山西省紅蕓豆菌核病病原菌鑒定

薛麗芳，翟雅鑫，池吉平，曹 揮，王建明，郝曉娟

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，山西太谷 030801；2.山西省陽(yáng)泉市郊區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村服務(wù)中心，山西陽(yáng)泉 045000；3.山西省忻州市農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心，山西忻州 034099)

紅蕓豆(Phaseolusvulgaris)是一種矮生直立型豆科植物，因其籽粒碩大、色澤鮮艷、具有較高的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值，而深受國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者的喜愛[1]。自20世紀(jì)90年代以來(lái)，根據(jù)國(guó)際市場(chǎng)上對(duì)紅蕓豆的需求，山西省紅蕓豆種植面積逐年增加。2020年紅蕓豆種植總面積達(dá)2.63萬(wàn)hm2，年產(chǎn)量約4萬(wàn)t，種植面積居全國(guó)第4位[2]。

菌核病是一種世界范圍內(nèi)分布的真菌性病害，可危害十字花科[3-4]、茄科[5-6]、菊科[7]及多種豆科植物[8-11]，由菌核病造成的損失一般在10%以上，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)30%～50%，甚至絕收[12]。菌核病主要由核盤菌屬Sclerotinia真菌侵染引起[13]。引起豆科植物菌核病的病原菌種類多樣，其中大豆菌核病、扁豆菌核病病原菌為核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)[8-9]；希臘蠶豆菌核病病原菌為三葉草核盤菌(Sclerotiniatrifoliorum)[10]；澳大利亞鷹嘴豆菌核病病原菌為小核盤菌(Sclerotiniaminor)[11]。

近年來(lái)，隨著紅蕓豆連年種植以及種植面積的不斷擴(kuò)大，紅蕓豆菌核病發(fā)生日趨嚴(yán)重。本研究對(duì)紅蕓豆菌核病病株進(jìn)行病原菌的分離與鑒定，旨在明確山西省紅蕓豆菌核病病原菌的種類，為進(jìn)一步研究紅蕓豆菌核病的發(fā)生規(guī)律和綜合防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

于2019年8月在山西省忻州市、呂梁市紅蕓豆種植區(qū)進(jìn)行菌核病的發(fā)病情況調(diào)查。同時(shí)采集具有典型癥狀的病株，帶回實(shí)驗(yàn)室4 ℃保存，備用。

1.2 病原菌分離純化

采用組織分離法[14]進(jìn)行病原菌分離：用滅菌刀片于病健交界處切取5 mm×5 mm的組織， 在體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇中浸泡30 s，無(wú)菌水沖洗干凈后，用無(wú)菌濾紙吸收組織表面多余的水分，接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)平板上， 25 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)3 d后，切取單根菌絲頂端至PDA平板上獲得純培養(yǎng)物[14]，將純化后的菌株轉(zhuǎn)接于PDA斜面試管，于4 ℃保存，備用。

1.3 致病性測(cè)定

采用莖部接種法和豆莢離體接種法[8]進(jìn)行致病性測(cè)定。

莖部接種法：種植紅蕓豆，待第1對(duì)真葉展開時(shí)，用直徑為4 mm的滅菌打孔器在PDA培養(yǎng)的菌落邊緣打取菌餅，用無(wú)菌牙簽挑取接種到幼苗莖部，以無(wú)菌PDA餅為對(duì)照。每處理5株，設(shè)3次重復(fù)，室溫培養(yǎng)，觀察并記錄植株的發(fā)病情況。

豆莢離體接種法：選取生長(zhǎng)一致的紅蕓豆豆莢，用體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇進(jìn)行表面消毒，無(wú)菌水沖洗干凈后，用濾紙吸干表面水分。選取另一張浸濕(全部浸濕但無(wú)多余水分溢出)的無(wú)菌濾紙放入直徑為15 cm的培養(yǎng)皿中，將兩片無(wú)菌載玻片平鋪于培養(yǎng)皿中央，把紅蕓豆豆莢放于載玻片上。無(wú)菌牙簽刺傷豆莢表面后在傷口上接種直徑為4 mm的菌餅，以接種無(wú)菌PDA餅的豆莢為對(duì)照，每處理5個(gè)豆莢，設(shè)3次重復(fù)，25 ℃黑暗條件下進(jìn)行保濕培養(yǎng)，觀察并記錄豆莢的發(fā)病情況。

1.4 病原菌鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定 將純化后的菌株接種到PDA平板上，置于25 ℃下黑暗培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)和菌核產(chǎn)生情況。將高壓蒸汽滅菌30 min的石英砂置于50 mL無(wú)菌燒杯中，約1 cm厚，用無(wú)菌鑷子將菌核從PDA平板上取出，無(wú)菌水沖洗后，均勻地放置在石英砂上，用2 cm厚的石英砂覆蓋住菌核，燒杯中加入適量無(wú)菌水，在17 ℃黑暗條件下保濕培養(yǎng)，觀察并記錄菌核萌發(fā)情況[15]。待菌核萌發(fā)后觀察子囊盤、子囊、子囊孢子形態(tài)特征，根據(jù)《植物病原真菌學(xué)》、《真菌鑒定手冊(cè)》初步確定病菌的分類地位[16-17]。

1.4.2 分子生物學(xué)鑒定 采用Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒提取病原菌基因組DNA，以ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)、ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)為引物擴(kuò)增菌株ITS基因序列。PCR擴(kuò)增體系總體積為25 μL，包括DNA模板1 μL，引物各1 μL(10 μmol/L)，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，以ddH2O補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)程序分別為：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，最后 72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)后送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST序列比對(duì)和同源性分析，利用 MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，重復(fù)1 000 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅蕓豆菌核病發(fā)病癥狀

紅蕓豆菌核病多發(fā)生在地勢(shì)低洼田塊，一般地塊發(fā)病率為5%～25%，嚴(yán)重的可達(dá)50%以上。該病多從主莖中下部和主莖分叉處開始發(fā)病，病斑為褐色水漬狀，病斑擴(kuò)展后植株易從病部折倒(圖1-A)。濕度大時(shí)發(fā)病部位常產(chǎn)生白色棉絮狀菌絲，后期可見病部著生黑色鼠糞狀菌核(圖1-B)。豆莢亦可受害，病斑呈褐色水漬狀、不規(guī)則形(圖1-C)，濕度大時(shí)種莢表面及內(nèi)部可見白色棉絮狀菌絲，后期發(fā)病部位產(chǎn)生黑色菌核(圖 1-D)。

A、B.紅蕓豆莖及分叉處發(fā)病癥狀；C、D.豆莢發(fā)病癥狀A(yù),B.Symptoms of stems and branches; C,D.Symptoms of seed pod圖1 紅蕓豆菌核病田間癥狀Fig.1 Symptoms of Sclerotinia rot of red kidney beans in field

2.2 病原菌分離純化及

通過組織分離法共分離純化出8個(gè)菌株，各菌株形態(tài)學(xué)特征一致，挑選代表菌株J8-1.8進(jìn)行致病性測(cè)定，結(jié)果如下。

莖部接種法：接種J8-1.8菌株7 d后莖部出現(xiàn)病斑，呈水漬狀，病斑逐步擴(kuò)大，表面出現(xiàn)白色霉層，發(fā)病后期，病株從接種處折斷(圖2-A)，對(duì)照未見發(fā)病(圖2-B)。

A.莖部接種J8-1.8 7 d后癥狀；B.對(duì)照；C、D.豆莢接種J8-1.8 7 d、10 d后癥狀；E.對(duì)照A.Stem symptoms after 7 days of inoculation with J8-1.8; B.CK; C,D.Seed pod symptoms after 7 days and 10 days of inoculation with J8-1.8,respectively; E.CK圖2 致病性測(cè)定結(jié)果Fig.2 Pathogenicity test results

豆莢離體接種法：紅蕓豆豆莢在接種J8-1.8菌株7 d后開始出現(xiàn)水漬狀病斑(圖2-C)，10 d后病斑擴(kuò)大，豆莢表面產(chǎn)生白色棉絮狀霉層(圖2-D)，對(duì)照未見發(fā)病(圖2-E)。

2.3 病原菌鑒定結(jié)果

2.3.1 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定 菌株J8-1.8在PDA培養(yǎng)基上菌落呈圓形，氣生菌絲發(fā)達(dá)，絨毛狀，初期白色，后變?yōu)榛野咨?，菌絲生長(zhǎng)速率為2.14 cm·d-1。培養(yǎng)7 d后在菌落邊緣形成鼠糞狀的黑色菌核，菌核表面粗糙，質(zhì)地堅(jiān)硬，直徑2.0～4.5 mm(圖3-A)。菌核經(jīng)黑暗保濕培養(yǎng)58 d后開始萌發(fā)，通常產(chǎn)生 1～3個(gè)表面光滑的子囊盤，子囊盤和菌核間由柄相連，柄褐色細(xì)長(zhǎng)，柄基部為黑色，長(zhǎng)為5.2～16.4 mm；子囊盤初期呈小杯狀，后期盤狀，直徑1.0～5.3 mm，中央稍凹陷，呈肉色至淺褐色(圖3-B、3-C)。將子囊盤切片后觀察，子囊圓柱形或梭形，大小為(120.0～140.5)μm×(9.2～11.6)μm，子囊內(nèi)含8個(gè)無(wú)色子囊孢子，單行排列，呈橢圓形，大小為(8.4～12.0) μm×(4.0～5.5)μm(圖3-D、3-E、3-F)。

A.菌落形態(tài)(9 d，正反面)；B、C.子囊盤；D.子囊盤縱切面；E.子囊；F.子囊孢子A.Colony morphology on PDA (9 d,back and front sides); B,C.Apothecium; D.Transverse longitudinal section of apothecium; E.Ascus; F.Ascospores圖3 紅蕓豆菌核病病原菌形態(tài)特征Fig.3 Morphological characteristics of pathogen causing Sclerotinia rot of red kidney beans

2.3.2 病原菌分子生物學(xué)鑒定 采用通用引物ITS1/ITS4對(duì)菌株J8-1.8的rDNA-ITS基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，得到512 bp的基因序列(登錄號(hào)MZ452605)，將該序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列進(jìn)行同源性比較分析，結(jié)果表明該菌株與核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum，登錄號(hào)KM272352)同源性為99.61%。采用比鄰法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，J8-1.8與核盤菌Sclerotiniasclerotiorum聚為一支(圖4)。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，確定紅蕓豆菌核病病原菌為核盤菌S.sclerotiorum。

圖4 基于rDNA-ITS序列構(gòu)建的菌株J8-1.8及其相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of J8-1.8 strain and related strains based on rDNA-ITS sequences

3 討論與結(jié)論

核盤菌屬下的種大多是植物病原菌，主要致病種有核盤菌S.sclerotiorum[8-9]、三葉草核盤菌S.trifoliorum[10]、小核盤菌S.minor[11]等。在傳統(tǒng)研究中，核盤菌屬的分類鑒定主要依據(jù)菌核和子囊孢子的形態(tài)特征[18]。核盤菌和小核盤菌可通過菌核大小區(qū)分，核盤菌產(chǎn)生的菌核明顯大于小核盤菌[19-20]。核盤菌與三葉草核盤菌可通過子囊孢子形態(tài)特征區(qū)分，三葉草核盤菌子囊孢子存在雙態(tài)性，一個(gè)子囊中有兩種大小不同的子囊孢子，而核盤菌子囊孢子不存在雙態(tài)性[21]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，rDNA-ITS基因序列因其在遺傳進(jìn)化中具有高度保守性而被廣泛應(yīng)用于真菌鑒定[22]。本試驗(yàn)通過對(duì)分離得到的紅蕓豆菌核病病原菌進(jìn)行形態(tài)特征觀察、致病性測(cè)定以及ITS序列分析，確定引起紅蕓豆菌核病的病原菌為核盤菌S.sclerotiorum。

在核盤菌生活史中，菌核作為病原菌度過不良環(huán)境的休眠結(jié)構(gòu)，在病害循環(huán)中起到重要的作用。核盤菌菌核萌發(fā)有兩種方式，一種是子囊盤型萌發(fā)，即菌核萌發(fā)形成子囊盤，釋放子囊孢子侵染植物[23]；另一種是菌絲型萌發(fā)，即菌核在適宜條件下萌發(fā)形成菌絲，通過傷口、氣孔等部位侵入寄主[24]。由核盤菌S.sclerotiorum引起的油菜菌核病、向日葵菌核病可通過兩種菌核萌發(fā)方式侵染植株，幼苗期主要通過菌核萌發(fā)產(chǎn)生菌絲體侵入植株根部、莖基部，花期菌核萌發(fā)形成子囊盤，子囊孢子隨氣流、雨水傳播并侵染油菜花瓣和向日葵花盤[4,25-26]。大豆菌核病主要以子囊孢子為初侵染源，田間濕度較大時(shí)，大豆莖基部發(fā)病處可產(chǎn)生白色菌絲體，成為再侵染源[8]。與核盤菌同屬的三葉核盤菌S.trifoliorum所引起的紫花苜蓿菌核病初侵染源為子囊孢子[27]。此外，由人參核盤菌S.ginseng引起的人參菌核病在自然環(huán)境及人工環(huán)境很難產(chǎn)生子囊盤，主要是由菌核產(chǎn)生的菌絲體為初侵染源[24]。小核盤菌S.minor主要是通過菌核進(jìn)行菌絲型萌發(fā)侵染寄主[28]。目前，尚未有研究報(bào)道過山西省紅蕓豆菌核病菌核的萌發(fā)類型及侵染特征，有待于進(jìn)一步研究。