QuEChERS-GC-MS/MS法測定淡水魚中6種擬除蟲菊酯的殘留量

楊金川，白雪梅，張 建，宋忠霞，彭祖茂

（1.貴州省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗檢測院，貴州 貴陽 550001；2.貴州省廣告監(jiān)測中心，貴州 貴陽 550001）

擬除蟲菊酯是一類高效廣譜、低毒、低殘留新型殺蟲劑，其殺蟲效率是有機氯、有機磷、氨基甲酸酯類的10～100倍，因此廣泛運用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)等生產(chǎn)中，但隨著在農(nóng)業(yè)、林業(yè)生產(chǎn)上的施用，其殘留物會在農(nóng)田排水、地表徑流、降水等進入水體后，并通過食物鏈最終進入人體，會給人類健康帶來嚴(yán)重隱患。有研究表明，當(dāng)擬除蟲菊酯類農(nóng)藥在人體內(nèi)長期積蓄時，會對人體的聽力系統(tǒng)[1]、神經(jīng)系統(tǒng)[2-3]、生育系統(tǒng)[4-5]等產(chǎn)生較大的危害。隨著對擬除蟲菊酯類殘留危害的關(guān)注，很多國家和地區(qū)，逐漸加強了對一些水產(chǎn)品中擬除蟲菊酯類的限量，如國際食品法典委員會（Codex Alimentarius Commission，CAC）規(guī)定了鮭肌肉中溴氰菊酯最高殘留限量為30 μg/kg；歐盟（European Union，EU）規(guī)定了水產(chǎn)品中氯氰菊酯和溴氰菊酯最高殘留量分別為50 μg/kg和10 μg/kg；美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）規(guī)定了魚類中溴氰菊酯最高殘留量為10 μg/kg[6]；而我國在食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 31650—2019《食品中獸藥最大殘留限量》中也規(guī)定了魚肌肉中氯氰菊酯和溴氰菊酯最大殘留限量，為分別為50 μg/kg和30 μg/kg。隨著對一些水產(chǎn)品中擬除蟲菊酯類殘留危害的關(guān)注以及對氯氰菊酯和溴氰菊酯的限量，因此需要加強對擬除蟲菊酯類在魚類產(chǎn)品中的檢測研究。

目前，對擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的殘留檢測技術(shù)很多，主要有酶聯(lián)免疫分析方法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）[7-8]、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[9]、氣相色譜法（gas chromatography，GC）[10-14]、氣相色譜-質(zhì)譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[15-17]、液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜（liquidchromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[18-19]和氣相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）[20-21]。而前處理方法技術(shù)主要有固相萃取法（solid phase extraction，SPE），分散固相萃取法（dSPE）等。QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged，safe）技術(shù)是2003年ANASTASSIADES M等[22]首次提出，是在固相萃取基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型前處理凈化方法，其原理是通過吸附劑填料與基質(zhì)中的雜質(zhì)相互作用，吸附雜質(zhì)而達(dá)到除雜的目的，因其前處理簡單、快速，耗費有機試劑少，對環(huán)境友好等特點，經(jīng)多年發(fā)展，現(xiàn)已成動植物性食品中農(nóng)獸藥殘留的主要前處理技術(shù)之一。

魚肉基質(zhì)復(fù)雜，其含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸、維生素以及礦物質(zhì)等，并且魚肉中有機基質(zhì)在前處理過程中較難去除干凈，所以會對菊酯類農(nóng)藥檢測帶來很大困難。本研究以貴州市售淡水魚（鯉魚、鱘魚、鰱魚）為研究對象，通過應(yīng)用QuEChERS前處理技術(shù)，結(jié)合高靈敏度，高抗基質(zhì)干擾能力的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，對淡水魚中6種擬除蟲菊酯的定量進行研究，篩選出適宜的定性離子和定量離子，優(yōu)化方法條件，實現(xiàn)對6種擬除蟲菊酯類殘留的快速檢測，以期為魚肉中6種擬除蟲菊酯檢測提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

淡水魚：市售。

氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氯氟氰菊酯、甲氰菊酯、聯(lián)苯菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 mg/L）、環(huán)氧七氯（內(nèi)標(biāo)）標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 mg/L）：農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所；N-丙基乙二胺（N-propyl ethylenediamine，PSA）（粒徑為40～63 μm）和十八烷基鍵合硅膠（C18，粒徑為40 μm）：美國Agilent公司；乙酸乙酯（色譜純）：默克公司；無水硫酸鎂（分析純）：永大試劑有限公司；乙腈和氯化鈉（分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TRACE 1300-TSQ 9000氣相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜、ThermoScientific TR-Pesticide Ⅱ色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美國Thermo Scientific公司；ME1002/02分析天平：梅特勒-托利多國際貿(mào)易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

淡水魚去鱗、去骨后，取肌肉組織勻漿處理，放入聚乙烯瓶中，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 樣品的前處理

稱取勻漿處理的樣品5 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，先加2 mL超純水混勻，加入乙腈10 mL勻漿提取5 min，再加入2～3 g NaCl振蕩提取2 min，然后以5 000 r/min離心5 min，待取上清液，凈化；取4 mL上述上清液于15 mL聚丙烯QuEChERS凈化管（500 mg MgSO4+150 mg PSA+150 mg C18）中，渦旋振蕩1 min，6 000 r/min離心5 min，然后取2 mL離心上清液于玻璃試管中，45 ℃水浴中，氮吹吹至近干，用1 mL乙酸乙酯定容后，再加入20 μL 2.5 μg/mL的環(huán)氧七氯（內(nèi)標(biāo)），渦旋混合復(fù)溶，過0.22 μm濾膜到進樣小瓶中，待GC-MS/MS檢測。

1.3.3 分析方法

（1）氣相色譜檢測條件

石英毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：Thermo Scientific TR-Pesticide Ⅱ；載氣：氦氣（He），純度≥99.999%，流速1.00 mL/min；不分流進樣；進樣體積1 μL；進樣口溫度為250 ℃。程序升溫：初始溫度為40 ℃，保持1 min，以40 ℃/min 升至120 ℃，再以5 ℃/min升至240 ℃，最后以12 ℃/min 升至300 ℃，保持6 min。

（2）質(zhì)譜檢測條件

電子轟擊離子源（electron bombardment ion source，EI），溫度：280 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；碰撞氣：氬氣（99.999%）；選擇反應(yīng)檢測掃描（selection response monitor，SRM）模式。

上述條件下，各化合物的保留時間、定性及定量離子、碰撞能量等信息見表1。

表1 6種擬除蟲菊酯的CAS號、保留時間、定性和定量離子以及碰撞能量Table 1 CAS No.,retention time,qualitative and quantitative ions,and collision energy of 6 pyrethroids

續(xù)表

1.3.4 基質(zhì)效應(yīng)評價及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

本研究采用空白基質(zhì)提取液與純?nèi)軇┡渲瞥上嗤瑵舛?，用以比較待測目標(biāo)物的峰面積，通過二者峰面積的相對比值評價基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME），如果ME＞100%，說明存在基質(zhì)增強效應(yīng)，ME值越大，基質(zhì)增強效應(yīng)越大；如果ME＜100%，說明存在基質(zhì)抑制效應(yīng)，ME值越小，基質(zhì)抑制效應(yīng)越強[23]。ME計算公式如下：

式中：A表示純?nèi)軇┲心繕?biāo)物峰面積；B表示相同濃度下樣品基質(zhì)中目標(biāo)物峰面積。

分別移取上述一定量標(biāo)準(zhǔn)溶液至10 mL容量瓶中，然后用乙酸乙酯稀釋定容，配制成各農(nóng)藥質(zhì)量濃度為2 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)混標(biāo)儲備液，于-20 ℃保存，備用。試驗時，用對應(yīng)基質(zhì)空白溶液逐級稀釋，配成質(zhì)量濃度為5 μg/L、10 μg/L、30 μg/L、60 μg/L、150 μg/L、300 μg/L的一系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，并加入內(nèi)標(biāo)，在1.3.3節(jié)分析條件下進行測定。以目標(biāo)物定量離子的峰面積（y）為縱坐標(biāo)，進樣質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，進行線性回歸分析。

1.3.5 加標(biāo)回收率試驗

向空白樣品中（鯉魚、草魚、鳙魚）添加水平分別為3 μg/kg、30 μg/kg和300 μg/kg的擬除蟲菊酯，進行回收率和精密度實驗，每個添加水平5個重復(fù)，計算回收率和精密度。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件選擇

為了獲得最佳的SRM質(zhì)譜條件，在選定的氣相條件下，對各化合物先進行單級質(zhì)譜全掃描（50～500 m/z），分別獲得了其保留時間和具有代表性的母離子碎片，然后再采用產(chǎn)物離子掃描方式通過優(yōu)化碰撞能量及選擇的母離子碎片擊碎獲得產(chǎn)物離子，得到了1.3.3節(jié)中較為理想的質(zhì)譜檢測條件和SRM色譜圖，6種菊酯的GC-MS/MS色譜圖見圖1，其優(yōu)化后的峰型對稱較好，雖然聯(lián)苯菊酯和甲氰菊酯出峰時間較相近，但兩者對應(yīng)的母離子碎片及產(chǎn)物離子碎片都不同，檢測器會逐個離子分開掃描，所以對后期的定量定性均不會產(chǎn)生任何影響。

圖1 6種擬除蟲菊酯的GC-MS/MS選擇離子流色譜圖Fig.1 Selective reaction monitoring of 6 pyrethroids by GC-MS/MS

2.2 提取、凈化條件選擇

2.2.1 提取試劑的優(yōu)化

本研究先后考察了丙酮、乙酸乙酯和乙腈3種常用的農(nóng)殘?zhí)崛≡噭μ崛⌒Ч挠绊?，結(jié)果表明，丙酮提取的雜質(zhì)較多，不利于后續(xù)進行分離凈化處理；乙酸乙酯作為提取試劑由于無法浸入魚肉組織內(nèi)部，導(dǎo)致回收率不高；乙腈作為提取試劑，因其良好的共萃和分層特性，為后續(xù)的分離凈化提供方便，并且擁有良好的回收率。因此本研究選用乙腈作為提取試劑。

2.2.2 凈化條件的選擇

QuEChERS中常用到的吸附劑填料主要有石墨化炭黑（graphitized carbon black，GCB）、PSA、C18和MgSO4[24-25]，由于魚肉中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪及氨基酸等，所以混合使用PSA、C18和MgSO4，可以達(dá)到更好的凈化效果，但吸附劑用量會對回收率有一定的影響。所以本研究以在添加量為30 μg/kg鯉魚肉樣品為例，按1.3.2方法前處理提取，凈化時分別用考察的6種凈化組合凈化，再按1.3.3分析方法檢測，考察6種不同的凈化組和對各擬除蟲菊酯的回收率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 鯉魚中6種擬除蟲菊酯在6種凈化劑中的回收率Fig.2 Recovery of 6 pyrethroids spiked in carp in six purifying agents

由圖2可知，當(dāng)組合為Ⅰ和Ⅱ時，于PSA和C18吸附劑用量較少，雖然各擬蟲菊酯的回收率較高，但并通過總離子流圖（total ion chromatogram，TIC）對比發(fā)現(xiàn)，雜質(zhì)去除效果較差；當(dāng)組合為Ⅲ～Ⅵ時，通過TIC圖對比發(fā)現(xiàn)，均能達(dá)到很好的凈化效果，但當(dāng)隨著吸附劑用量的增加，聯(lián)苯菊酯的回收率降低明顯。最終，在綜合凈化效果、滿足各菊酯的回收率的同時降低實驗成本，最終選擇組合Ⅲ（PSA 150 mg+C18 150 mg+MgSO4500 mg）作為凈化吸附劑。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)、標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及定量限

以各質(zhì)量濃度為30 μg/L的標(biāo)液為例，分別配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液和純?nèi)軇?biāo)液，并采用1.3.4中基質(zhì)效應(yīng)的評價公式進行基質(zhì)效應(yīng)評價，按1.3.4節(jié)配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，用GC-MS/MS檢測并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性范圍、決定系數(shù)、基質(zhì)效應(yīng)、檢出限和定量限結(jié)果見表3。

表3 6種擬除蟲菊酯的線性范圍、決定系數(shù)、基質(zhì)效應(yīng)、檢出限及定量限Table 3 Linear ranges,determination coefficients,matrix effect,LODs and LOQs of 6 pyrethroids

由表3可知，6種擬除蟲菊酯在3種魚肉基質(zhì)中的ME在186%～335%之間，均存在較強的基質(zhì)增強。為了減小基質(zhì)效應(yīng)的影響[28]，本研究采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線（內(nèi)標(biāo)法）進行定量。在線性范圍內(nèi)，6種菊酯的峰面積與對應(yīng)的進樣質(zhì)量濃度間均呈良好的線性關(guān)系，決定系數(shù)R2均大于0.999 5。以被測化合物定量離子對3倍信噪比（S/N）確定的方法檢出限（limit of detection，LOD），10倍信噪比（S/N）確定的方法定量限（limit of quantitation，LOQ）分別在0.2～1 μg/kg和0.6～3 μg/kg之間。

2.4 方法的精密度與加標(biāo)回收率

當(dāng)空白樣品中添加水平分別為3 μg/kg、30 μg/kg和300 μg/kg，且每個添加水平5個平行時，測定加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviations，RSD），結(jié)果見表4。結(jié)果表明，6種擬除蟲菊酯在魚肉中的平均回收率在83%～102%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.9%～4.9%之間。表明所建立方法具有良好的準(zhǔn)確度、精密度和重復(fù)性。

表4 6種擬除蟲菊酯在淡水魚中3個水平下的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）Table 4 Recovery and RSD of 6 pyrethroids at three spiked levels in freshwater fish (n=5)

續(xù)表

2.5 實際淡水魚樣品中6種擬除蟲菊酯的測定

從貴陽市各超市和農(nóng)貿(mào)市場隨機購買鱘魚、鰱魚、鯉魚等30份樣品，按照優(yōu)化的前處理方法和色譜條件進行檢測，結(jié)果均未檢出6種擬除蟲菊酯的殘留。

3 結(jié)論

本研究通過提取溶劑和吸附劑的篩選得以優(yōu)化QuEChERS前處理條件，并采取較優(yōu)的GC-MS/MS條件，建立了一種快速測定淡水魚（鯉魚、鱘魚、鰱魚）中6種擬除蟲菊酯殘留的分析方法。本研究對基質(zhì)效應(yīng)進行了考察，并通過配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線可以減少基質(zhì)效應(yīng)影響，從而實現(xiàn)了復(fù)雜基質(zhì)的提取、凈化濃縮與多種菊酯類殘留的快速篩查及確證，能滿足淡水魚（鯉魚、鱘魚、鰱魚）中6種菊酯的快速定性和定量檢測，也可為其他淡水魚肉中6種擬除蟲菊酯檢測提供技術(shù)支持。