戴 益，許玉玲，劉 瑩，孫 娜，董海群，劉振芳，趙衛(wèi)華，程 鵬

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530021）

急性髓細(xì)胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）尤其是急性早幼粒細(xì)胞白血?。╝cute promyelocytic leukemia，APL）在治療早期容易合并出凝血的紊亂[1-2]。微粒（micorparticle，MPs）是細(xì)胞在活化、損傷或凋亡過(guò)程中釋放的直徑為0.1～1 μm 亞微米大小的囊泡[3]。到目前為止，許多血栓前狀態(tài)都有循環(huán)MPs 增多的報(bào)道，血栓形成的幾個(gè)因素，如凝血酶、活化蛋白C、炎性細(xì)胞因子和高剪應(yīng)力，都是誘導(dǎo)MPs 形成的因素[4-5]。MPs 作為一種被膜包裹的小囊泡，從各種類型的細(xì)胞中脫落出來(lái)。它廣泛存在于血液、尿液、唾液、乳汁、精液、關(guān)節(jié)液或腦脊液中[6]。由于MPs 穩(wěn)定性高，已有部分研究表明，MPs 可作為新的血栓標(biāo)志物聯(lián)合D-二聚體（Ddimer，DD）檢測(cè)能顯著提高深靜脈血栓的診斷[7]。盡管已有較多文獻(xiàn)報(bào)道MPs 水平升高與實(shí)體腫瘤血栓前狀態(tài)之間存在關(guān)聯(lián)[8-9]，但迄今為止，在血液系統(tǒng)腫瘤尤其在AML 中關(guān)于MPs 的報(bào)道仍較少[10-11]。本文采用流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測(cè)AML 患者血漿中組織因子微粒（tissue factor microparticles，TF+MPs）、內(nèi)皮細(xì)胞微粒（endothelial cell microparticles，EMPs）、血小板微粒（platelet microparticles，PMPs）水平；免疫濁比法檢測(cè)DD、纖維蛋白降解產(chǎn)物（fibrin degradation product，F(xiàn)DP）水平，觀察上述指標(biāo)在初治AML 患者血漿中的表達(dá)狀態(tài)，并初步探討在AML凝血之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選取2021年2月至2021年10月在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的62例初治AML患者，其中男28 例，女34 例，年齡18～74 歲，平均（48.53±13.94）歲。將64例初治AML患者分為APL組和非APL 組；其中APL 組16 例；非APL 組46 例。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)確診的初治急性髓細(xì)胞白血病患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）既往發(fā)生過(guò)血栓或有血栓家族遺傳史；（2）其他疾病，如嚴(yán)重肝病、嚴(yán)重感染、其他實(shí)體腫瘤導(dǎo)致的凝血紊亂。選取同期相匹配28 例健康志愿者作為對(duì)照（正常組）；其中男17 例，女11例，平均（49.50±7.82）歲。本研究已取得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，樣本采集均征求受試者及患者家屬知情同意。

1.2 主要試劑及儀器 藻紅蛋白標(biāo)記的組織因子特異性熒光CD142 單克隆抗體（CD142-PE）、藻紅蛋白標(biāo)記的內(nèi)皮細(xì)胞特異性熒光CD62e 單克隆抗體（CD62e-PE）、藻紅蛋白標(biāo)記的血小板特異性熒光CD61 單克隆抗體（CD61-PE）和藻紅蛋白標(biāo)記的鼠抗人IgG 單克隆抗體（IgG-PE）均為BD 公司產(chǎn)品。流式細(xì)胞系校準(zhǔn)微球（0.5 μm；1 μm；2 μm）購(gòu)自Themo Fisher 公司。DD、FDP 配套檢測(cè)試劑（購(gòu)自沃芬公司）。流式細(xì)胞儀FC500 為美國(guó)Beckman Coulter公司產(chǎn)品。

1.3 標(biāo)本收集 清晨靜息空腹?fàn)顟B(tài)下，抽取患者、健康對(duì)照者肘靜脈血4 mL，枸櫞酸鈉抗凝，標(biāo)本置于冰盒中，運(yùn)輸過(guò)程中避免劇烈搖晃震動(dòng)。4 ℃，3 000 r/mim，15 min，取上清1/2重復(fù)上述離心，再取1/2 得到乏血小板血漿（platelet-poor plasma，PPP），立即儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱中。

1.4 免疫熒光標(biāo)記 凍存樣本從-80 ℃的超低溫冰箱中取出，37 ℃恒溫水浴箱中解凍。采用單染色標(biāo)記法，向流式檢測(cè)管中各加入50 μL PPP，分別加入5 μL PE 標(biāo)記的CD142 單克隆抗體、CD62e 單克隆抗體、CD61單克隆抗體分別標(biāo)記TF+MPs、EMPs、PMPs，充分混勻，避光孵育30 min。加入445 μL 磷酸鹽緩沖液（PBS）將體積調(diào)整至0.5 mL，充分混勻后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。選用鼠抗人IgG-PE 抗體作為陰性對(duì)照。

1.5 FCM的檢測(cè) 用0.5 μm、1 μm、2 μm的標(biāo)準(zhǔn)微球設(shè)定前向檢測(cè)區(qū)，根據(jù)0.5 μm、1 μm、2 μm標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)微球確定1 μm 的位置，使用流式細(xì)胞儀對(duì)0～1 μm的微粒進(jìn)行分析。目的微顆粒的界定：直徑在0～1 μm之間的，且PE標(biāo)記特異性抗體陽(yáng)性的微顆粒。

1.6 DD、FDP 的檢測(cè) DD、FDP 均采用免疫濁比法檢測(cè)。使用美國(guó)Instrumentation Laboratory 的ACL TOP 型全自動(dòng)凝血分析儀及配套試劑盒檢測(cè)DD、FDP水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，正態(tài)分布計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；偏態(tài)分布計(jì)量資料以M（P25～P75）表示，兩組間比較采用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)；正態(tài)分布的計(jì)量資料間的相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析，非正態(tài)分布的計(jì)量資料間的相關(guān)性分析采用Spearman 相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TF+MPs、EMPs、PMPs 3 種微粒在FCM 檢測(cè)方法的建立 根據(jù)0.5 μm、1 μm、2 μm 標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)微球確定1 μm的相對(duì)位置，見(jiàn)圖1。選用鼠抗人IgG-PE抗體確定陰性組對(duì)照所在位置，見(jiàn)圖2。用PE標(biāo)記的CD142單克隆抗體、CD62e單克隆抗體、CD61單克隆抗體分別標(biāo)記TF+MPs、EMPs、PMPs。共讀取20 000 個(gè)微粒，對(duì)0～1 μm 內(nèi)的顆粒進(jìn)行分析，圖3A～3C 分別代表落在0～1 μm 內(nèi)表面標(biāo)記CD142、CD62e、CD61陽(yáng)性的微粒。

圖1 熒光微球校準(zhǔn)珠進(jìn)行微粒圈門

圖2 AML組陰性對(duì)照檢測(cè)結(jié)果

2.2 AML組與對(duì)照組TF+MPs、EMPs、PMPs檢測(cè)結(jié)果的比較 將AML 組分為APL 組和非APL 組，APL 組、非APL 組、正常組TF+MPs、EMPs、PMPs 檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1～圖3、表1。APL 組患者TF+MPs、EMPs、PMPs 高于非APL 組、正常組（均P＜0.05），見(jiàn)表1。

圖3 AML組微粒檢測(cè)結(jié)果

表1 不同組別TF+MPs、EMPs、PMPs檢測(cè)結(jié)果%，

表1 不同組別TF+MPs、EMPs、PMPs檢測(cè)結(jié)果%，

與APL組比較，△P＜0.05。

2.3 AML 組和對(duì)照組DD、FDP 檢測(cè)結(jié)果 APL 組患者DD、FDP 水平高于非APL 組、正常組（均P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 不同組別DD、FDP檢測(cè)結(jié)果M（P25～P75）

2.4 相關(guān)性分析 相關(guān)分析表明，DD 與TF+MPs（r=0.728，P＜0.001）、EMPs（r=0.790，P＜0.001）、PMPs（r=0.615，P＜0.001）呈正相關(guān)關(guān)系。

3 討論

在本研究中，筆者納入了62例初治AML患者，28例健康對(duì)照，主要采用FCM檢測(cè)患者血漿中TF+MPs、EMPs、PMPs 3 種微粒水平。觀察它們?cè)诔踔蜛ML 患者治療早期的表達(dá)情況。筆者發(fā)現(xiàn)APL 組患者血漿中的3 種微粒、DD、FDP 水平高于非APL組和正常組（均P＜0.05）。APL是AML的一個(gè)特殊的亞型，其特征是在15～17號(hào)染色體之間易位。大約至少80%的APL 患者在發(fā)病時(shí)存在明顯的臨床凝血障礙[1，12]。一項(xiàng)34 例APL患者的單中心回顧性分析顯示，APL 患者其致命性出血發(fā)生率為29%，同時(shí)12%患者發(fā)生了嚴(yán)重血栓栓塞事件。這些事件不僅可發(fā)生于誘導(dǎo)治療過(guò)程中，而且可以發(fā)生于治療開(kāi)始之前[13]。

MPs 是一種小的促凝血膜囊泡，在急性靜脈血栓栓塞癥（VTE）患者血液中TF+MPs 水平顯著升高。Thaler等[14]在它們研究中發(fā)現(xiàn)，TF+MPs 的活性在AML相關(guān)的彌漫性血管內(nèi)凝血（DIC）期間升高，證明了TF+MPs 在AML 患者DIC 的發(fā)病中可能發(fā)揮重要作用。在本次研究中，根據(jù)CDSS評(píng)分系統(tǒng)，筆者發(fā)現(xiàn)62例AML 患者中有3例在治療早期發(fā)生DIC，并對(duì)患者血漿MPs 水平進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)TF+MPs 的研究結(jié)果與上述Thaler 等[14]的報(bào)道一致，與他們不同的是筆者還發(fā)現(xiàn)EMPs、PMPs 在AML 相關(guān)DIC 中也升高，可能與DIC 的發(fā)生過(guò)程中內(nèi)皮細(xì)胞、血小板的損傷與活化有關(guān)。筆者的研究表明TF+MPs、EMPs、PMPs 3 種不同的MPs 在AML 相關(guān)DIC 患者血漿中均升高，此外DIC 相關(guān)參數(shù)DD、FDP 也升高比較明顯（均P＜0.05）。Campello 等[15]調(diào)查了一組癌癥相關(guān)VTE 患者與健康對(duì)照人群循環(huán)MPs的定量和定性特征，發(fā)現(xiàn)癌癥相關(guān)VTE患者血漿TF+MPS、EMPs、PMPs 水平均高于健康人。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)：MPs可作為靜脈血栓形成的危險(xiǎn)標(biāo)志物聯(lián)合P-選擇素和DD 可提高檢測(cè)DVT 的敏感性和特異性[7]。由于本研究病例數(shù)相對(duì)較少，血栓的發(fā)生率相對(duì)較低，因此需要在更大的患者群體中進(jìn)行進(jìn)行一步的研究，來(lái)評(píng)估在AML 患者M(jìn)Ps 升高導(dǎo)致血栓的風(fēng)險(xiǎn)。

本研究探討了血漿中TF+MPs、EMPs、PMPs 3 種微粒在AML 凝血中的作用，F(xiàn)CM 簡(jiǎn)單快捷，為AML 患者凝血監(jiān)測(cè)提供了新的選擇。但本實(shí)驗(yàn)也存在一些不足之處：（1）該研究為單中心小樣本研究，病例數(shù)相對(duì)較少。（2）與之匹配的健康人群樣本收集難度較大。（3）考慮到患者的經(jīng)濟(jì)原因，入院后只對(duì)一小部分患者進(jìn)行了雙下肢靜脈B 超檢測(cè)，實(shí)際的血栓發(fā)生率可能更高?？傊琈Ps穩(wěn)定且廣泛存在于人的體液中，微粒的分離和檢測(cè)方法多種多樣，只有使用標(biāo)準(zhǔn)化的定量和定性檢測(cè)微粒水平，通過(guò)前瞻性的多中心研究，將MPs與其他生物標(biāo)記物（例如DD）和一些臨床變量整合到評(píng)分系統(tǒng)中，以便提高它們?cè)贏ML 血栓栓塞中作為診斷生物標(biāo)記物的能力。