梅華迪 李袁飛 田 琦 屈圣富 馬現(xiàn)永 李貞明 高鳳仙* 余 苗*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙410128；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)部華南動物營養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，畜禽育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省畜禽肉品質(zhì)量安全控制與評定工程技術(shù)研究中心，廣州510640)

在生豬養(yǎng)殖中，為提高養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益，常采用早期斷奶技術(shù)。然而，仔豬斷奶后，由于環(huán)境和飼糧的改變以及胃腸道發(fā)育不完全，容易造成斷奶應(yīng)激，從而導(dǎo)致仔豬生長發(fā)育緩慢、免疫力低下、腸道結(jié)構(gòu)和功能紊亂、腸道微生態(tài)失衡等現(xiàn)象發(fā)生，最終給養(yǎng)豬行業(yè)帶來巨大損失。定殖于動物腸道中的微生物數(shù)量龐大，且具有豐富的生物學(xué)活性，與宿主存在廣泛的互作，對機(jī)體營養(yǎng)物質(zhì)代謝和免疫穩(wěn)態(tài)有十分重要的作用[1]。動物前腸中未被機(jī)體消化的碳水化合物和蛋白質(zhì)，均可在后腸中作為微生物發(fā)酵的底物，其中碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生的短鏈脂肪酸對腸道具有益生功能，而蛋白質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)生的胺類、酚類和吲哚類等產(chǎn)物在高含量時對健康有害[2-3]。植物提取物，如黃酮、多酚和精油等，具有提高仔豬生長性能、促進(jìn)機(jī)體對蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收、調(diào)控腸道微生物區(qū)系、改善腸道發(fā)育、增強(qiáng)動物免疫力等功能[4]。因此，通過在飼糧中添加某些植物提取物可以提高動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收、調(diào)控腸道微生物的組成和改善微生物發(fā)酵模式，以達(dá)到維持腸道健康和調(diào)節(jié)機(jī)體營養(yǎng)物質(zhì)代謝的目的，最終實(shí)現(xiàn)生豬健康高效養(yǎng)殖。

槲皮素是一種廣泛存在于多種蔬菜和水果中的黃酮類化合物[5]。諸多研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素具有促進(jìn)動物生長、調(diào)節(jié)機(jī)體代謝和維持腸道微生態(tài)平衡的功能。Park等[6]研究證實(shí)，給生長豬飼喂含有1 000 mg/kg槲皮素的飼糧，可提高其平均日增重(average daily gain，ADG)以及干物質(zhì)和氮表觀消化率。在肉雞上的研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加250～1 000 mg/kg的槲皮素可線性和二次項增加其回腸中乳酸桿菌(Lactobacillus)的相對豐度[7]。在蛋雞飼糧中添加400和600 mg/kg槲皮素可提高其血清總蛋白含量，降低血清尿素氮含量[8]。腸道微生物與機(jī)體的消化、吸收、代謝、免疫等密切相關(guān)，而糞便微生物與腸道微生物的組成、相對豐度和功能相似，可在一定程度上反映腸道微生物的代謝和腸道健康[9-10]。然而，槲皮素在斷奶仔豬上的應(yīng)用相對缺乏，且對其糞便微生物及其代謝產(chǎn)物的研究也鮮有報道。因此，本試驗(yàn)旨在探究飼糧中添加不同水平槲皮素對斷奶仔豬生長性能、營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率、血清生化指標(biāo)、糞便微生物及其代謝產(chǎn)物的影響，以期為槲皮素的飼料開發(fā)和斷奶仔豬的綠色健康養(yǎng)殖提供科學(xué)依據(jù)和理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

槲皮素(純度≥98.5%)購自上海某生化科技股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)動物、設(shè)計與飼糧

試驗(yàn)采用單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計，試驗(yàn)選取144頭健康且體重[(7.45±0.09) kg]相近的21日齡“杜×長×大”三元雜交斷奶仔豬，根據(jù)體重相近原則，隨機(jī)分成3組，每組8個重復(fù)，每個重復(fù)6頭豬。3組分別飼喂基礎(chǔ)飼糧(對照組)、基礎(chǔ)飼糧+200 mg/kg槲皮素(Ⅰ組)和基礎(chǔ)飼糧+400 mg/kg槲皮素(Ⅱ組)。基礎(chǔ)飼糧參照NRC(2012)營養(yǎng)需要配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.3 飼養(yǎng)管理

仔豬分組后，飼養(yǎng)于溫控密閉豬舍內(nèi)1.2 m×2.1 m大小帶有漏風(fēng)地板的高保育床上，整個試驗(yàn)期24 d，其中預(yù)試期5 d，正試期19 d。試驗(yàn)期間，所有仔豬自由采食和飲水，按豬舍防疫標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行免疫、消毒和管理。

1.4 樣品采集

正式試驗(yàn)第16～18天，連續(xù)3 d采集各組飼糧和糞便樣品，飼糧以組為單位每次采集100 g；糞便以欄為單位，在每天晨飼前，使用棉簽刺激仔豬肛門排便，每欄(收集至少3頭豬)總共收集約200 g新鮮糞便，去除毛屑后混勻，立即測定其pH，然后置于-20 ℃冰箱保存，待測微生物及其代謝產(chǎn)物。

試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天，禁食4 h后，從每欄中選取體重接近平均體重的1頭豬(共3組，每組8頭豬，一共24頭)，采集10 mL前腔靜脈血，4 ℃冰箱中靜置30 min，然后于4 ℃、3 000 r/min條件下離心10 min得到血清，隨后分裝于-80 ℃冰箱保存待用。

1.5 指標(biāo)測定與方法

1.5.1 生長性能和腹瀉

正式試驗(yàn)期間，每天08:00開始投喂，以欄為單位，記錄每日飼喂量以及每日剩余飼料量，計算平均日采食量(average daily feed intake，ADFI)。在正式試驗(yàn)第1、19天以及試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天禁食4 h后對每欄的仔豬進(jìn)行空腹稱重，計算ADG、料重比(feed to gain ratio，F(xiàn)/G)。ADFI、ADG、F/G計算公式如下：

ADFI=每個重復(fù)正試期總采食量/(正試期
試驗(yàn)天數(shù)×該重復(fù)試驗(yàn)豬頭數(shù))；
ADG=(結(jié)束體重-初始體重)/(正試期試驗(yàn)
天數(shù)×該重復(fù)試驗(yàn)豬頭數(shù))；
F/G=ADFI/ADG。

每天09:00逐只觀察各重復(fù)仔豬的糞便狀況，同時結(jié)合精神狀態(tài)、肛門有無紅腫及水樣糞便痕跡等，記錄仔豬腹瀉頭數(shù)和腹瀉評分，腹瀉指數(shù)評分標(biāo)準(zhǔn)見表2[11]。腹瀉率和腹瀉指數(shù)計算公式如下：

腹瀉率(%)=[每重復(fù)腹瀉仔豬頭數(shù)/
(每重復(fù)仔豬頭數(shù)×天數(shù))]×100；
腹瀉指數(shù)=每重復(fù)仔豬腹瀉評分之和/
(每重復(fù)仔豬頭數(shù)×天數(shù))。

表2 腹瀉指數(shù)評分標(biāo)準(zhǔn)

1.5.2 營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率

飼糧和糞便中鹽酸不溶灰分含量的測定參照《飼料中鹽酸不溶灰分的測定》(GB/T 23742—2009)[12]。鈣、磷和干物質(zhì)含量和能量的測定參照《飼料分析與檢測》[13]。粗脂肪、粗蛋白質(zhì)、粗灰分含量和能量分別采用脂肪分析儀、全自動凱氏定氮儀測定、馬弗爐和能量儀進(jìn)行測定。營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率采用內(nèi)源性指示劑鹽酸不溶灰分標(biāo)記法，計算公式如下：

營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率(%)=[(飼糧中該營養(yǎng)
物質(zhì)含量/飼糧中鹽酸不溶灰分含量-糞便中
該營養(yǎng)物質(zhì)含量/糞便中鹽酸不溶灰分含量)/
(飼糧中該營養(yǎng)物質(zhì)含量/飼糧中
鹽酸不溶灰分含量)]×100。

1.5.3 血清生化指標(biāo)

血清生化指標(biāo)采用全自動生化分析儀(Selectra Pro XL，VITAL公司，荷蘭)測定，所用試劑盒購自中生北控生物科技股份有限公司。

1.5.4 糞便微生物數(shù)量

稱取0.18～0.22 g固體糞便于2 mL離心管，利用糞便DNA純化試劑盒(購自杭州新景生物制劑開發(fā)有限公司)分離總DNA，使用核酸蛋白檢測儀(Nanodrop 1100，Thermo Fisher Scientific公司，美國)測定DNA濃度和純度，標(biāo)準(zhǔn)為吸光度(OD)260/280：1.80～2.00，OD260/230：2.00左右。采用熒光定量PCR儀(CFX96 Real-time PCR System，Bio-Rad公司，美國)對糞便中的總菌、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、Lactobacillus、大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)、梭菌簇Ⅳ(Clostridiumcluster Ⅳ)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、普雷沃氏菌屬(Prevotella)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)的16S rRNA的拷貝數(shù)進(jìn)行定量分析，計算結(jié)果均表示為每克糞便中16S rRNA基因拷貝數(shù)的對數(shù)值。特異性引物由上海生工基因技術(shù)有限公司合成，引物序列、PCR反應(yīng)體系以及擴(kuò)增程序均參考Yu等[14]的方法。

1.5.5 糞便pH及其微生物代謝產(chǎn)物含量

每個新鮮糞便樣品混勻后采用pH計(HI 9024C，HANNA Instruments公司，美國)測定，每個樣品測定3次，取平均值；根據(jù)試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)說明書測定糞便中乳酸含量；參照Yu等[14]的方法，采用氣相色譜儀(7890B，Agilent Technologies Inc公司，美國)測定糞便中短鏈脂肪酸含量；參照Chaney等[15]的方法，采用比色法測定糞便中氨態(tài)氮含量；參照Yang等[16]的方法，采用高效液相色譜儀(e2695，Waters Alliance公司，美國)測定糞便中生物胺含量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，然后通過Tukey’s法進(jìn)行組間多重比較，數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，0.05

2 結(jié) 果

2.1 槲皮素對斷奶仔豬生長性能和腹瀉的影響

由表3可知，Ⅱ組的結(jié)束體重顯著高于對照組(P<0.05)，ADG極顯著高于對照組(P<0.01)；而Ⅰ組的結(jié)束體重和ADG與對照組和Ⅱ組均無顯著差異(P>0.05)。各組之間F/G、ADFI、腹瀉率和腹瀉指數(shù)均無顯著差異(P>0.05)。

表3 槲皮素對斷奶仔豬生長性能和腹瀉的影響

2.2 槲皮素對斷奶仔豬營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

由表4可知，Ⅰ組和Ⅱ組的干物質(zhì)表觀消化率顯著高于對照組(P<0.05)，鈣表觀消化率極顯著高于對照組(P<0.01)，總能表觀消化率有高于對照組的趨勢(P=0.088)。Ⅱ組的粗蛋白質(zhì)表觀消化率顯著高于對照組(P<0.05)，而Ⅰ組的粗蛋白質(zhì)表觀消化率與對照組和Ⅱ組均無顯著差異(P>0.05)。各組之間粗脂肪、總能、有機(jī)物和磷表觀消化率均無顯著差異(P>0.05)。

表4 槲皮素對斷奶仔豬營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

2.3 槲皮素對斷奶仔豬血清生化指標(biāo)的影響

由表5可知，Ⅰ組和Ⅱ組的血清總蛋白含量顯著高于對照組(P<0.05)，血清球蛋白有高于對照組的趨勢(P=0.052)。Ⅱ組的血清尿素氮含量極顯著低于對照組和Ⅰ組(P<0.01)。各組之間血清白蛋白、葡萄糖、總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白含量均無顯著差異(P>0.05)。

表5 槲皮素對斷奶仔豬血清生化指標(biāo)的影響

2.4 槲皮素對斷奶仔豬糞便微生物數(shù)量的影響

由圖1可知，Ⅰ組和Ⅱ組的糞便E.coli數(shù)量顯著或極顯著低于對照組(P<0.05或P<0.01)，糞便Lactobacillus(P=0.055)和Ruminococcus(P=0.086)數(shù)量有高于對照組的趨勢。Ⅱ組的糞便Prevotella和Bifidobacterium數(shù)量顯著高于對照組(P<0.05)。Ⅱ組的糞便Clostridiumcluster Ⅳ數(shù)量極顯著高于對照組和Ⅰ組(P<0.01)。各組之間糞便總菌、Firmicutes和Bacteroidetes數(shù)量均無顯著差異(P>0.05)。

*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。

2.5 槲皮素對斷奶仔豬糞便pH及乳酸、短鏈脂肪酸含量的影響

由表6可知，Ⅱ組的糞便乳酸含量顯著高于對照組(P<0.05)，乙酸含量極顯著高于對照組(P<0.01)，糞便異丁酸和支鏈脂肪酸含量顯著低于對照組(P<0.05)。Ⅱ組的糞便戊酸含量極顯著低于對照組和Ⅰ組(P<0.01)。Ⅰ組和Ⅱ組的糞便異戊酸含量有低于對照組的趨勢(P=0.052)。Ⅰ組的糞便乳酸、乙酸和支鏈脂肪酸含量與對照組和Ⅱ組均無顯著差異(P>0.05)。各組之間糞便pH及丙酸、丁酸、總短鏈脂肪酸含量均無顯著差異(P>0.05)。

表6 槲皮素對斷奶仔豬糞便pH及乳酸、短鏈脂肪酸含量的影響

2.6 槲皮素對斷奶仔豬糞便生物胺和氨態(tài)氮含量的影響

由表7可知，Ⅰ組和Ⅱ組的糞便腐胺、尸胺和總生物胺含量極顯著低于對照組(P<0.01)，糞便色胺(P=0.064)和亞精胺(P=0.052)含量有低于對照組的趨勢。各組之間糞便甲胺、酪胺、精胺和氨態(tài)氮含量均無顯著差異(P>0.05)。

表7 槲皮素對斷奶仔豬糞便生物胺和氨態(tài)氮含量的影響

2.7 斷奶仔豬糞便微生物及其代謝產(chǎn)物的PLS-DA

為了更加直觀顯示各組間糞便微生物與其代謝產(chǎn)物的差異，對相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行了PLS-DA。由圖2可知，PLS-DA模型能將各組之間微生物(圖2-A)和代謝產(chǎn)物(圖2-B)明顯區(qū)分開，表明飼糧中添加槲皮素改變了斷奶仔豬糞便微生物數(shù)量和代謝產(chǎn)物組成。

圖2 斷奶仔豬糞便微生物(A)及其代謝產(chǎn)物(B)PLS-DA得分圖

3 討 論

3.1 槲皮素對斷奶仔豬生長性能的影響

諸多研究發(fā)現(xiàn)槲皮素具有促進(jìn)動物生長的作用。飼糧中添加1 000 mg/kg槲皮素可提高生長豬的ADG[6]。飼糧中添加25 mg/kg的槲皮素4周后，可提高育肥豬的ADG[17]。在肉雞上的研究同樣發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加200、400和800 mg/kg槲皮素，肉雞的ADG分別提高了3.34%、3.22%和2.33%[18]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加400 mg/kg的槲皮素可顯著提高斷奶仔豬的ADG和結(jié)束體重。前人研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可促進(jìn)腸道微生態(tài)平衡[19]，促進(jìn)豬小腸細(xì)胞增殖、分化、更新并維護(hù)腸黏膜屏障的完整性[20]。另有研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素還可提高回腸中營養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2、肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1和脂肪酸合成酶)基因的表達(dá)，增加回腸抗氧化酶(谷胱甘肽過氧化酶和超氧化物歧化酶1)基因的表達(dá)，改善回腸絨毛高度、寬度及絨隱比[18]。因此，本試驗(yàn)中槲皮素促生長的原因一方面可能是通過促進(jìn)腸道微生態(tài)平衡，維持宿主腸道健康，讓宿主更好地吸收營養(yǎng)物質(zhì)；另一方面可能是通過促進(jìn)腸道發(fā)育，增加腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，同時提高腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和蛋白質(zhì)合成，最終提高斷奶仔豬生長性能。

斷奶仔豬飼糧為高蛋白質(zhì)飼糧，且胃腸道發(fā)育不成熟，腸道微生物區(qū)系平衡也尚未建立，會對飼糧中的蛋白質(zhì)產(chǎn)生消化障礙，未消化的蛋白質(zhì)進(jìn)入后腸被細(xì)菌降解成胺類等有害物質(zhì)，易造成仔豬營養(yǎng)性腹瀉[21]，進(jìn)而阻礙仔豬生長發(fā)育。本試驗(yàn)中，飼糧中添加400 mg/kg槲皮素可使仔豬腹瀉率和腹瀉指數(shù)分別降低33.56%和33.33%，而粗蛋白質(zhì)表觀消化率顯著提高。因此，槲皮素可能通過促進(jìn)仔豬對蛋白質(zhì)的消化利用，降低仔豬營養(yǎng)性腹瀉。此外，槲皮素在體內(nèi)外均具有較強(qiáng)的抑菌活性，可抑制有害細(xì)菌生物膜的形成，影響其生長繁殖和新陳代謝，最終抑制其增殖[22]。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)槲皮素的抗菌特性，即槲皮素通過選擇性促進(jìn)有益菌的增殖，同時抑制有害菌的增殖，進(jìn)而優(yōu)化腸道中的微生態(tài)環(huán)境，從而減少腹瀉的發(fā)生。

3.2 槲皮素對斷奶仔豬營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率是反映動物對飼糧中營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的重要指標(biāo)。前人研究表明，飼糧中添加一定劑量的槲皮素可增加畜禽動物對營養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化率。在蛋雞上的研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加400 mg/kg的槲皮素可顯著提高其粗蛋白質(zhì)和鈣表觀消化率[23]；在肉雞上的研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加200 mg/kg的槲皮素可顯著提高其粗蛋白質(zhì)表觀消化率[24]；在生長豬上的研究也發(fā)現(xiàn)，飼糧中添1 000 mg/kg的槲皮素可提高其干物質(zhì)和氮表觀消化率[6]。本研究中，飼糧中添加200和400 mg/kg的槲皮素可顯著提高斷奶仔豬鈣和干物質(zhì)表觀消化率，飼糧中添加400 mg/kg槲皮素還可顯著提高粗蛋白質(zhì)表觀消化率。動物對飼糧中營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收和利用效率越高，對其生長越有利。因此，這一研究結(jié)果正好解釋了本研究飼糧中添加400 mg/kg槲皮素可提高斷奶仔豬生長性能的結(jié)果。前人研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可增加豬腸道氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體、小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體和雷帕霉素靶蛋白信號通路相關(guān)基因的表達(dá)，改善豬小腸腸絨毛高度[25-26]。這一研究結(jié)果也正好解釋了飼糧中添加400 mg/kg槲皮素可提高斷奶仔豬粗蛋白質(zhì)表觀消化率的結(jié)果，即槲皮素一方面可能增加了腸道氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)；另一方面可能增加腸上皮接觸面積，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)的吸收與利用，最終改善了粗蛋白質(zhì)表觀消化率。

3.3 槲皮素對斷奶仔豬血清生化指標(biāo)的影響

血清生化指標(biāo)可在一定程度上反映機(jī)體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收情況。血清總蛋白、白蛋白和球蛋白含量可反映機(jī)體肝臟的代謝情況，血清總蛋白含量升高，說明機(jī)體合成蛋白質(zhì)的能力增強(qiáng)，而血清總蛋白由白蛋白和球蛋白組成，這可為機(jī)體進(jìn)一步合成體蛋白提供有利的內(nèi)環(huán)境，進(jìn)而促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和動物的生長[27-28]。研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加槲皮素可提高蛋雞血清總蛋白含量[8]。在肉雞中也同樣發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加槲皮素可提高血清總蛋白含量[29]。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加200和400 mg/kg的槲皮素均可顯著提高血清總蛋白含量，表明仔豬蛋白質(zhì)合成代謝增強(qiáng)。血清尿素氮是蛋白質(zhì)水解和氨基酸代謝的終產(chǎn)物之一，其含量可反映飼糧中蛋白質(zhì)的營養(yǎng)水平和體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝情況，血清尿素氮含量降低，則表明體內(nèi)蛋白質(zhì)合成和沉積增加，飼糧中蛋白質(zhì)的利用也增加[30]。本研究結(jié)果顯示，飼糧中添加400 mg/kg的槲皮素可顯著降低血清尿素氮含量，這與劉紅南等[8]在蛋雞和李賢等[29]在肉雞上的研究結(jié)果相似。這表明仔豬在攝取槲皮素之后，機(jī)體對蛋白質(zhì)和氨基酸的利用率得以提高。綜上所述，槲皮素提高血清總蛋白含量的原因可能是通過提高仔豬對飼糧中蛋白質(zhì)的消化和吸收，使更多的氨基酸進(jìn)入血液；同時機(jī)體蛋白質(zhì)的分解代謝降低。

總而言之，上述血清生化指標(biāo)的結(jié)果表明，飼糧中添加400 mg/kg的槲皮素可增加斷奶仔豬新陳代謝，并提高蛋白質(zhì)沉積，進(jìn)而促進(jìn)了斷奶仔豬的生長。

3.4 槲皮素對斷奶仔豬糞便微生物數(shù)量的影響

腸道菌群與宿主營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收和腸道健康緊密聯(lián)系。糞便微生物與腸道微生物組成、相對豐度和功能相似，可一定程度反映腸道微生物數(shù)量的變化[10]。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可顯著增加蛋雞和肉雞盲腸中Bifidobacterium數(shù)量，同時降低E.coli數(shù)量[24,31]。本研究結(jié)果表明，斷奶仔豬飼糧中添加400 mg/kg的槲皮素可促進(jìn)糞便中Clostridiumcluster Ⅳ、Prevotella、Bifidobacterium的增殖，抑制E.coli的增殖。同時，飼糧中添加槲皮素還有增加Lactobacillus和Ruminococcus數(shù)量的趨勢。Bifidobacterium和Lactobacillus是一種潛在益生菌，一方面通過產(chǎn)生乳酸和乙酸，對促進(jìn)抗炎和促炎細(xì)胞因子之間的平衡以及腸道健康有積極作用；另一方面它們還可產(chǎn)生抗菌因子，競爭性抑制致病菌的增殖，從而維護(hù)宿主腸道健康[32]。Prevotella、Ruminococcus和Clostridiumcluster Ⅳ是降解碳水化合物產(chǎn)生短鏈脂肪酸和調(diào)節(jié)免疫發(fā)育的關(guān)鍵菌群，通過分解這類物質(zhì)產(chǎn)生大量揮發(fā)性脂肪酸，從而促進(jìn)宿主腸黏膜免疫系統(tǒng)發(fā)育，最終對腸道產(chǎn)生生理保健作用[33-34]。E.coli是條件致病菌，是危害動物的主要致病菌之一，被認(rèn)為是誘導(dǎo)豬腹瀉的潛在致病菌[35]，與許多感染和疾病發(fā)生有關(guān)[36]。一個良好的腸道內(nèi)環(huán)境，不僅可以保持腸道健康，而且能讓宿主更好的吸收營養(yǎng)物質(zhì)，最終改善其生長性能。本試驗(yàn)中，產(chǎn)乳酸菌和產(chǎn)短鏈脂肪酸菌數(shù)量的增加，以及潛在致病菌數(shù)量的減少，表明槲皮素可通過促進(jìn)有益菌增殖、抑制潛在致病菌增殖來調(diào)控腸道微生物組成，維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，從而增加宿主對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。這一研究結(jié)果從腸道微生態(tài)方面進(jìn)一步解釋了本研究中的研究結(jié)果，即飼糧中添加400 mg/kg的槲皮素提高了斷奶仔豬的生長性能，降低了仔豬腹瀉率。

3.5 槲皮素對斷奶仔豬糞便中微生物發(fā)酵碳水化合物代謝產(chǎn)物的影響

前腸中未被降解的碳水化合物會由后腸微生物發(fā)酵產(chǎn)生乳酸和短鏈脂肪酸，而短鏈脂肪酸和乳酸有許多對機(jī)體健康有益的生理功能。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可提高人糞便中乙酸、丙酸、丁酸和總揮發(fā)性脂肪酸含量[37]。體外發(fā)酵試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，槲皮素可促進(jìn)培養(yǎng)基中乙酸、丙酸、丁酸和總揮發(fā)性脂肪酸含量的升高[38]。本研究也發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加400 mg/kg的槲皮素可顯著增加仔豬糞便中乳酸和乙酸含量，降低戊酸、異丁酸、異戊酸和支鏈脂肪酸含量。乳酸可減少E.coli定植；乙酸可被腸道吸收進(jìn)入血液，是外周組織能量來源之一；丁酸是腸上皮細(xì)胞的主要能量來源，可抑制腫瘤和炎癥發(fā)生[34]。支鏈氨基酸纈氨酸和亮氨酸可由微生物的脫氨作用生成支鏈脂肪酸，是蛋白質(zhì)發(fā)酵的重要指標(biāo)[39]。因此，本試驗(yàn)中碳水化合物代謝產(chǎn)物含量提高和含氮化合物代謝產(chǎn)物含量的降低，表明槲皮素改變了糞便微生物的發(fā)酵模式，使其偏向了碳水化合物發(fā)酵模式，這有利于腸道健康，同時為宿主生長提供了更多能量物質(zhì)，最終促進(jìn)斷奶仔豬的生長。

如前所述，飼糧中添加槲皮素增加了主要產(chǎn)乳酸菌Bifidobacterium和Lactobacillu的數(shù)量以及產(chǎn)短鏈脂肪酸菌Prevotella、Ruminococcus和Clostridiumcluster Ⅳ數(shù)量。在豬腸道中，乙酸和乳酸含量與這些菌的數(shù)量存在顯著正相關(guān)關(guān)系[40]。因此，本試驗(yàn)中糞便乳酸和乙酸含量上升可能和產(chǎn)乳酸菌數(shù)量和產(chǎn)短鏈脂肪酸菌數(shù)量增加有關(guān)。

3.6 槲皮素對斷奶仔豬糞便中微生物發(fā)酵含氮化合物代謝產(chǎn)物的影響

蛋白質(zhì)被動物攝入后，在胃腸道中經(jīng)過多種消化酶的作用，分解成小肽和氨基酸，一部分在小腸中被吸收，沿著肝門靜脈進(jìn)入肝臟，在肝臟內(nèi)進(jìn)行分解或合成蛋白質(zhì)，或隨血液分布到各個組織器官，合成各種特異性的組織蛋白質(zhì)；另一部分未被消化吸收的則進(jìn)入后腸，作為微生物發(fā)酵的底物而被分解代謝。由于小腸和大腸的生理功能以及內(nèi)環(huán)境不同，它們的代謝呈現(xiàn)區(qū)室化特征：小腸中微生物菌群和種類相對較少，主要進(jìn)行大分子營養(yǎng)物質(zhì)(如小肽和氨基酸)的消化吸收；大腸中微生物菌群龐大，且食糜在其中的停留時間較長，小腸內(nèi)未被消化的蛋白質(zhì)、小肽和氨基酸進(jìn)入大腸，主要被大腸內(nèi)微生物利用。生物胺主要由相應(yīng)氨基酸通過微生物的脫羧作用而形成的[41]。本研究中，飼糧中添加200和400 mg/kg的槲皮素均可顯著降低糞便總生物胺、腐胺和尸胺含量。尸胺和腐胺已被證明對機(jī)體產(chǎn)生不利影響，同時可能作為潛在的腫瘤標(biāo)志物[42]。因此，給斷奶仔豬補(bǔ)充槲皮素后，可減少總生物胺、腐胺和尸胺的產(chǎn)生，這可能是槲皮素改善腸道健康的原因之一。E.coli是一種能代謝含氮化合物產(chǎn)生生物胺的蛋白質(zhì)降解菌[39]。相關(guān)研究表明，糞便腐胺和尸胺含量與E.coli數(shù)量呈顯著正相關(guān)[43]。因此，本試驗(yàn)中，槲皮素降低腐胺和尸胺等含氮化合物含量的其中一個原因可能是抑制了E.coli的增殖。此外，本研究中，槲皮素顯著增加了飼糧中粗蛋白質(zhì)表觀消化率和提高血清總蛋白含量，表明其可能促進(jìn)了斷奶仔豬前腸對蛋白質(zhì)的消化吸收，進(jìn)而減少了氨基酸等含氮物質(zhì)到達(dá)后腸被微生物發(fā)酵產(chǎn)生生物胺等代謝產(chǎn)物的含量。

4 結(jié) 論

飼糧中添加400 mg/kg的槲皮素可提高斷奶仔豬ADG和結(jié)束體重，降低仔豬腹瀉；提高粗蛋白質(zhì)、鈣和干物質(zhì)表觀消化率；調(diào)節(jié)機(jī)體代謝，增加血清總蛋白含量，降低血清尿素氮含量；同時調(diào)控斷奶仔豬糞便微生物組成，促進(jìn)有益菌增殖，抑制潛在致病菌增殖；改變糞便中微生物發(fā)酵模式，增加微生物對碳水化合物的代謝，減少微生物對含氮化合物的代謝。綜上所述，斷奶仔豬飼糧中添加400 mg/kg的槲皮素對腸道乃至整個機(jī)體健康具有益生作用，從而提高生長性能。