王 音 郭文杰 郝文君 崔占鴻 劉書杰

(青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海省牦牛工程技術(shù)研究中心，青海省高原放牧家畜動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧810016)

反芻動物幼畜的飼養(yǎng)方式、飼糧營養(yǎng)水平和乳源生長因子都會影響其消化道的發(fā)育[1]，犢牛的早期培育又是牦牛養(yǎng)殖中重要的環(huán)節(jié)。研究表明，通過補(bǔ)飼有利于犢牛胃腸道消化功能的快速建立[2]，實(shí)現(xiàn)牦牛犢牛適時(shí)斷奶培育，有效促進(jìn)母牦牛早期發(fā)情和配種，進(jìn)而提高牦牛養(yǎng)殖的生產(chǎn)效益，加快草畜生產(chǎn)高質(zhì)量發(fā)展。營養(yǎng)豐富的開食料不僅易消化吸收，還能顯著提高犢牛的采食量，促進(jìn)其生長發(fā)育[3-5]。反芻動物通過瘤胃微生物將膳食纖維轉(zhuǎn)化為糖原以供微生物發(fā)酵并為機(jī)體細(xì)胞提供能量[6-7]，開食料中70%～85%的粗纖維和其他可消化物質(zhì)都能夠被反芻動物瘤胃消化利用[8]，因此在宿主的生長發(fā)育和免疫中，瘤胃微生物的群落結(jié)構(gòu)尤為重要[9-10]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，早期斷奶和補(bǔ)飼開食料有利于提高牦牛犢牛的生長性能和消化道發(fā)育[11]，但對哺乳期補(bǔ)飼開食料如何調(diào)控牦牛犢牛瘤胃發(fā)育的機(jī)制研究還不夠深入。因此，本研究利用16S擴(kuò)增子測序技術(shù)，在牦牛犢牛采食苜蓿干草的基礎(chǔ)上，進(jìn)行補(bǔ)飼開食料，探究早期補(bǔ)飼開食料對哺乳期牦牛犢牛生長性能、瘤胃形態(tài)及功能發(fā)育的影響，為牦牛犢牛斷奶后的代乳培育技術(shù)研究提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)于2020年7月至11月在青海省海北藏族自治州海晏縣開展，試驗(yàn)采用單因素設(shè)計(jì)，選取體重相近、體況良好的20頭30日齡牦牛公犢牛作為試驗(yàn)對象，單欄飼養(yǎng)，并飼喂一定比例的代乳粉(代乳粉∶溫水=1∶5)。經(jīng)過1周適應(yīng)期后隨機(jī)分為對照組(RA組)和試驗(yàn)組(RAS組)，每組各10頭。在飼喂代乳粉的基礎(chǔ)上，RA組飼喂苜蓿干草(代乳粉+苜蓿草)，RAS組按照苜蓿干草∶開食料=1∶1的模式進(jìn)行飼喂(代乳粉+苜蓿草+開食料)，自由飲水。開食料組成及營養(yǎng)水平見表1。代乳粉、苜蓿干草營養(yǎng)水平見表2。試驗(yàn)期間定期對圈舍進(jìn)行消毒和清潔工作。預(yù)試期14 d，正試期120 d。試驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)選取5頭進(jìn)行屠宰取樣。

表1 開食料組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

續(xù)表1項(xiàng)目 Items含量 Content粗脂肪 EE/%4.70中性洗滌纖維 NDF/%10.90酸性洗滌纖維 ADF/% 4.10鈣 Ca/%0.80磷 P/%0.45鈣/磷 Ca/P1.78

1.2 樣品采集與預(yù)處理

犢牛屠宰后，取瘤胃內(nèi)容物經(jīng)4層紗布過濾，采集瘤胃液立即測定pH。另采集約50 mL瘤胃液分裝后經(jīng)液氮運(yùn)輸回實(shí)驗(yàn)室保存，用于DNA的提取和后續(xù)分析以及揮發(fā)性脂肪酸(VFA)、氨態(tài)氮(NH3-N)濃度和微生物蛋白(MCP)含量的測定。取大小為2 cm×2 cm的瘤胃組織保存于4%多聚甲醛溶液中，用于固定組織和石蠟切片的制作。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 干物質(zhì)采食量、體重增重

試驗(yàn)期間，每日稱量并飼喂草和料，記錄投喂量，第2天飼喂前分別清理剩料并記錄稱重。試驗(yàn)開始和結(jié)束前，早晨對犢牛進(jìn)行稱量空腹體重。試驗(yàn)結(jié)束后計(jì)算犢牛干物質(zhì)采食量(DMI)、平均日增重(ADG)和料重比。

1.3.2 瘤胃發(fā)酵參數(shù)

瘤胃液樣品在測定當(dāng)天進(jìn)行解凍并離心，離心后取上清液，待測樣品放在4 ℃冰箱內(nèi)保存。瘤胃液pH使用UB-7型(梅特勒-托利多，美國)酸度計(jì)進(jìn)行測定。瘤胃NH3-N濃度采用馮宗慈等[12]改進(jìn)的比色法進(jìn)行測定。MCP含量采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒進(jìn)行測定。使用島津GC-2014氣相色譜儀測定瘤胃液VFA的濃度[13]，氣相色譜的條件如下：載氣為N2，分流比40∶1，進(jìn)樣量為1 μL，進(jìn)樣孔溫度、輔助箱溫度和氣化室溫度均為250 ℃；FID檢測器溫度：250 ℃。恒流模式下的流量為2.1 mL/min，平均線速度38 cm/s，柱壓11.3 psi(0.1 MPa)，柱溫箱設(shè)定為程序升溫，90 ℃下1 min，120 ℃下1 min，150 ℃下運(yùn)行3 min。

1.3.3 瘤胃組織形態(tài)觀察

在操作臺上將瘤胃組織從固定液中取出，用刀片對組織進(jìn)行修整后放入脫水盒內(nèi)并編號，經(jīng)梯度酒精脫水、浸蠟，浸蠟后的組織置于包埋機(jī)內(nèi)進(jìn)行包埋，蠟塊修整后進(jìn)行切片、展片、烤片。染色采用蘇木精-伊紅染色法。切片在Olympus BX53電子顯微鏡下觀察，進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。

1.3.4 瘤胃微生物區(qū)系檢測

將5 mL的瘤胃液樣品經(jīng)干冰運(yùn)輸至北京諾和致源生物技術(shù)公司的Illumina MiSeq平臺上對細(xì)菌擴(kuò)增子進(jìn)行測序，引物序列341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)和806R(5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)。文庫構(gòu)建使用的是TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2016對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)獨(dú)立性方差齊性檢驗(yàn)，采用one-way ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 補(bǔ)飼開食料對牦牛犢牛生長性能的影響

由表3可知，補(bǔ)飼開食料后，RAS組犢牛在試驗(yàn)期末體重極顯著高于RA組(P<0.01)，RA組和RAS組分別增重39.62和45.70 kg。RA組干物質(zhì)采食量為678.71 g/d，顯著低于RAS組(P<0.05)。

表3 補(bǔ)飼開食料對牦牛犢牛干物質(zhì)采食量和增重的影響

2.2 補(bǔ)飼開食料對牦牛犢牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

由表4可知，RAS組犢牛早期采食開食料后，瘤胃NH3-N濃度極顯著提高了33.74%(P<0.01)，RAS組瘤胃MCP含量顯著提高了31.30%(P<0.05)；RA組犢牛瘤胃液乙酸濃度顯著高于RAS組(P<0.05)；RAS組戊酸濃度顯著高于RA組(P<0.05)。

表4 補(bǔ)飼開食料對牦牛犢牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

2.3 補(bǔ)飼開食料對牦牛犢牛瘤胃上皮形態(tài)發(fā)育的影響

瘤胃組織發(fā)育形態(tài)觀察如圖1所示，RAS組犢牛瘤胃顏色加深，乳頭分布密集。圖2為瘤胃上皮組織切片在倒置電子顯微鏡下成像圖。統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表5所示，RAS組犢牛瘤胃乳頭的長度極顯著高于RA組(P<0.01)，瘤胃乳頭寬度和肌肉層厚度組間無顯著差異(P>0.05)。

表5 補(bǔ)飼開食料對牦牛犢牛瘤胃上皮形態(tài)發(fā)育的影響

圖1 牦牛犢牛瘤胃上皮外觀形態(tài)觀察

圖2 牦牛犢牛瘤胃上皮組織切片

2.4 補(bǔ)飼開食料對牦牛犢牛瘤胃微生物區(qū)系的影響

2.4.1 瘤胃微生物群落操作分類單元(OTU)聚類和Alpha多樣性分析

根據(jù)16S rRNA基因測序所得數(shù)據(jù)，繪制出的犢牛瘤胃液微生物樣本的稀釋曲線如圖3，稀疏曲線具有97%的相似度，說明樣品有足夠的測序覆蓋率，能夠代表每個(gè)樣本中大多數(shù)微生物信息。

A組包括犢牛樣本：A1、A2、A3、A4、A5；RAS組包括犢牛樣本：a1、a2、a3、a4、a5。

本試驗(yàn)從10頭犢牛瘤胃液中獲得925 748條有效序列，在3%的距離上，10個(gè)樣本共獲得1 591個(gè)OTU，平均每個(gè)樣本有502.90個(gè)OTU，所有樣本共有的OTU數(shù)目為402個(gè)。由表6可知，樣本的覆蓋率達(dá)到99%以上，說明測序深度足夠。其中，RA組的OTU數(shù)目顯著高于RAS組(P<0.05)，而2組的ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)均無顯著差異(P>0.05)。

表6 牦牛犢牛瘤胃微生物OTU數(shù)目和Alpha多樣性指數(shù)分析

2.4.2 補(bǔ)飼開食料對牦牛犢牛瘤胃微生物相對豐度的影響

分析瘤胃液菌群在門水平的組成比例及變化，共檢測到69個(gè)菌門。由表7可知，在門水平上，RA組和RAS組的優(yōu)勢菌群一致，但相對豐度不同。其中，RA組擬桿菌門相對豐度極顯著高于RAS組(P<0.01)；RAS組變形菌門相對豐度極顯著高于RA組(P<0.01)。

表7 補(bǔ)飼開食料對牦牛犢牛瘤胃微生物優(yōu)勢菌門相對豐度的影響

續(xù)表7項(xiàng)目Items組別 GroupsRARASSEMP值P-value變形菌門 Proteobacteria0.67B3.83A0.060.001疣微菌門 Verrucomicrobiota0.650.380.090.144放線菌門 Actinobacteriota0.370.290.040.371互養(yǎng)菌門 Synergistota0.390.430.060.722綠彎菌門 Chloroflexi0.200.130.230.086

分析RA組和RAS組瘤胃微生物在屬水平的組成和變化，共計(jì)檢測到519個(gè)菌屬。根據(jù)表8可知，RAS組甲烷短桿菌屬和瘤胃球菌屬相對豐度顯著高于RA組(P<0.05)，RA組奎因氏菌屬相對豐度極顯著高于RAS組(P<0.01)。

表8 補(bǔ)飼開食料對牦牛犢牛瘤胃微生物優(yōu)勢菌屬相對豐度的影響

3 討 論

3.1 補(bǔ)飼開食料對牦牛犢牛生長性能的影響

在高原地區(qū)，營養(yǎng)的匱乏和惡劣的環(huán)境嚴(yán)重影響了牦牛犢牛的成活率。隨著技術(shù)的進(jìn)步，科學(xué)的補(bǔ)飼開食料不僅能夠提高母畜的繁殖率，還能改善天然牧草的載畜量，促進(jìn)畜牧業(yè)健康持久地發(fā)展[14]。對放牧牦牛進(jìn)行補(bǔ)飼開食料能夠促進(jìn)其生長性能，提高經(jīng)濟(jì)效益[15]，但如何提高放牧牦牛犢牛的生長性能以及如何科學(xué)補(bǔ)飼的機(jī)制亟待完善，因此，本試驗(yàn)開展對哺乳期牦牛犢牛補(bǔ)飼開食料的深入探究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)飼開食料后，犢牛增重達(dá)到45.7 kg，極顯著提高了犢牛的體重，這與完瑪措[16]和黃文植等[17]冷季對牦牛犢牛補(bǔ)飼提高增重的結(jié)果一致。斷奶前后犢牛采食顆粒飼料可以提高犢牛的干物質(zhì)消化率，提高生產(chǎn)性能[18]。有研究顯示，代乳+補(bǔ)飼培育方式能顯著提高牦牛犢牛的干物質(zhì)采食量，有助于犢牛增重[19]，本研究結(jié)果與之相同。在飼養(yǎng)管理和環(huán)境條件一致的情況下，RA組犢牛體重較低可能是由于采食營養(yǎng)單一的苜蓿干草，且苜蓿干草纖維水平較高，適口性差，進(jìn)而影響了其生長發(fā)育。

3.2 補(bǔ)飼開食料對牦牛犢牛瘤胃發(fā)育和發(fā)酵參數(shù)的影響

犢牛出生時(shí)瘤胃發(fā)育遲緩，其生長發(fā)育主要依靠皺胃和腸道的消化吸收。隨著日齡的增長和固體飼糧的采食，瘤胃內(nèi)微生物發(fā)酵產(chǎn)生的VFA刺激瘤胃迅速發(fā)育，消化系統(tǒng)也逐步建立免疫代謝功能[20-22]。研究發(fā)現(xiàn)，采用代乳粉和開食料的培育方式能夠緩解斷奶應(yīng)激并提高瘤胃發(fā)育水平[23]。本試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，采食開食料刺激了犢牛瘤胃的組織形態(tài)發(fā)育，RAS組瘤胃乳頭長度顯著增加，這與Xie等[24]對荷斯坦?fàn)倥Ｑa(bǔ)飼開食料的研究結(jié)果相似。

在早期培育方式的影響下，苜蓿干草和開食料均能夠改變反芻動物消化道的健康和免疫[25-26]。瘤胃作為反芻動物體內(nèi)的發(fā)酵罐，其發(fā)酵產(chǎn)生的VFA直接刺激著瘤胃上皮的發(fā)育進(jìn)程[27]。瘤胃pH是反映瘤胃是否健康發(fā)酵的綜合指標(biāo)，本試驗(yàn)的瘤胃液pH在7.23～7.47，在瘤胃健康發(fā)酵的范圍內(nèi)[28]。NH3-N濃度和MCP含量是反映反芻動物瘤胃的發(fā)酵狀態(tài)，NH3-N濃度在瘤胃中處于動態(tài)平衡，為反芻動物合成MCP提供原料，是檢測瘤胃微生物活性的指標(biāo)[29]。此外，微生物對NH3-N的利用主要受飼糧中非纖維性碳水化合物的影響，隨著飼糧中非纖維性碳水化合物含量的增加，瘤胃微生物會提高對NH3-N利用[30]，本研究中RA組犢牛瘤胃內(nèi)NH3-N濃度顯著較低，這與Agle等[31]研究發(fā)現(xiàn)，高比例粗飼料飼糧會降低奶牛瘤胃中NH3-N濃度的結(jié)果相同，說明瘤胃微生物對NH3-N的利用會隨著飼糧中結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量的增加而降低。RAS組MCP的含量顯著高于RA組，MCP是瘤胃微生物氮的主要來源，說明了補(bǔ)飼開食料滿足了微生物對飼糧降解的蛋白質(zhì)需求[32]。

反芻動物利用瘤胃微生物將飼料中的纖維素降解并轉(zhuǎn)化為VFA，為機(jī)體提供70%～80%的能量需求[33]。乙酸在動物體內(nèi)經(jīng)過一系列變化進(jìn)入三羧酸循環(huán)，也可以合成脂肪或與丁酸相互轉(zhuǎn)化產(chǎn)生酮體，促進(jìn)動物對脂肪的囤積[34]。劉敏雄[35]報(bào)道，當(dāng)粗飼料水平升高時(shí)，纖維素分解菌占優(yōu)勢，乙酸濃度上升。本試驗(yàn)中RA組犢牛僅采食苜蓿干草，中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維水平較高，導(dǎo)致了瘤胃乙酸濃度顯著升高，這與王文奇等[36]提高飼糧中酸性洗滌纖維水平，發(fā)現(xiàn)乙酸濃度升高的結(jié)果一致。目前關(guān)于牦牛犢牛的培育工作正在初期探索進(jìn)程中，先前研究報(bào)道采用代乳粉飼喂后，150日齡犢牛瘤胃內(nèi)乙酸濃度顯著升高[37]，本研究結(jié)果與之不同，可能是由于海拔、飼糧結(jié)構(gòu)和飼養(yǎng)模式的差異所導(dǎo)致的。

3.3 補(bǔ)飼開食料對牦牛犢牛瘤胃微生物區(qū)系的影響

飼糧的構(gòu)成影響著瘤胃微生物區(qū)系的建立，進(jìn)而作用于瘤胃的形態(tài)和功能。Ben等[38]和Abecia等[39]發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加單寧或甲烷抑制劑等均會改變瘤胃微生物組成，影響反芻動物的生長性能和健康發(fā)育。同時(shí)，瘤胃微生物的豐度又作用于宿主對飼糧的利用效率[40]。飼糧中高水平的非纖維性碳水化合物能降低犢牛瘤胃微生物的種類和豐富度，當(dāng)飼糧中性洗滌纖維水平低于20%時(shí)，瘤胃中細(xì)菌的相對豐度有所下降[41]。本研究中，開食料中酸性洗滌纖維水平為4.10%，因此補(bǔ)飼開食料后犢牛瘤胃內(nèi)OTU數(shù)目顯著降低，這與楊碩等[42]在絨山羊上的研究結(jié)果相近。這表明盡管開食料為犢牛瘤胃微生物的定植提供充足的碳源和氮源[43]，但一定程度上抑制了微生物群落的豐度。本試驗(yàn)中2組犢牛的優(yōu)勢菌門均為擬桿菌門和厚壁菌門，這與前人的研究結(jié)果[44-45]一致。Sander等[21]的研究表明，不同日齡犢牛瘤胃微生物菌群在門水平上有顯著差異，本研究中犢牛采食開食料后擬桿菌門的相對豐度極顯著下降，厚壁菌門的相對豐度沒有顯著性變化，說明開食料抑制了擬桿菌門的生長與增殖。變形菌門能夠降解可溶性碳水化合物含量[46]，犢牛所采食的開食料中粗蛋白質(zhì)與粗脂肪水平較高，中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維水平較低，且補(bǔ)飼開食料后犢牛瘤胃中變形菌門的相對豐度極顯著升高，因此推測變形菌門的相對豐度隨著飼糧中蛋白質(zhì)水平的升高而增加，并且與飼糧中纖維水平呈負(fù)相關(guān)。

瘤胃微生物間相互作用，將纖維素等不易降解的物質(zhì)轉(zhuǎn)化為VFA，進(jìn)一步作用于宿主的生長和維持[47]。營養(yǎng)水平的提高導(dǎo)致了微生物門水平細(xì)菌相對豐度的差異，進(jìn)而影響了營養(yǎng)物質(zhì)的利用，在屬水平上，RAS組甲烷短桿菌屬的相對豐度顯著升高，甲烷桿菌屬能夠利用氫氣還原甲醇，在瘤胃中，甲醇是原蟲水解果膠和細(xì)菌酯酶活性的產(chǎn)物，這意味著補(bǔ)飼開食料后牦牛犢牛瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生了更多的氫氣，對碳水化合物的消耗增加，也為機(jī)體提供了更多的能量[48]。厚壁菌門中的瘤胃球菌屬被Flint等[49]和Kabel等[50]認(rèn)為在蛋白質(zhì)、果膠等非纖維素植物多糖的降解等方面發(fā)揮著重要的作用，RAS組瘤胃球菌屬的相對豐度顯著升高進(jìn)一步說明了開食料積極調(diào)控著瘤胃微生物的相對豐度。

4 結(jié) 論

本研究表明，哺乳期補(bǔ)飼開食料能夠顯著提高牦牛犢牛的干物質(zhì)采食量和體重，改變瘤胃微生物群落的多樣性和豐富度，正向調(diào)控了瘤胃形態(tài)功能發(fā)育，為青藏高原地區(qū)牦牛犢牛健康高質(zhì)量培育提供了重要理論依據(jù)。