響應(yīng)面法優(yōu)化超聲溶劑法提取甜菊糖苷工藝

陳虎 *，侯麗娟 ，路付勇，李貴禎

1.河北省天然色素工程技術(shù)研究中心（邯鄲 057250）；2.晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司（邯鄲 057250）

甜菊糖學(xué)名甜菊糖苷（stevioside），也稱甜菊苷，是從菊科植物甜菊（又稱甜葉菊）的葉片中提取的食品添加劑，是唯一一種高甜度、純天然甜味劑，具有安全、低熱值和保健作用等優(yōu)勢，應(yīng)用領(lǐng)域越來越廣，發(fā)展前景十分廣闊，甜菊糖甜度約為蔗糖的300倍[1-4]，且甜味接近蔗糖，產(chǎn)生的熱量遠(yuǎn)低于蔗糖[5]。

國內(nèi)外提取甜菊糖苷的工藝主要采用熱水浸泡法[8-9]，該法簡單易行，提取成本較低，因此一直以來被廣泛使用。此外，還有水提法、酶法等[10]，但是由于這些傳統(tǒng)提取法存在提取時(shí)間長、溶劑用量大、原料利用率低等缺點(diǎn)，因此，不少學(xué)者對甜菊糖苷的提取進(jìn)行多方面探索，越來越多新的工藝技術(shù)被引進(jìn)，如超聲波提取技術(shù)、超臨界提取技術(shù)、微波提取技術(shù)、超高壓提取技術(shù)等。近年來，利用超聲波提取植物中的多糖備受關(guān)注[6-7]。試驗(yàn)采用超聲波輔助溶劑法，通過響應(yīng)面法優(yōu)化工藝參數(shù)，旨在探索甜菊糖苷的提取方法，確定合適的提取工藝，為甜菊糖苷的快速有效提取提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甜葉菊干葉（晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司）；乙腈（色譜純）；磷酸二氫鈉（色譜純）；磷酸（色譜純）；水（GB/T 6682—2008中規(guī)定的一級水）；正丁醇（分析純）；甜菊糖苷標(biāo)準(zhǔn)品：瑞鮑迪苷A含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以干基計(jì)量≥99.0%）。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260液相色譜儀（安捷倫科技公司）；R213B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海申生科技有限公司）；SHB-3循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；DK-S24電熱恒溫水浴鍋（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；AUY120電子天平（日本島津）；TH-200BQ數(shù)控超聲波清洗機(jī)（濟(jì)寧天華超聲電子儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 試驗(yàn)方法

甜葉菊干葉→粉碎→過篩→乙醇溶液預(yù)浸泡→超聲提取→過濾→濃縮→加入7#溶劑→靜置→離心沉淀→重相濃縮→加水稀釋→甜菊糖萃取液

稱取50 g甜葉菊干葉粉碎過0.180 mm（80目）篩子，透過篩孔的粉末放入燒杯中，加入80%甲醇溶液進(jìn)行預(yù)浸泡，浸泡2 h后進(jìn)行超聲提取，設(shè)置超聲功率90%，連續(xù)萃取3次，合并每次萃取液，檢測甜菊糖苷含量。

1.3.2 檢測方法

萃取液中甜菊糖苷含量的測定，參考GB 8270—2014。

1.3.2.1 色譜條件

色譜柱，C18反相色譜柱，250 mm×4.6 mm，粒徑5 μm，或其他等效的色譜柱；流動(dòng)相，乙腈和磷酸鈉緩沖液體積比32∶68；流動(dòng)相流速1.0 mL/min；檢測波長210 nm；進(jìn)樣量10 μL；柱溫40 ℃。

1.3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

乙腈水溶液：乙腈和水體積比30∶70；磷酸鈉緩沖液（pH 2.6）：稱取1.20 g磷酸二氫鈉（NaH2PO4），溶于800 mL水中，用磷酸調(diào)節(jié)至pH 2.6，用水稀釋至1 000 mL。

分別稱取0.030，0.040，0.050，0.060和0.070 g瑞鮑迪苷A（甜菊糖苷）標(biāo)準(zhǔn)品，于105 ℃干燥2 h，分別置于25 mL容量瓶中，用乙腈水溶液溶解后稀釋至刻度，得到RA標(biāo)準(zhǔn)溶液。Y=3 175 152.36X+235.99，R2=0.999 5。

1.3.2.3 產(chǎn)品測定

將甜菊糖苷樣品在105 ℃下干燥2 h后稱取約0.04 g，置于25 mL容量瓶中，用乙腈水溶液溶解后稀釋至刻度，得到試樣溶液。經(jīng)0.45 μm微孔過濾后進(jìn)樣。

1.3.3 甜葉菊糖苷萃取得率計(jì)算

式中：甜菊糖含量是指上述方法檢測值；10%是指甜葉菊干葉中甜菊糖苷含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 超聲提取次數(shù)對甜菊糖萃取得率的影響

確定萃取溫度50 ℃、超聲萃取時(shí)間40 min、料液比1∶6（g/mL），觀察不同超聲提取次數(shù)對甜菊糖萃取得率的影響，試驗(yàn)數(shù)據(jù)見圖1。

圖1 超聲提取次數(shù)對甜菊糖萃取得率的影響

由圖1可知，甜菊糖萃取得率隨著超聲提取次數(shù)增加而提高，超聲提取次數(shù)從1次增加到2次時(shí)，甜菊糖提取得率明顯上升，從2次增加到3次時(shí)，甜菊糖萃取得率趨于平緩，所以從經(jīng)濟(jì)合理性考慮，最佳超聲提取次數(shù)為2次。

2.1.2 超聲提取時(shí)間對甜菊糖萃取得率的影響

確定超聲萃取次數(shù)2次、萃取溫度50 ℃、料液比1∶6（g/mL），觀察不同超聲萃取時(shí)間對甜菊糖萃取得率的影響，試驗(yàn)數(shù)據(jù)見圖2。

由圖2可知，20～35 min時(shí)，甜菊糖萃取得率隨著超聲提取時(shí)間增加而明顯提高，35 min之后，隨著超聲提取時(shí)間增加，甜菊糖萃取得率下降。導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因可能是：在20～35 min這段時(shí)間里，隨著超聲時(shí)間增加，甜葉菊細(xì)胞膜的破碎度逐漸增大，溶出物的含量也隨之增多，甜菊糖苷含量增加；隨著時(shí)間的進(jìn)一步增加，溶解度達(dá)到飽和時(shí)，有效成分不再被溶解，得率不再有明顯提高；超聲時(shí)間繼續(xù)延長，雜質(zhì)的含量相應(yīng)增多，有效成分的溶解量隨之減少，即甜菊糖萃取得率下降。因此，最佳超聲提取時(shí)間為35 min。

圖2 超聲萃取時(shí)間對甜菊糖萃取得率的影響

2.1.3 超聲提取溫度對甜菊糖萃取得率的影響

確定超聲萃取次數(shù)2次、萃取時(shí)間35 min、料液比1∶6（g/mL），觀察不同超聲提取溫度對甜菊糖萃取得率的影響，試驗(yàn)數(shù)據(jù)見圖3。

圖3 超聲提取溫度對甜菊糖萃取得率的影響

由圖3可知，提取溫度低于50 ℃時(shí)，甜菊糖萃取得率隨著溫度升高而大幅提高，這可能是溫度較低時(shí)，一部分胞壁結(jié)構(gòu)未受到根本性破壞，而僅發(fā)生變形和裂紋，而隨著溫度的提高，熱效應(yīng)使分子的運(yùn)動(dòng)加速，進(jìn)一步破壞了胞壁結(jié)構(gòu)，從而使甜葉菊中水溶性糖苷得到更充分的釋放，溫度超過50 ℃后，甜菊糖萃取得率呈現(xiàn)下降趨勢。分析原因，可能是溫度高于50 ℃后，在高溫和超聲波的協(xié)同作用下，部分甜菊糖苷分解，導(dǎo)致甜菊糖萃取得率下降。所以，最佳超聲提取溫度為50 ℃。

2.1.4 料液比對甜菊糖萃取得率的影響

確定超聲萃取次數(shù)2次、萃取時(shí)間35 min、萃取溫度50 ℃，考察不同料液比對甜菊糖萃取得率的影響，試驗(yàn)數(shù)據(jù)見圖4。

由圖4可知，料液比1∶3～1∶5（g/mL）時(shí)，甜菊糖萃取得率隨著液體比例增加而逐漸提高，料液比1∶5（g/mL）時(shí)出現(xiàn)最大值。這是因?yàn)殡S著液體比例增大，萃取液中甜菊糖苷以及雜質(zhì)含量同時(shí)增加，但料液比達(dá)到一定值后，雜質(zhì)的提取效率將明顯影響提取物中甜菊糖苷含量，因而最佳料液比為1∶5（g/mL）。

圖4 料液比對甜菊糖提取率的影響

2.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)

2.2.1 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，選取對甜菊糖萃取得率影響較大的因素，即超聲提取時(shí)間、超聲提取溫度、料液比，采用三因素三水平Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1，響應(yīng)面分析方案見表2，回歸方程各項(xiàng)的方差分析見表3。

表1 試驗(yàn)因素水平表

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)模型進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，以A、B、C為自變量，以甜菊糖萃取得率為響應(yīng)值Y，結(jié)果如表2所示。擬合得到的回歸方程為Y=92.12+2.40A+3.74B+0.99C+0.33AB+1.27AC+1.05BC-2.21A2-5.13B2-3.69C2。

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)值

從表3可以看出，模型的顯著水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于0.001，說明回歸方差模型高度顯著，而且失擬誤差不顯著，表明該模型不存在失擬因素。從表3可以看出，超聲提取時(shí)間、超聲提取溫度、料液比對甜菊糖均有高度顯著性影響（p＜0.001），其中超聲提取溫度影響最顯著，其次為超聲提取時(shí)間和料液比。

表3 方差分析表

2.2.2 等高線圖和響應(yīng)面圖分析

響應(yīng)面3D分析圖如圖5～圖7所示，直觀反映各因素交互作用對響應(yīng)值的影響?？梢钥闯?，超聲萃取時(shí)間與超聲萃取溫度對甜菊糖萃取得率的交互作用不顯著，超聲萃取溫度與料液比交互作用影響明顯。由圖5和圖6可知，料液比和超聲萃取溫度一定時(shí)，甜菊糖萃取得率隨超聲時(shí)間增加先增加后減少。由圖5和圖7可知，固定料液比和超聲時(shí)間，甜菊糖萃取得率隨超聲溫度升高先增加后減少，結(jié)果與單因素試驗(yàn)結(jié)果一致。

圖5 萃取時(shí)間與萃取溫度對甜菊糖萃取得率的影響

圖6 萃取時(shí)間與料液比對甜菊糖萃取得率的影響

圖7 提取溫度與料液比對甜菊糖萃取得率的影響

回歸模型預(yù)測的甜菊糖苷萃取的最佳條件為原料預(yù)浸泡2 h，超聲功率90%，超聲萃取2次，每次超聲萃取時(shí)間35.84 min，超聲萃取溫度49.72 ℃，料液比1∶5（g/mL）。此條件下得到的甜菊糖萃取得率理論上可達(dá)94.82%。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

為檢驗(yàn)響應(yīng)面分析法的準(zhǔn)確性，采取上述最優(yōu)萃取條件對甜菊糖苷的提取進(jìn)行驗(yàn)證，考慮到在實(shí)際操作中的局限，將甜菊糖苷萃取工藝參數(shù)調(diào)整為原料預(yù)浸泡2 h，超聲功率90%，超聲萃取2次，每次超聲萃取時(shí)間35 min，超聲萃取溫度50 ℃，料液比1∶5（g/mL）。在此條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，結(jié)果如表4所示。以擬定的條件重復(fù)試驗(yàn)3次，甜菊糖萃取得率平均值為95.05%，與預(yù)測值基本吻合，說明優(yōu)化試驗(yàn)方案可行。

表4 試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

采用超聲萃取法萃取甜菊糖，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上選取試驗(yàn)因素與水平，根據(jù)中心組合（Box-Behnken）試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法，得到甜菊糖最佳萃取條件：原料預(yù)浸泡2 h，超聲功率90%，超聲萃取2次，每次超聲萃取時(shí)間35 min，超聲萃取溫度50 ℃，料液比1∶5（g/mL）。甜菊糖萃取得率可達(dá)95.05%。此次試驗(yàn)結(jié)果對甜菊糖萃取的進(jìn)一步研究提供參考，具有一定實(shí)際應(yīng)用前景。