(duì)引物顯示多態(tài)性.這12個(gè)SSR位點(diǎn)的重復(fù)基序從2堿基到5堿基，PCR擴(kuò)增片段長度分布在139 bp到324 bp(表2，圖3).基于這12個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)其他3個(gè)魔芋種進(jìn)行了種間通用性檢測(cè)，結(jié)果表明在這12個(gè)SSR位點(diǎn)大多數(shù)物種內(nèi)都可以成功擴(kuò)增(表3).四個(gè)物種的分型數(shù)據(jù)表明，在12個(gè)SSR標(biāo)記中共檢測(cè)到33個(gè)等位基因(Na)，數(shù)量從2個(gè)(SSR66、SSR14、SSR71、SSR37和SSR96)到4個(gè)(SSR13和SSR105)不等，平均數(shù)量為2.75個(gè).觀察雜合度(Ho)在0.130到0.880之間，預(yù)期雜合度(He)在0.055到0.476之間，每個(gè)基因座的平均有效等位基因(Ne)在0.711至1.945之間(表4).

表3 篩選滇魔芋多態(tài)性SSR引物在其他3個(gè)魔芋物的擴(kuò)增結(jié)果

表4 SSR標(biāo)記的遺傳多樣性參數(shù)

圖3 分子標(biāo)記SSR105部分樣本的基因分型圖譜

表2 篩選SSR引物信息

基于這12個(gè)SSR標(biāo)記的基因分型數(shù)據(jù)，對(duì)滇魔芋、東京魔芋、西盟魔芋、白魔芋的所有個(gè)體樣本進(jìn)行UPGMA聚類分析.結(jié)果表明，滇魔芋和東京魔芋可與其他兩種區(qū)分開來，而西盟魔芋與白魔芋樣本之間無法完全分開(圖4).

圖4 基于SSR分型數(shù)據(jù)的魔芋4個(gè)物種UPGMA聚類樹

3 討 論

3.1 SSR標(biāo)記對(duì)魔芋種質(zhì)資源鑒定的意義

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，SSR標(biāo)記技術(shù)越來越顯示出廣闊的應(yīng)用前景.本研究通過RAD-seq開發(fā)了數(shù)以萬計(jì)的魔芋基因組SSR標(biāo)記，相較于傳統(tǒng)標(biāo)記開發(fā)手段，本研究無論從時(shí)間和經(jīng)費(fèi)上均更具優(yōu)勢(shì)，這充分表明RAD-seq是一種開發(fā)SSR標(biāo)記的有效手段[15-16].而對(duì)于本研究評(píng)估的105對(duì)SSR引物，有73對(duì)(69.5%)可以成功在滇魔芋群體中擴(kuò)增，這與前人研究中其他植物的PCR擴(kuò)增成功比例大致相同(60%-90%)[15, 17].此外，本研究篩選出的滇魔芋SSR多態(tài)性標(biāo)記，也在其他3個(gè)魔芋種中表現(xiàn)出良好的種間PCR擴(kuò)增通用性，這些多態(tài)性SSR位點(diǎn)將為魔芋的后續(xù)的種質(zhì)資源鑒定與利用提供分子數(shù)據(jù).

3.2魔芋SSR標(biāo)記的種間鑒定

本研究所得到的引物雖然可以將滇魔芋和東亞魔芋從四個(gè)物種中鑒定出來，但對(duì)西盟魔芋和白魔芋的區(qū)分度不足.可能的原因是，首先標(biāo)記數(shù)量過少，本研究總共篩選出12對(duì)多態(tài)性SSR引物，少量的標(biāo)記可能無法完全區(qū)分魔芋屬內(nèi)的近緣種[18].后續(xù)嘗試將標(biāo)記數(shù)量增加到20～30個(gè)，可能會(huì)解決種間區(qū)分度不足的問題.其次，有研究認(rèn)為白魔芋與西盟魔芋的植株及花形態(tài)較相似，這兩個(gè)物種之間可能親緣關(guān)系較近，少量的SSR標(biāo)記不能反映兩者之間的遺傳差異[19].基于葉綠體rbcL基因的白魔芋和西盟魔芋的分子系統(tǒng)發(fā)育研究也表明，這兩個(gè)物種之間的遺傳變異較低，較短的質(zhì)體DNA片段無法可靠區(qū)分魔芋屬內(nèi)的近緣物種[20].最后，雖然SSR標(biāo)記在植物基因組中大量存在，變異廣泛，相比RAPD、RFLP等分子標(biāo)記的多態(tài)性更高；但SSR標(biāo)記的一個(gè)重要局限就是種間保守性較低，僅能在同一個(gè)物種內(nèi)或?qū)賰?nèi)近緣種間進(jìn)行擴(kuò)增[9].本研究的SSR標(biāo)記是基于滇魔芋的簡(jiǎn)化基因組數(shù)據(jù)開發(fā)，物種特異性造成了標(biāo)記在其他三個(gè)魔芋物種中的多態(tài)性較低，影響了物種的鑒定.

4 結(jié) 論

綜上，本研究開發(fā)得到了魔芋基因組數(shù)以萬計(jì)的SSR標(biāo)記，這些標(biāo)記在魔芋種中表現(xiàn)出較好的多態(tài)性和種間通用性.系統(tǒng)聚類樹表明，這些標(biāo)記可以用于魔芋屬內(nèi)的物種分子鑒定.后續(xù)研究將進(jìn)一步篩選區(qū)分度更好的魔芋種間SSR通用引物，為后續(xù)的魔芋種植產(chǎn)業(yè)提供輔助.