模糊數(shù)學(xué)評價結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化黑枸杞紅棗風(fēng)味發(fā)酵乳工藝

賈慶超，孔欣欣

（鄭州科技學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院，河南 鄭州 450064）

發(fā)酵乳源于公元前3 000多年，目前主要指的是以鮮牛乳或者乳制品為主要原料，通過發(fā)酵加工制成的乳制品[1]。發(fā)酵乳中的益生菌，可以有效地防止有害細菌的繁殖，使人體的腸道內(nèi)有毒的物質(zhì)和細菌逐漸減少，并降低腫瘤的風(fēng)險，從而可以達到調(diào)節(jié)人體腸道菌群作用，提高人們自身免疫力，對身體有健康和營養(yǎng)功能的作用[2]。黑枸杞（Lycium ruthenicum）屬茄科，是中國西部的一種藥用植物，味甘、性平和，含有脂肪、糖類、生物堿和維生素等多種成分，以及豐富的天然水溶性的原花青素，并被譽名為野生的“藍色妖姬”[3-4]。它可以延緩衰老，防治糖尿病，易溶于水，屬于天然的水溶性黃酮類，可以降血脂，還可以用于滋補身體、降血壓和藥用，并富含多種蛋白質(zhì)[5]。紅棗（Ziziphus jujuba）屬李科棗[6]，維生素含量高，有“維生素王”的稱譽，具有補血足氣的效果，《本草綱目》有記載：棗味甘、性溫和，能夠補中氣，清肝明目，治療“脾虛弱、氣血兩虛、補血滋養(yǎng)”等疾病。紅棗具有防治體弱多病、神經(jīng)衰弱、脾胃不和、養(yǎng)肝護肝等功能，有“日食三顆棗，百歲不顯老”之俗稱。研究表明，紅棗能促進白細胞的生成，降低膽固醇、延緩衰老、提高自身免疫力、防動脈硬化、溫暖身體等作用[7]。目前，以黑枸杞為原料制備發(fā)酵乳的研究較少，且發(fā)酵原料僅只有黑枸杞[7]，但關(guān)于非發(fā)酵型飲料的研究較多[8]。紅棗發(fā)酵乳飲料目前研究較多，其發(fā)酵原料主要為紅棗和一些營養(yǎng)物質(zhì)如紫薯、竹筍等[9-10]。將黑枸杞和紅棗結(jié)合制備一種新型發(fā)酵型乳飲料，實現(xiàn)二者營養(yǎng)及藥用價值的互補，使乳飲料營養(yǎng)及藥用價值更加豐富，實用價值更大，具有很大的市場前景。

本研究以黑枸杞、紅棗、鮮牛奶為主要原料制作出一款新型的黑枸杞紅棗風(fēng)味發(fā)酵乳，采用單因素試驗來研究枸杞汁添加量、紅棗汁添加量、白糖添加量、發(fā)酵時間、菌種量對發(fā)酵乳的影響，在此基礎(chǔ)上，以模糊數(shù)學(xué)感官綜合評價為響應(yīng)值[8]，利用響應(yīng)面法對黑枸杞紅棗風(fēng)味發(fā)酵乳的發(fā)酵工藝進行優(yōu)化[11]，并對其感官、理化和微生物指標進行評價，旨在為黑枸杞紅棗風(fēng)味發(fā)酵乳的研究提供重要參考和研發(fā)依據(jù)，彌補目前研究空白，為其工業(yè)化生產(chǎn)鑒定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑枸杞：寧夏杞里香現(xiàn)代生態(tài)農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司；紅棗（新疆若羌紅棗）：市售；白糖（食品級）：大豐英茂糖業(yè)有限公司；變性淀粉MLB-03A：宜瑞安食品配料有限公司；復(fù)配增稠劑BDS1005（食品級）：丹尼斯克（中國）有限公司；菌種ABY-10（200 U/袋）：科漢森（北京）貿(mào)易有限公司；新鮮牧場高品質(zhì)鮮牛乳（蛋白質(zhì)含量3.4 g/100 mL）：江蘇光明銀寶乳業(yè)有限公司。

氫氧化鈉、乙酸鉛、磷酸氫二鈉、濃硫酸、硫酸銅、氨水、鹽酸萘乙二胺、亞硝酸鈉標準品、硫酸鉀、乙醚、石油醚、甲醇、乙腈、辛烷磺酸鈉（均為分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；三聚氰胺標準品（純度＞99%）：武漢中昌國研標物科技有限公司。

MRS、MC培養(yǎng)基：蘇州海博生物技術(shù)有限公司；孟加拉紅、平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SPECORD 210紫外分光光度計：德國耶拿分析儀器股份有限公司；Kjeltec8400全自動凱氏定氮儀：丹麥福斯分析儀器有限公司；1260高效液相色譜儀、7890B氣相色譜儀：美國安捷倫有限公司；PHB-4型pH計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；XG1.CD-300M臥式滅菌鍋：山東新華醫(yī)療器械有限公司；XPE205DR分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；N1-50全自動氮吹濃縮儀：廣州儀德精密科學(xué)儀器股份有限公司；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博訊醫(yī)療生物器械有限公司；FT1乳品快速分析儀：丹麥福斯公司；DH3600B Ⅱ電熱恒溫培養(yǎng)箱：天津市泰斯特儀器有限公司；BX53F顯微鏡：德國蔡司股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 黑枸杞紅棗風(fēng)味發(fā)酵乳加工工藝流程及操作要點

操作要點：

黑枸杞汁的制備[12]：選取果實比較豐富飽滿、外表無損壞的優(yōu)質(zhì)黑枸杞，清洗去除表面灰塵，按照料液比1∶20（g∶mL）加水煮沸，將料液于打漿機中打碎成漿，80目過濾塞過濾，即得黑枸杞汁，備用。

紅棗汁的制備[13]：挑選外表光滑，果實飽滿紅潤，并且無霉變和損壞的紅棗，去除紅棗中的雜質(zhì)和干癟成分，清水洗凈紅棗后，瀝干水分后去核，按照料液比1∶7（g∶mL）加水煮沸，將料液于打漿機中打碎成漿，80目過濾塞過濾，即得到紅棗汁，備用。

混合：以發(fā)酵乳的總質(zhì)量為基準，在牛奶中添加10%紅棗汁、11%黑枸杞汁、5%蔗糖，0.06%增稠劑，混勻。

滅菌、冷卻：混合料與85 ℃滅菌25 min，并迅速冷卻至40 ℃。

加入發(fā)酵劑：在滅菌、冷卻至40 ℃混合液中加入菌種ABY-10 0.002%，攪拌均勻，覆蓋保鮮膜隔氧。

發(fā)酵：將混合液置于43 ℃恒溫條件下發(fā)酵5 h，待混合液由液態(tài)變?yōu)楣虘B(tài)凝乳，滴定酸度達到70 T°完成發(fā)酵。

后熟：將發(fā)酵后的發(fā)酵乳放于4～6 ℃的冰箱中后熟12 h，即得到黑枸杞紅棗風(fēng)味發(fā)酵乳。

1.3.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化

（1）單因素試驗[14]

（2）響應(yīng)面試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，固定黑枸杞汁添加量為11%，以紅棗汁添加量（A）、白砂糖添加量（B）、菌種添加量（C）和發(fā)酵時間（D）為影響因素，以感官評分（Y1）和蛋白質(zhì)含量（Y2）為響應(yīng)值，采用Design-Expert10.0.7軟件設(shè)計4因素3水平響應(yīng)面試驗，Box-Behnken試驗因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments

1.3.3 感官評定方法

參考GB 19302—2010《食品安全國家標準發(fā)酵乳》，邀請10位經(jīng)過感官培訓(xùn)的人員組成感官品評小組，然后按照順序從產(chǎn)品的色澤、氣味、滋味、組織狀態(tài)這4個方面，以優(yōu)、良、中、差這4個等級中對每次品嘗完的樣品進行評分，滿分10分。感官評分標準見表2。

表2 黑枸杞紅棗風(fēng)味發(fā)酵乳感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standards of fermented milk with black wolfberry and jujube flavor

續(xù)表

1.3.4 模糊數(shù)學(xué)感官評價法的建立

（1）因素集、評語集及權(quán)重集的建立

因素集是用黑枸杞和紅棗發(fā)酵型乳飲料感官評價因素的集合，對氣味（U1）、滋味（U2）、組織狀態(tài)（U3）和色澤（U4）為指標建成的評價因素集，U={U1，U2，U3，U4}[15]。評語集是感官評價員對評價因素集的分數(shù)集合，評語集V={優(yōu)V1，良V2，中V3，差V4}。權(quán)重集的確定采用用戶調(diào)查法和二元對比的方法[16-17]，權(quán)重集W=（W1，W2，W3，W4）=（0.29，0.31，0.20，0.20），其中W1，W2，W3，W4分別是風(fēng)味發(fā)酵乳飲料的氣味、滋味、組織狀態(tài)和色澤的權(quán)重。

（2）模糊矩陣的建立及評價結(jié)果的確定[18]

國內(nèi)某鋼廠厚板可逆式3800軋機支承輥，輥面直徑2200mm，輥面有效工作長度3700mm，輥體材質(zhì)70Cr3Mo，重量154t，其中一端輥面嚴重掉塊剝離，最大剝離深度約300mm，掉塊軸向長度最大約1650mm，周向長度最大約3000mm。經(jīng)研究，中信重工決定對支承輥進行堆焊修復(fù)，此規(guī)格是當(dāng)時國內(nèi)堆焊修復(fù)的最大規(guī)格的支承輥，修復(fù)風(fēng)險非常大。本文采用多種試驗分析手段從剝落形態(tài)、硬度、化學(xué)成分、內(nèi)部組織等方面對該支承輥輥身剝落掉塊問題進行分析，為其堆焊修復(fù)工藝的研究做理論支撐。

由10位感官評價員來按照黑枸杞紅棗風(fēng)味發(fā)酵乳的色澤、氣味、滋味、組織狀態(tài)這4個因素來進行感官綜合評價，評價之后可統(tǒng)計出各個因素在各個等級中的票數(shù)，然后根據(jù)所得的票數(shù)結(jié)果可得出風(fēng)味發(fā)酵乳的感官評價模糊關(guān)系矩陣M。

其中k=1，2，3，4，5，…n為樣品的編號，里面的每一行都代表每一個的質(zhì)量因素的評價數(shù)據(jù)結(jié)果。然后依照風(fēng)味發(fā)酵乳模糊數(shù)學(xué)評價模型T=W×Mk（其中T評價集，W為權(quán)重系數(shù)，M為模糊矩陣）對第k號樣品的感官評分進行計算。

1.3.5 理化和微生物指標檢測

脂肪的測定：按照國標GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》中的堿水解法；蛋白質(zhì)的測定：按照國標GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》中的凱氏定氮法；乳糖、白糖的測定：按照國標GB 5413.5—2010《嬰幼兒食品和乳品中乳糖、蔗糖的測定》中的萊茵-埃農(nóng)氏法；酸度的測定：按照國標GB 5009.239—2016《食品酸度的測定》中的酚酞指示劑法；水分的測定：按照國標GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》中的直接干燥法；非脂乳固體的測定：按照國標GB 5413.39—2010《乳和乳制品中非脂乳固體的測定》；亞硝酸鹽的測定：按照國標GB 5009.33—2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中的分光光度計法；三聚氰胺的檢測：按照國標GB/T 22388—2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》中的高效液相色譜法；乳酸菌測定：按照國標GB 4789.35—2016《食品微生物學(xué)檢驗乳酸菌檢驗》；霉菌及酵母菌測定：按照國標GB 4789.15—2016《微生物學(xué)檢驗霉菌和酵母計數(shù)》。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

由圖1a可知，隨著黑枸杞汁添加量增大，感官評分呈先升高后降低的趨勢；當(dāng)黑枸杞汁的添加量為11%時，感官評分最高；當(dāng)枸杞汁添加量＞11%之后，感官評分有所下降。蛋白質(zhì)的含量稍有降低，但變化不大。因此，選擇黑枸杞汁最適添加量為11%；由圖1b可知，隨著紅棗汁添加量增大，蛋白質(zhì)含量逐漸降低，但是變化不大。風(fēng)味發(fā)酵乳的感官評分呈先升高后降低的趨勢。當(dāng)紅棗汁添加量為6%～8%時，感官評分隨之增高；當(dāng)紅棗汁添加量為8%時，感官評分為最高；當(dāng)紅棗汁添加量＞8%之后，感官評分有所下降。因此，紅棗汁最適添加量為8%。由圖1c可知，隨著白砂糖添加量增大，風(fēng)味發(fā)酵乳的感官評分及蛋白質(zhì)含量均呈先升高后降低的趨勢；當(dāng)白砂糖的添加量為4%～7%時，感官評分及蛋白質(zhì)含量隨之增加；當(dāng)白砂糖的添加量為7%時，感官評分及蛋白質(zhì)含量均為最高；當(dāng)白砂糖的添加量＞7%之后，感官評分及蛋白質(zhì)含量均有所下降。因此，選擇白砂糖的最佳添加量為7%。由圖1d可知，隨著菌種接種量增大，風(fēng)味發(fā)酵乳的感官評分及蛋白質(zhì)含量均呈先升高后降低的趨勢；當(dāng)菌種的接種量為0.001%～0.003%時，感官評分及蛋白質(zhì)含量隨之增加；當(dāng)菌種的接種量為0.003%時，感官評分及蛋白質(zhì)含量均為最高；當(dāng)菌種的接種量＞0.003%之后，感官評分及蛋白質(zhì)含量均有所下降。因此，選擇菌種最佳接種量為0.003%。由圖1e可知，隨著發(fā)酵時間的延長，風(fēng)味發(fā)酵乳的感官評分及蛋白質(zhì)含量均呈先升高后降低的趨勢。當(dāng)發(fā)酵時間為4～5 h時，感官評分及蛋白質(zhì)含量隨之增加；當(dāng)發(fā)酵時間為5 h時，感官評分及蛋白質(zhì)含量均為最高；發(fā)酵時間＞5 h之后，感官評分及蛋白質(zhì)含量均有所下降。因此，選擇最佳發(fā)酵時間為5 h。

圖1 各因素對黑枸杞紅棗風(fēng)味發(fā)酵乳感官品質(zhì)及蛋白質(zhì)含量的影響Fig.1 Effect of various factors on sensory evaluation and protein contents of fermented milk with black wolfberry and jujube flavor

2.2 模糊數(shù)學(xué)評價法分析結(jié)果

采用模糊數(shù)學(xué)評價和響應(yīng)面結(jié)合優(yōu)化黑枸杞紅棗風(fēng)味發(fā)酵乳，各因素感官評價的投票結(jié)果見表3。

表3 黑枸杞紅棗風(fēng)味發(fā)酵乳感官評價投票結(jié)果Table 3 Voting results of sensory evaluation of fermented milk with black wolfberry and jujube flavor

將表3中的數(shù)據(jù)建立模糊評價矩陣，將每個樣品的各自影響因素的得票數(shù)除以總的參與評價人數(shù)10即可得到各個模糊矩陣M1～M29，以1號產(chǎn)品為例：滋味的評價人數(shù)分別為：8人選優(yōu)，2人選良，0人選中，0人選差，則M氣味=（0.5，0.4，0.1，0），M滋味=（0.6，0.2，0.2，0），M狀態(tài)=（0.4，0.4，0.2，0），同理M色澤=（0.5，0.3，0.1，0.1），由此可得到矩陣M1：

根據(jù)模糊數(shù)學(xué)計算原理和權(quán)重集W=（W1，W2，W3，W4）=（0.29，0.31，0.20，0.20），按照矩陣相乘方法，感官評價結(jié)果T1=W×M1=（0.511，0.318，0.151，0.02），對于V中的各個量，分別賦予其相應(yīng)分值，優(yōu)V1、良V2、中V3、差V4分別為9分、7分、5分、3分，V中各個值分別乘以相應(yīng)分值，再相加即可得到1號感官評分，即1號樣品感官評分：Y1=0.511×9+318×7+0.151×5+0.02×3=7.640分，同理可以計算出2～29號樣品的感官得分。

由計算結(jié)果可知各發(fā)酵乳感官評分分都介于7.0～9.0分，將評分劃分等級分值區(qū)間，8.5～9.0分為“優(yōu)”，8.0～8.5分為“良”，7.5～8.0分為“中”，＜7.5分為“差”。其中4#號樣品的模糊數(shù)學(xué)評價感官評分最高，為8.8分，屬于等級“優(yōu)”；6#、12#、16#、17#、19#、21#、23#、25#、27#、28#樣品的模糊數(shù)學(xué)感官評分為8.2分、8.1分、8.3分、8.5分、8.4分、8.0分、8.0分、8.1分、8.2分、8.3分屬于等級“良”；1#、2#、3#、8#、9#、11#、13#、22#、24#、26#樣品的模糊數(shù)學(xué)評價感官評分7.6分、7.6分、7.9分、7.8分、7.9分、7.6分、7.6分、7.8分、7.7分、7.6分，屬于等級“中”；7#、15#、18#、20#、29#樣品的模糊數(shù)學(xué)評價感官評分為7.4分、7.2分、7.4分、7.4分、7.4分，屬于等級“差”。29個發(fā)酵乳樣品模糊數(shù)學(xué)評價優(yōu)劣排序為：4#＞5#分＞10#，14#＞17#＞19#＞28#＞16#＞6#＞27#＞25#＞12#＞23#＞21#＞3#＞9#＞22#＞8#＞24#＞13#＞1#，11#＞26#＞22#＞7#＞29#18#＞20#＞15#。采用模糊數(shù)學(xué)評價法得到的感官評分最高的是4#樣品，其工藝條件與響應(yīng)面優(yōu)化法的試驗結(jié)果相近。利用模糊綜合評價法對影響黑枸杞紅棗風(fēng)味發(fā)酵乳品質(zhì)的工藝條件進行計算和分析，能夠降低人為主觀因素影響，適合區(qū)分多樣品感官質(zhì)量評價差異。

2.3 發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，固定黑枸杞汁添加量為11%，以紅棗汁添加量（A）、白糖添加量（B）、菌種添加量（C）和發(fā)酵時間（D）為影響因素，以感官評分（Y1）和蛋白質(zhì)含量（Y2）為響應(yīng)值，采用Design-Expert10.0.7軟件設(shè)計4因素3水平響應(yīng)面試驗，Box-Behnken試驗設(shè)計結(jié)果見表4，方差分析結(jié)果見表5。

對表4試驗數(shù)據(jù)結(jié)果回歸擬合，分別得到回歸方程為：

表4 Box-Behnken試驗設(shè)計結(jié)果Table 4 Results of Box-Behnken experiments design

由表5可知，模型的P＜0.000 1，說明試驗所采用的二次模型是極顯著的。失擬項P=0.652 3＞0.05，說明對模型是有益的，模型據(jù)有高度可靠性[19-20]。對試驗?zāi)Ｐ偷目尚哦冗M行分析，得到?jīng)Q定系數(shù)R2=0.942 5，表明響應(yīng)值的變化94.25%來自于所選因素，方程的擬合度較好，方程的調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.884 9，說明有88.49%的試驗符合該模型，與實際情況符合良好[21-24]。變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）=1.87%，在此試驗中說明這個模型方程能較好的反映出其真實性，方程模型具有良好重現(xiàn)性[23]。一次項B、C及交互項BD、二次項A2、B2、C2、D2對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），一次項A、D及二次項AB對結(jié)果影響顯著（P＜0.05）。根據(jù)F值，各因素對試驗結(jié)果影響的先后次序為B＞C＞A＞D。

表5 以感官評分為響應(yīng)值的回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis of regression model using sensory score as response value

續(xù)表

紅棗汁添加量（A）、白砂糖添加量（B）、菌種接種量（C）、發(fā)酵時間（D）對黑枸杞紅棗發(fā)酵乳感官品質(zhì)的影響的響應(yīng)面及等高線見圖2。

圖2 各因素交互作用對黑枸杞紅棗發(fā)酵乳感官評分影響的響應(yīng)面及等高線Fig.2 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on sensory score of fermented milk withblack wolfberry and jujube flavor

響應(yīng)面越陡峭，等高線越密集，表明該因素對結(jié)果影響越顯著[25]。由圖2可知，BD響應(yīng)面較陡峭，影響最顯著，這與方差分析結(jié)果一致。

利用Design-Expert 10.0.7對感官評價和蛋白質(zhì)回歸方程進行回歸分析，黑枸杞紅棗發(fā)酵乳的最佳發(fā)酵工藝為：紅棗汁添加量6.6%，白砂糖添加量6.43%，菌種添加量0.002 4%，發(fā)酵時間4.88 h，感官評分理論值為8.78分，蛋白質(zhì)含量理論值為3.15 g/100 g?？紤]到實際工藝條件，調(diào)整最佳制作工藝條件為紅棗汁添加量為6%，菌種接種量為0.002 4%，發(fā)酵時間5 h，白砂糖添加量為6%。在此優(yōu)化條件下進行3次平行驗證試驗，感官評分實際值為8.72分；蛋白質(zhì)含量實際值為3.16 g/100 g，與預(yù)測值接近，說明該模型可以用于優(yōu)化黑枸杞紅棗發(fā)酵乳發(fā)酵工藝，確定其最佳發(fā)酵工藝為：純牛奶76%，黑枸杞汁11%，紅棗汁添加量為6%，菌種接種量為0.002 4%，發(fā)酵時間5 h，白砂糖添加量為6%，增稠劑0.06%。

2.4 黑枸杞紅棗發(fā)酵乳理化及微生物指標

黑枸杞紅棗風(fēng)味發(fā)酵乳脂肪含量為3.05 g/100 g，蛋白質(zhì)含量為3.20 g/100 g，酸度78.0 °T，亞硝酸鹽含量為0.006 28 g/100 g，非脂乳固形物含量為8.6 g/100 g，灰分0.68 g/100 g，總固形物含量17.76 g/100 g；乳酸菌數(shù)為2.21×109CFU/mL，大腸菌群及致病菌均未檢出；均符合GB 19302—2010《發(fā)酵乳》的要求。

3 結(jié)論

以黑枸杞、紅棗及鮮牛乳為主要原材料制備發(fā)酵乳，以感官評價和蛋白質(zhì)為評價指標，利用模糊數(shù)學(xué)感官評價法進行感官評價，采用單因素及響應(yīng)面試驗優(yōu)化最佳發(fā)酵工藝為：純牛奶76%，黑枸杞汁11%，紅棗汁添加量6%，菌種接種量0.002 4%，發(fā)酵時間5 h，白砂糖添加量6%，增稠劑0.06%。在此優(yōu)化工藝條件下，發(fā)酵乳的感官評分為8.72分，蛋白質(zhì)含量為3.16 g/100 g，其感官、理化及微生物指標均符合相關(guān)國標要求。這款新型的風(fēng)味發(fā)酵型乳飲料采用了紅棗酸甜細膩的淡香和黑枸杞中的原花青素，利用了最佳輔料的輔助，呈現(xiàn)淺紅咖啡色，組織狀態(tài)穩(wěn)定，無乳清析出，不分層，口感流順，酸甜可口，從而提升了發(fā)酵乳的品質(zhì)功能。