張豪，李哲，郭凱，郝永任

（齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）生物研究所，山東 濟(jì)南 250014）

木霉（Trichoderma spp．）是一類(lèi)重要的多功能絲狀真菌，也是工業(yè)上重要的酶制劑生產(chǎn)菌株和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中重要的生防菌株和植物促生菌株，在促生抗逆、生物防治、纖維素酶生產(chǎn)和生物質(zhì)利用等方面有著廣泛用途。

在生產(chǎn)、保存、運(yùn)輸以及工農(nóng)業(yè)應(yīng)用中，木霉不可避免地要面對(duì)自然環(huán)境和發(fā)酵環(huán)境中的不利影響，如高溫、低溫、鹽堿、干旱等，這將直接影響木霉生存，進(jìn)而影響其農(nóng)業(yè)防治效果和工業(yè)生產(chǎn)能力。因此，提高木霉對(duì)不利環(huán)境的適應(yīng)能力，對(duì)其在工農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用意義重大。

木霉體內(nèi)代謝途徑豐富，代謝產(chǎn)物繁多，很多代謝產(chǎn)物參與調(diào)控木霉對(duì)不利環(huán)境的適應(yīng)能力。利用基因組和基因工程技術(shù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，調(diào)控木霉中重要代謝產(chǎn)物的表達(dá)是提高木霉抗逆性、促生能力和產(chǎn)酶能力的有效途徑。大多數(shù)生物在面對(duì)逆境脅迫時(shí)會(huì)大量合成一些相溶性物質(zhì)用來(lái)保護(hù)細(xì)胞免受傷害［1］，如糖、多元醇和氨基酸等小分子，可以緩解外界滲透壓對(duì)細(xì)胞造成的壓力［2］。Kunte［3］研究發(fā)現(xiàn)在微生物細(xì)胞內(nèi)，許多相容性溶質(zhì)會(huì)隨著微生物的生長(zhǎng)而不斷變化。

海藻糖是一種典型的應(yīng)激代謝產(chǎn)物，當(dāng)生長(zhǎng)環(huán)境良好時(shí)，生物體體內(nèi)不積累海藻糖；當(dāng)處于脅迫環(huán)境（如饑餓、干旱、高溫和高鹽堿等）時(shí)，體內(nèi)會(huì)迅速積累海藻糖，且會(huì)隨著不良環(huán)境的解除而被降解［4］。

海藻糖是由兩個(gè)葡萄糖分子以α，α-1，1糖苷鍵連接的非還原性雙糖，廣泛存在于植物、藻類(lèi)、真菌、細(xì)菌、昆蟲(chóng)等多種物種體內(nèi)［4］。海藻糖是昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育中的重要糖類(lèi)和能量物質(zhì)，被稱(chēng)為昆蟲(chóng)的“血糖”［5，6］，不僅能作為能源物質(zhì)在生物體內(nèi)儲(chǔ)存和作為保護(hù)劑保護(hù)生物膜、蛋白質(zhì)等免受傷害，使生物更好地抵抗不利環(huán)境［7-9］，還能幫助植物應(yīng)對(duì)高溫、高鹽堿、干旱、嚴(yán)寒等極端環(huán)境，調(diào)節(jié)植物氣孔導(dǎo)度和水利用率，并作為信號(hào)分子調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)、發(fā)育和代謝［10］。

Goddijn等［11］發(fā)現(xiàn)許多沙漠植物如折扇葉（Myrothamnus flabellifolius）、卷柏（Selaginella tamariscina）都含有高含量的海藻糖。Bell等［12］發(fā)現(xiàn)，在熱激條件下釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中海藻糖大量積累。擬南芥（Arabidopsis thaliana）在鹽脅迫環(huán)境中體內(nèi)海藻糖含量增加，并提高了其耐鹽堿能力［13］。

海藻糖及其前體物質(zhì)海藻糖-6-磷酸（trehalose-6-phosphate，T6P）參與生物體內(nèi)一些信號(hào)調(diào)控和植物中多種代謝通路。海藻糖普遍存在于真菌的孢子、子實(shí)體和營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞中。崔西苓［14］研究表明耐鹽堿木霉菌株中存在海藻糖。

現(xiàn)在已知的海藻糖合成途徑至少有5條，分別為OtsA-OtsB途徑（TPS/TPP途徑）、TreP途徑、TreS途 徑、TreY-TreZ 途 徑 和 TreT 途徑［15，16］。在真菌中存在OtsA-OtsB途徑和TreP途徑，分布最廣的是OtsA-OtsB途徑，在低等真核生物中，如酵母及絲狀真菌中，海藻糖均是通過(guò)OtsA-OtsB（TPS/TPP途徑）途徑合成的。OtsAOtsB途徑中主要的海藻糖合成酶包括海藻糖磷酸合成酶（trehalose-6-phosphate synthase，TPS）和海藻糖磷酸磷酸酯酶（trehalose-6-phosphate phosphatase，TPP）。海藻糖合成途徑包括兩步酶促反應(yīng)：首先由TPS催化尿苷二磷酸-葡萄糖與葡萄糖-6-磷酸形成T6P，然后由TPP催化T6P脫磷酸形成海藻糖，TPS是海藻糖合成過(guò)程中的關(guān)鍵作用酶［17-19］。

海藻糖在生物體內(nèi)具有很強(qiáng)的抗脫水作用，在干旱、寒冷、高鹽堿等逆境條件下可保護(hù)生物膜、蛋白質(zhì)等免受傷害。因此，海藻糖能夠提高生物體對(duì)逆境條件的抗性。此外，海藻糖以及其他相容性溶質(zhì)的積累可增強(qiáng)生防菌抵御各種植物病原菌的能力［20，21］。因此，本研究構(gòu)建了過(guò)表達(dá)海藻糖合成酶編碼基因TvTPS/TPP的綠色木霉工程菌株，以研究TvTPS/TPP在海藻糖合成以及抗逆促生等方面的功能。

1 材料與方法

1．1 供試菌株

綠色木霉（Trichoderma viride）Tv-1511，由本實(shí)驗(yàn)室分離保存，在中國(guó)普通微生物菌種保藏中心的保藏號(hào)為CGMCC No．16800，保藏日期為2018年12月4日，保藏于中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。

1．2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基和PDB培養(yǎng)基等購(gòu)自于青島海博生物技術(shù)有限公司。PDB培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯浸粉6．0 g，葡萄糖20．0 g，PDA培養(yǎng)基另加入瓊脂20．0 g。LB培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10．0 g，酵母浸粉5．0 g，氯化鈉10．0 g，瓊脂15．0 g。

1．3 試驗(yàn)試劑

T4連接酶試劑盒、高保真Taq酶等購(gòu)自于南京諾唯贊生物科技股份有限公司；過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建質(zhì)粒pBARGPE1-Hygro購(gòu)自Addgene公司；限制性?xún)?nèi)切酶KpnⅠ和Eco RⅠ購(gòu)自NEB公司；氨芐、潮霉素B和溶菌酶購(gòu)自Sigma公司；裂解液：取0．15 g溶解酶（lysing enzyme，Sigma：L1412）溶于20 mL溶液Ⅰ（1．2 mol/L D-sorbitol，0．1 mol/L KH2PO4，pH 5．6），0．2μm濾膜過(guò)濾除菌。

1．4 綠色木霉TvTPS/TPP基因的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建

1．4．1 TvTPS/TPP基因的克隆 參照真菌基因組提取試劑盒（E．Z．N．A Fungal DNA Kit，美國(guó)OMEGA公司）說(shuō)明書(shū)提取綠色木霉Tv-1511基因組DNA。以基因組DNA為模板，擴(kuò)增TvTPS/TPP基因的完整序列，擴(kuò)增引物為：TvTPS/TPPFL-Eco RⅠ-F：5′-CGGAATTCATGGCGCGTTATGAGTCTCTCT-3′和TvTPS/TPP-FL-KpnⅠ-R：5′-GGGGTACCTCACAACTCCTCCTCCGGAATGT-3′；擴(kuò)增體系（50μL）：2×Phanta Master Mix 25μL，引物混合物4μL，基因組DNA 1 μL，ddH2O 20μL；擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃3 min；95℃15 s，60℃15 s，72℃2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃5 min。

1．4．2 DNA片段及表達(dá)載體雙酶切 將得到的TvTPS/TPP基因和載體pBARGPE1-Hygro用限制性?xún)?nèi)切酶KpnⅠ和Eco RⅠ（NEB公司）進(jìn)行雙酶切；對(duì)酶切產(chǎn)物利用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，利用DNA回收試劑盒（FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit，南京諾唯贊生物科技股份有限公司）回收酶切后的DNA片段和線(xiàn)性化的pBARGPE1-Hygro質(zhì)粒。

1．4．3 過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化 DNA片段與表達(dá)載體的連接采用T4連接酶進(jìn)行，反應(yīng)體系（10μL）：連接酶1μL，緩沖液1μL，pBARGPE1-Hygro線(xiàn)性化質(zhì)粒1μL，TvTPS/TPP基因片段3 μL，ddH2O 4μL。16℃過(guò)夜反應(yīng)，取50μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞與10μL連接體系混勻進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)化（冰上靜置30 min，42℃靜置90 s，冰上靜置5 min），轉(zhuǎn)化后涂布到含有100μg/mL氨芐青霉素的LB平板上；37℃培養(yǎng)12～20 h后，挑取菌落至含有100μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基上，37℃、200 r/min培養(yǎng)12～20 h后，送菌落PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1．5 原生質(zhì)體制備及過(guò)表達(dá)工程菌的構(gòu)建

1．5．1 原生質(zhì)體制備 接種綠色木霉Tv-1511于PDA平板，28℃培養(yǎng)10 d，待產(chǎn)生大量新鮮分生孢子，用10 mL生理鹽水（0．9% NaCl，0．05%Tween-20）洗滌菌絲表面，經(jīng)玻璃紙過(guò)濾，去除菌絲體得到孢子懸液；取200μL孢子懸液涂布于鋪有玻璃紙的PDA平板上，28℃避光培養(yǎng)24 h；將長(zhǎng)有菌絲的玻璃紙取出并反向貼在含有3～4 mL裂解液的平板上，于28℃、100 r/min條件下處理100 min；無(wú)菌超凈臺(tái)中將平板中的玻璃紙取出，確保大部分菌絲體保留在平板中，在此過(guò)程中可以用溶液Ⅰ沖洗玻璃紙上殘留的菌絲塊，利用槍頭反復(fù)吹吸，充分釋放內(nèi)部原生質(zhì)體；4層紗布過(guò)濾上述混合液，保留濾液并于4℃、2 000 r/min條件下離心10 min，棄上清，保留底部的原生質(zhì)體加1 mL溶液Ⅰ，再次離心，棄上清；加1 mL 4℃預(yù)冷的溶液Ⅱ（1 mol/L sorbitol，50 mmol/L CaCl2，10 mmol/L Tris-HCl，pH 7．5），得到原生質(zhì)體；用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，稀釋原生質(zhì)體至107個(gè)/mL。

1．5．2 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子篩選 冰上放置15 mL離心管，分別加入200μL原生質(zhì)體懸浮液、10μL純化的PCR產(chǎn)物、50μL PEG溶液（25% PEG6000，50 mmol/L CaCl2，10 mmol/L Tris-HCl，pH 7．5），混勻，冰上放置20 min；加2 mL PEG溶液，輕輕混勻，常溫下放置5 min；加2 mL溶液Ⅱ，輕輕混勻；加2 mL混合液涂布在鋪有層析紙的含1 mol/L蔗糖PDA平板上；28℃避光培養(yǎng)24 h；將層析紙轉(zhuǎn)到含抗生素的PDA平板上，28℃避光培養(yǎng)36 h，待層析紙邊緣長(zhǎng)出菌落后，挑取菌落，轉(zhuǎn)接至新的抗生素平板上，培養(yǎng)2 d。

1．6 TvTPS/TPP基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平分析

將木霉野生型和TvTPS/TPP過(guò)表達(dá)工程菌（TvTPS/TPP-OE）的孢子液分別接種于PDB培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min培養(yǎng)48 h，4層無(wú)菌紗布過(guò)濾獲得菌絲體，經(jīng)液氮充分研磨后，用Trizol法提取木霉菌總RNA，并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。采用熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒（AceQ?qPCR SYBR Green Master Mix，南京諾唯贊生物科技股份有限公司）檢測(cè)TvTPS/TPP基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，擴(kuò)增引物為T(mén)vTPS/TPP-qPCR-F：5′-TTCCTCCAGCAGCATCTT-3′和TvTPS/TPP-qPCR-R：5′-ACCTTGTCCGTGTATCTCT-3′。擴(kuò)增體系：SYBR Green Master Mix 10μL，引物混合液2μL，cDNA 3μL，ddH2O 5μL；反應(yīng)程序：95℃5 min，95℃10 s，60℃30 s。

1．7 海藻糖磷酸合成酶（TPS）和海藻糖磷酸磷酸酯酶（TPP）的活性檢測(cè)

離心收集菌絲體2 g，加入0．05 mol/L的磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液10 mL，2%甲苯50℃處理30 min后超聲波破碎，離心收集上清液。

上清液中添加40 mmol/L的tricine（pH 7．6）、2 mmol/L的磷酸烯醇式丙酮酸以及20 U的丙酮酸激酶進(jìn)行催化反應(yīng)，吸取200μL反應(yīng)液并加入0．15%孔雀綠、1%鉬酸銨和12．5%（v/v）的HCl。混合液充分反應(yīng)后于630 nm處利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)。TPS活性以在催化反應(yīng)中尿嘧啶核苷（UDP）的生成量來(lái)表示，TPP活性以在催化反應(yīng)中無(wú)機(jī)磷的釋放量來(lái)表示。

1．8 耐鹽能力的分析

平板耐鹽試驗(yàn)：PDA平板上活化木霉原始菌株和TvTPS/TPP-OE工程菌，28℃避光培養(yǎng)48～72 h，使原始菌株和工程菌長(zhǎng)勢(shì)均一，使用打孔器制備大小相同的菌塊并接種到含有300 mmol/L NaCl的PDA平板中央，置于28℃培養(yǎng)72 h后，測(cè)量菌落生長(zhǎng)直徑。

液體搖瓶耐鹽試驗(yàn)：將200μL濃度為108個(gè)/mL木霉原始菌株和TvTPS/TPP-OE工程菌孢子液分別接種于PDB液體培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min培養(yǎng)48 h，兩層無(wú)菌紗布過(guò)濾獲得菌絲體。將等量菌絲體分別接種于含有300 mmol/L NaCl的PDB液體培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min培養(yǎng)72 h，收集菌絲體，測(cè)定菌體生物量。

1．9 耐熱能力分析

平板耐熱試驗(yàn)：PDA平板上活化木霉原始菌株和TvTPS/TPP-OE工程菌，28℃避光培養(yǎng)48～72 h，使菌株長(zhǎng)勢(shì)均一，使用打孔器制備大小相同的菌塊并轉(zhuǎn)移到新的PDA平板中央，分別置于35℃培養(yǎng)72 h后，測(cè)量菌落生長(zhǎng)直徑。

液體搖瓶耐熱試驗(yàn)：將200μL木霉原始菌株和TvTPS/TPP-OE工程菌孢子液分別接種于PDB液體培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min培養(yǎng)48 h，兩層無(wú)菌紗布過(guò)濾獲得菌絲體。將等量菌絲體分別接種于新的PDB液體培養(yǎng)基中，35℃、180 r/min培養(yǎng)72 h，收集菌絲體，測(cè)定菌體生物量。

1．10 耐旱能力分析

PDB液體培養(yǎng)基中加入30% PEG6000模擬干旱脅迫。將200μL木霉原始菌株和TvTPS/TPP-OE工程菌孢子液分別接種于PDB液體培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min培養(yǎng)48 h，兩層無(wú)菌紗布過(guò)濾獲得菌絲體。將等量菌絲體分別接種于含30% PEG6000的PDB液體培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min培養(yǎng)72 h，收集菌絲體，測(cè)定菌體生物量。

1．11 海藻糖含量的檢測(cè)

將200μL木霉原始菌株和TvTPS/TPP-OE工程菌孢子液分別接種于PDB液體培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min培養(yǎng)48 h，兩層無(wú)菌紗布過(guò)濾獲得菌絲體。不同脅迫條件下培養(yǎng)72 h后，收集菌絲體，采用高效離子色譜法（HPIC）檢測(cè)菌絲體內(nèi)海藻糖含量。

1．12 數(shù)據(jù)處理與分析

運(yùn)用Origin 9．0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和圖表制作，采用ANOVA法分析處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2．1 TvTPS/TPP基因序列的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建

從綠色木霉（Trichoderma viride）Tv-1511基因組中鑒定出一個(gè)雙功能海藻糖合成酶的編碼基因TvTPS/TPP。通過(guò)前期對(duì)Tv-1511開(kāi)展的全基因組測(cè)序和精細(xì)基因組圖譜繪制工作（Gen-Bank Accession No．VCEC00000000；BioProject：PRJNA543939；BioSample：SAMN11791795），得到了TvTPS/TPP基因及其編碼蛋白的詳細(xì)信息。TvTPS/TPP（NCBIaccession number MZ417548）基因序列已提交到NCBIGenBank數(shù)據(jù)庫(kù)。TvTPS/將帶有酶切連接位點(diǎn)（EcoⅠR和KpnⅠ）的TvTPS/TPP基因進(jìn)行雙酶切，獲得一條2 625 bp的 DNA 片 段（圖 2）；將 DNA 片 段 連 接pBARGPE1-Hygro載體，得到的表達(dá)載體pBARGPE1-Hygro-TvTPS/TPP大小為8 583 bp。重組過(guò)表達(dá)質(zhì)粒包含木霉啟動(dòng)子gpdA、終止子trpC、抗性篩選基因HygR以及TvTPS/TPP基因的完整序列（圖3）。

TPP蛋白的氨基酸序列包含trehalose-6-phosphate synthase（TPS）和trehalose-6-phosphate phosphatase（TPP）結(jié)構(gòu)域（圖1），具有海藻糖磷酸合成酶和海藻糖磷酸磷酸酯酶的雙重活性。

圖2 TvTPS/TPP基因克隆和pBARGPE1-Hygro-TvTPS/TPP載體構(gòu)建

2．2 原生質(zhì)體制備及過(guò)表達(dá)工程菌的構(gòu)建

通過(guò)PEG介導(dǎo)的木霉轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，經(jīng)潮霉素篩選后獲得Tv-1511的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，并采用熒光定量PCR法檢測(cè)TvTPS/TPP的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。結(jié)果表明，與野生型菌株相比，過(guò)表達(dá)綠色木霉工程菌中TvTPS/TPP基因的表達(dá)顯著提高（圖4）。過(guò)表達(dá)TvTPS/TPP基因后，工程菌中TPS和TPP酶的活性也顯著高于野生型菌株（圖5）。

2．3 過(guò)表達(dá)TvTPS/TPP基因綠色木霉的抗逆能力

抗逆試驗(yàn)結(jié)果表明，300 mmol/L NaCl以及35℃高溫脅迫下，TvTPS/TPP過(guò)表達(dá)工程菌的平均直徑均比野生型菌株顯著增加（圖6A、B；圖7 A、B），生物量也顯著提高（圖6C、圖7C）。在30% PEG6000模擬干旱脅迫的環(huán)境下，TvTPS/TPP過(guò)表達(dá)工程菌的生物量比野生型菌株顯著提高（圖8）。

以上結(jié)果表明過(guò)表達(dá)TvTPS/TPP基因可顯著提高綠色木霉對(duì)高鹽、高溫和干旱逆境脅迫的耐受性。

圖3 TvTPS/TPP表達(dá)載體

圖4 綠色木霉工程菌中TvTPS/TPP基因轉(zhuǎn)錄水平

圖5 綠色木霉工程菌中TPS和TPP的活性

圖6 綠色木霉工程菌的耐鹽能力

圖7 綠色木霉工程菌的耐熱能力

圖8 綠色木霉工程菌的耐干旱能力

2．4 海藻糖含量及TPS和TPP酶活性變化

由圖9可知，在鹽脅迫、高溫脅迫以及干旱脅迫條件下，TvTPS/TPP過(guò)表達(dá)工程菌中海藻糖含量高于野生型菌株，說(shuō)明其對(duì)脅迫的耐受性增強(qiáng)。

對(duì)逆境脅迫下木霉菌株中TPS和TPP活性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果（圖10）顯示，在鹽脅迫、高溫脅迫以及干旱脅迫條件下，TvTPS/TPP過(guò)表達(dá)工程菌表現(xiàn)更高的TPS和TPP活性。

圖9 逆境脅迫下綠色木霉工程菌中海藻糖含量

圖10 逆境脅迫下綠色木霉工程菌中TPS和TPP活性

3 討論與結(jié)論

海藻糖是一種不可或缺的生物代謝物［22，23］，可在多種微生物和植物中抵御多種環(huán)境脅迫［24，25］。在極端非生物脅迫下，海藻糖作為膜、蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合物的非滲透性活性氧清除劑和穩(wěn)定劑，是一種非常有效的保護(hù)劑［26］。Luo等［26］的研究證明了海藻糖對(duì)活性氧的直接清除能力，在熱脅迫下，海藻糖可以使小麥中過(guò)氧化氫含量顯著減少。Sadak等［23］的研究結(jié)果表明，鹽分脅迫顯著降低了小麥生長(zhǎng)參數(shù)（地上部干重和鮮重、地上部高度等），H2O2、脂質(zhì)過(guò)氧化和脂氧合酶（LOX）活性顯著增加；添加海藻糖后，增加了其他滲透保護(hù)劑的水平，如脯氨酸、游離氨基酸、葡萄糖和總可溶性糖，同時(shí)降低了H2O2、脂氧合酶活性和丙二醛（MDA）含量。

在酵母和絲狀真菌中，海藻糖是通過(guò)OtsAOtsB途徑（TPS/TPP途徑）合成的，海藻糖-6-磷酸合成酶TPS是海藻糖合成過(guò)程中的關(guān)鍵作用酶。海藻糖在酵母中的合成路徑基本已經(jīng)研究透徹，但在真菌中還未了解清楚。在釀酒酵母中，TPS是一種復(fù)合物，包括四個(gè)亞基（Tps1p、Tps2p、Tps3p、Ts11p）、兩種酶和兩個(gè)調(diào)節(jié)亞基［27］；Tps1p和Tps2p活性在應(yīng)激條件下顯著增加。本研究中，在過(guò)表達(dá)TvTPS/TPP后，TvTPS/TPP的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平增高，海藻糖的含量也增加。

本試驗(yàn)從綠色木霉Tv-1511中克隆出了海藻糖磷酸合成酶和海藻糖磷酸磷酸酯酶的完整基因，構(gòu)建了TvTPS/TPP過(guò)表達(dá)載體pBARGPE1-Hygro-TvTPS/TPP，并且通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化將TvTPS/TPP基因轉(zhuǎn)入綠色木霉Tv-1511中；對(duì)工程菌株進(jìn)行了抗逆性試驗(yàn)和海藻糖含量的測(cè)定。結(jié)果顯示，在過(guò)表達(dá)TvTPS/TPP基因后，綠色木霉Tv-1511中海藻糖含量顯著增加，抵御高鹽、高溫和干旱脅迫的能力得到明顯提高，說(shuō)明TvTPS/TPP基因在綠色木霉Tv-1511的逆境脅迫方面起著重要作用。