FCGR3A和FCGR3B基因拷貝數(shù)變異對(duì)HBV感染轉(zhuǎn)歸的影響

李昊天， 王同同， 李緒桐， 郜玉峰

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 感染病科， 合肥 230022

HBV感染后的臨床轉(zhuǎn)歸與病毒、宿主免疫及宿主遺傳因素密切相關(guān)[1]，慢性HBV感染可誘導(dǎo)體內(nèi)固有免疫和特異性免疫反應(yīng)，常伴有肝損傷和炎癥[2]。由病毒復(fù)制引起的持續(xù)或反復(fù)的炎癥增加了慢性乙型肝炎(CHB)發(fā)展為肝衰竭甚至肝癌的風(fēng)險(xiǎn)[3]。目前對(duì)HBV感染機(jī)制的認(rèn)識(shí)還存在許多不足，其結(jié)果受多種因素的影響，包括自我限制的消除或持續(xù)耐受。除了與病毒本身、宿主的免疫反應(yīng)、年齡和性別有關(guān)外，越來越多的證據(jù)[4-5]表明人類遺傳變異中拷貝數(shù)變異(copy number variant，CNV)可能在HBV感染慢性化中起作用。以往綜合分析的研究[6]表明，IgG Fcγ受體(FcγR)的表達(dá)與HBV感染的不同免疫階段有關(guān)。FcγRⅢA和FcγRⅢB編碼的免疫球蛋白G Fc段受體Ⅲa(Fc gamma receptors 3A，F(xiàn)CGR3A)和免疫球蛋白G Fc段受體Ⅲb(Fc gamma receptors 3B，F(xiàn)CGR3B)基因位于CNV的染色體1q23.3位點(diǎn)，這個(gè)位點(diǎn)可改變相應(yīng)受體的表達(dá)和對(duì)抗原的免疫效力[7-8]。免疫細(xì)胞上活化的FcγRⅢ可參與調(diào)節(jié)一系列免疫應(yīng)答，如清除免疫復(fù)合物和抗體依賴的細(xì)胞毒性作用，并進(jìn)一步促進(jìn)炎癥反應(yīng)[9]。在復(fù)雜的免疫過程中產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子進(jìn)一步影響HBV感染的結(jié)果[10]。FCGR3A和FCGR3B基因 CNV是否通過改變基因表達(dá)水平從而影響HBV感染后的轉(zhuǎn)歸尚不清楚。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2014年1月—2018年12月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院和第二附屬醫(yī)院感染病科住院和門診慢性HBV感染患者841例，其中CHB患者444例，肝硬化(LC)274例，肝細(xì)胞癌(HCC)123例。另外再納入性別、年齡、種族相匹配的296例自限性HBV感染者。所有病例診斷均符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》[11]。慢性HBV感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)：HBsAg陽(yáng)性6個(gè)月以上。自限性HBV感染者的入選標(biāo)準(zhǔn)：抗-HBc和抗-HBs陽(yáng)性，HBsAg陰性，血清ALT水平正常，HBV DNA低于檢測(cè)下限，且均未接種乙型肝炎疫苗。排除標(biāo)準(zhǔn)：酒精或非酒精性因素所致脂肪肝、自身免疫性肝病、合并HIV或其他嗜肝病毒感染(甲、丙、丁、戊)、不明原因肝功能障礙及其他嚴(yán)重全身性疾病。

1.2 觀察指標(biāo) 采集患者的年齡、性別、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)包括ALT、AST、HBV DNA、HBeAg等指標(biāo)。使用bs330全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)ALT(正常范圍9～50 U/L)、AST(正常范圍15～40 U/L)；在ABI7500熒光定量PCR儀上使用HBV DNA定量檢測(cè)試劑盒進(jìn)行HBV DNA的檢測(cè)；HBV DNA檢測(cè)下限為500 IU/mL。采用酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(ELISA)檢測(cè)HBV血清學(xué)指標(biāo)。

1.3 基因組DNA的提取和CNV的檢測(cè) 每位患者采集5 mL全血置于抗凝管中。根據(jù)QIAGEN試劑盒(QIAGEN, Hilden, Germany)的說明書進(jìn)行基因組DNA提取，提取后置于-80 ℃保存，用于后續(xù)的DNA基因型檢測(cè)。FCGR3的基因拷貝數(shù)采用AccuCopy試劑盒(上海天昊生物科技有限公司)進(jìn)行定量，采用文獻(xiàn)[12]報(bào)道的方法，合成FCGR3特異性引物和競(jìng)爭(zhēng)模板(表1)，根據(jù)要求將一定量的競(jìng)爭(zhēng)DNA與適量樣本DNA混勻，進(jìn)行多重?zé)晒飧?jìng)爭(zhēng)性PCR擴(kuò)增，采用毛細(xì)管電泳法分離DNA片段，采用 GeneMapper 4.0軟件分析。通過目的基因與內(nèi)參基因S/C值比較，進(jìn)行均一化處理，得到FCGR3基因拷貝數(shù)。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和真實(shí)性。

表1 FCGR3A和FCGR3B基因擴(kuò)增引物

2 結(jié)果

2.1 兩組HBV感染者基線特征比較 慢性HBV感染組平均(44.11±15.87)歲，自限性HBV感染組平均(42.13±15.27)歲；兩組男女性別比分別為673∶168和224∶72，兩組年齡(t=1.870,P=0.062)、性別(χ2=2.486,P=0.115)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

依據(jù)HBV慢性感染后不同疾病進(jìn)展?fàn)顟B(tài)將患者分為CHB組、LC組和HCC組。3組間性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.180)，年齡、ALT、AST、HBeAg差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(表2)。

表2 慢性HBV感染者不同分組的基線特征

2.2 兩組HBV感染者FCGR3A和FCGR3B拷貝數(shù)的分布 對(duì)841例慢性HBV感染者和296例自限性HBV感染者的FCGR3A和FCGR3B基因 CNV進(jìn)行定量分析。將得到的拷貝數(shù)量化后，受試者的頻率分布范圍為2～8拷貝。CNV的中位數(shù)為4拷貝，對(duì)于FCGR3A, 4拷貝在慢性HBV感染組和自限性HBV感染組中的比例分別為65.5%和62.2%，而FCGR3B分別為64.5%和62.9%(表3)。

表3 兩組HBV感染者FCGR3A和FCGR3B拷貝數(shù)分布情況

2.3 兩組HBV感染者FCGR3A和FCGR3B基因拷貝數(shù)的分布頻率比較 根據(jù)CNV的中位數(shù)將所有樣本分為低拷貝(≤3)、中拷貝(=4)和高拷貝(≥5)三類。分析顯示，F(xiàn)CGR3A基因CNV在慢性HBV感染組和自限性HBV感染組之間的頻率分布有顯著性差異(χ2=11.406，P=0.003)，這與FCGR3B一致(χ2=19.143，P<0.001)(表4)。

表4 兩組HBV感染組FCGR3A和FCGR3B拷貝數(shù)分布頻率差異

2.4 慢性HBV感染組不同疾病進(jìn)展階段患者FCGR3A和FCGR3B基因拷貝數(shù)分布頻率比較 CHB組、LC組、HCC組中FCGR3A、FCGR3B CNV分布頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表5)。HBeAg血清轉(zhuǎn)換與否與機(jī)體的免疫功能密切相關(guān)，將所有慢性HBV感染者按照HBeAg狀態(tài)進(jìn)行分為陽(yáng)性組和陰性組，比較FCGR3基因CNV在兩組間的分布差異，結(jié)果顯示，F(xiàn)CGR3基因CNV在HBeAg陽(yáng)性組和陰性組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P值均>0.05)(表6)。

表5 慢性HBV感染組不同疾病進(jìn)展患者FCGR3基因拷貝數(shù)分布頻率比較

表6 慢性HBV感染組不同HBeAg狀態(tài)患者FCGR3 基因拷貝數(shù)分布頻率比較

2.5 FCGR3 CNV在慢性HBV感染后轉(zhuǎn)歸中的作用 將年齡、性別、拷貝數(shù)作為自變量，患者HBV感染后的轉(zhuǎn)歸(急性/慢性)作為因變量，進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析。其中FCGR3A基因和FCGR3B基因拷貝數(shù)減少或缺失增加HBV感染者慢性化的風(fēng)險(xiǎn)，OR及(95%CI)分別為0.621(0.513～0.752)、0.594(0.491～0.719)，結(jié)果提示FCGR3A基因和FCGR3B基因拷貝數(shù)目減少或缺失是HBV感染慢性化的危險(xiǎn)因素(表7)。

表7 FCGR3A和FCGR3B CNV與慢性HBV感染后轉(zhuǎn)歸的關(guān)系

3 討論

CNV可以造成宿主基因拷貝數(shù)的改變，并通過基因序列位置的改變影響基因的表達(dá)，并進(jìn)一步影響疾病的易感性和疾病進(jìn)展[13]。越來越多的報(bào)道[14-16]證明CNV在人類感染和自身免疫性疾病中起著至關(guān)重要的作用，包括HIV-1感染、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和潰瘍性結(jié)腸炎。既往研究[17]表明CNV影響HBV感染的結(jié)果。慢性HBV感染可誘導(dǎo)體內(nèi)固有免疫和特異性免疫反應(yīng)，F(xiàn)CGR3基因編碼的FcγRⅢ可介導(dǎo)固有免疫和適應(yīng)性免疫的多種免疫功能。在一些自身免疫性疾病和炎癥性疾病中已經(jīng)檢測(cè)到FCGR3 CNV，但其在HBV感染中的特異性作用尚不十分清楚。

既往研究[18]表明，F(xiàn)cγR介導(dǎo)的抗體效應(yīng)功能在病毒持續(xù)感染過程中受損或被抑制。Jin等[6]發(fā)現(xiàn)HBV感染免疫耐受期FcγRⅢB的表達(dá)低于清除期的表達(dá)，免疫耐受階段可能會(huì)導(dǎo)致病毒感染的持續(xù)存在。此外，血清IgG水平升高是慢性感染性疾病的臨床特征，與疾病進(jìn)展密切相關(guān)[19]。FCGR識(shí)別并結(jié)合免疫復(fù)合物(immune complexs，IC)，這是由IgG抗體與其同種抗原結(jié)合形成的。Willcocks等[20]證實(shí)了FCGR3B CNV與受體的表達(dá)和IC的攝取之間的顯著相關(guān)性。另一項(xiàng)研究[21]證實(shí)，F(xiàn)CGR3B基因表達(dá)降低與循環(huán)IC清除率降低有關(guān)，這將促進(jìn)炎癥性疾病的發(fā)展。本研究通過對(duì)HBV感染后不同轉(zhuǎn)歸患者外周血FCGR3基因的CNV分析發(fā)現(xiàn)，自限性HBV感染組與慢性HBV感染組之間在FCGR3基因拷貝數(shù)分布頻率上存在差異，與自限性HBV感染組相比，慢性HBV感染組FCGR3A基因和FCGR3B基因的拷貝數(shù)減少或缺失的比例更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本文因納入因素有限，模型擬合度較低(FCGR3A：R2=0.038，F(xiàn)CGR3B：R2=0.045)，但研究模型分析對(duì)疾病的轉(zhuǎn)歸和病程進(jìn)展具有一定的價(jià)值。

在HBV感染不同免疫狀態(tài)的基因和通路研究中，熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)免疫清除期患者FcγRⅢA和FcγRⅢB的表達(dá)水平明顯高于免疫耐受期HBV感染者和健康對(duì)照[6]。一般來說，免疫清除期反映了對(duì)HBV的免疫應(yīng)答[22]，F(xiàn)cγRⅢA可以通過免疫受體酪氨酸基活化基元(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)誘導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，ITAM與FcγR鏈有關(guān)，當(dāng)IgG濃度達(dá)到一定水平時(shí)，ITAM以一種特殊的構(gòu)象傳導(dǎo)抑制信號(hào)，阻止炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，這有助于控制炎癥疾病的發(fā)生發(fā)展[23-24]。對(duì)于FcγRⅢB，認(rèn)為另一種可能的機(jī)制是FCGR3B的高拷貝數(shù)和具有抗炎活性的循環(huán)可溶性FcγR水平升高之間存在相關(guān)性[20]。

綜上所述，F(xiàn)CGR3A基因和FCGR3B基因拷貝數(shù)目減少或缺失是HBV感染慢性化的遺傳易感因素之一，但與疾病進(jìn)展無關(guān)。FCGR3基因CNV在HBV感染中的具體機(jī)制值得進(jìn)一步探討。由于本研究?jī)H涉及中國(guó)漢族患者，這些發(fā)現(xiàn)是否與其他民族慢性HBV感染的結(jié)果一致有待進(jìn)一步研究。

倫理學(xué)聲明：本研究于2012年2月18日通過安徽醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，批號(hào)：2012102。所有患者均簽署知情同意書。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：李昊天、王同同負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析及文稿撰寫；李緒桐負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)收集及文獻(xiàn)檢索；郜玉峰負(fù)責(zé)文稿的構(gòu)思、潤(rùn)色和最后定稿。