周 荃， 李金強， 黎曉武

長沙市第一醫(yī)院 感染科， 長沙 410000

隨著生活水平的提高與飲食習(xí)慣的改變，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)流行率逐漸上升，已成為世界上最常見的慢性肝病之一，在亞洲國家患病率約為25%[1]，而在我國成年人中，患病率達(dá)29.2%[2]。NAFLD是一種與胰島素功能障礙、遺傳密切相關(guān)的代謝性肝損傷，是排除了酒精，由已知的其他肝損傷因素引發(fā)的肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過度沉積所導(dǎo)致的肝臟疾病[3]。NAFLD不僅造成肝損傷，據(jù)研究[4]，其對心腦血管、內(nèi)分泌、泌尿系統(tǒng)亦產(chǎn)生影響，導(dǎo)致患者心腦血管疾病、2型糖尿病以及慢性腎病患病風(fēng)險明顯升高。

依據(jù)NAFLD嚴(yán)重程度，可分為非酒精性單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化及肝細(xì)胞癌[5]。非酒精性單純性脂肪肝通常被視為良性非進(jìn)展性疾病，而NASH可逐漸發(fā)展至肝纖維化、肝硬化乃至肝細(xì)胞癌，故而NASH逐漸成為近年來研究的熱點和難點。

維生素D起初因調(diào)節(jié)鈣磷代謝而被人們熟知，之后有大量研究[6-7]發(fā)現(xiàn)其能夠通過調(diào)節(jié)不同基因的表達(dá)而調(diào)控細(xì)胞增殖與分化，維生素D缺乏不僅導(dǎo)致骨骼相關(guān)疾病，而且影響著代謝綜合征、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病事件的發(fā)生。有研究[8]指出，維生素D水平與肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積、肝細(xì)胞壞死、肝纖維化程度密切相關(guān)。但也有學(xué)者[9]提出了不同觀點，認(rèn)為維生素D缺乏反而挽救了高脂膳食誘導(dǎo)的肝臟脂肪積累及脂肪酸代謝關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄。脂肪組織的內(nèi)分泌功能十分活躍，能夠分泌IL-18等細(xì)胞因子，IL-18依靠強大的生物活性能夠直接損害肝細(xì)胞，在NASH中逐漸被人們重視[10]；而IL-37作為近年新發(fā)現(xiàn)的抗炎因子在維持免疫平衡中發(fā)揮重要作用。ALT、TBil、TC、TG已被證實為脂肪性肝病發(fā)生的獨立影響因素[11]，因此，本研究通過比較不同1,25(OH)2D3水平下NASH患者ALT、AST、TBil、TC、TG水平及FIB-4指數(shù)、肝臟病理分級以闡明維生素D缺乏與肝纖維化及病情嚴(yán)重程度之間的關(guān)系，并檢測IL-18、IL-37水平以探究NASH可能的發(fā)生機制，為防治NASH提供更多參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2020年1月—2021年10月冬春季在本院感染科住院治療的NASH患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡18～60歲，無飲酒史；(2)符合《非酒精性脂肪性肝病防治指南(2018年更新版)》[12]診斷標(biāo)準(zhǔn)；(3)臨床資料、數(shù)據(jù)完善無缺失。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)病毒性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎、藥物性肝炎、肝豆?fàn)詈俗冃缘绕渌驅(qū)е赂螕p傷者；(2)使用激素或免疫抑制劑；(3)合并惡性腫瘤、甲狀腺疾病、腎病、炎癥性腸病、庫欣綜合征等導(dǎo)致脂肪肝的特殊情況。

1.2 研究方法

1.2.1 觀察指標(biāo) 入組時記錄患者年齡、性別，測定實驗室指標(biāo)包括1,25(OH)2D3、ALT、AST、TBil、TC、TG、IL-18、IL-37、PLT。

1.2.2 研究方法 所有受試者在入組時抽取5 mL空腹靜脈血，以3000 r/min離心5 min，收集血清，儲存在EDTA試管中。通過串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行1,25(OH)2D3定性和定量檢測[美國AB公司液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(API400)]。使用全自動生化分析儀(美國BECKMAN公司)檢測血清ALT、AST、TBil水平。采用ELISA法檢測血清TC、TG、IL-18、IL-37水平(美國PD公司)，使用美國Thermo公司生產(chǎn)的MK3酶標(biāo)儀測定450 nm處的A值。采用血細(xì)胞計數(shù)儀測量PLT水平。

1.2.3 分組 美國國家科學(xué)院醫(yī)學(xué)研究所定義血清1,25(OH)2D3缺乏的標(biāo)準(zhǔn)為<20 ng/mL，不足為20～30 ng/mL，充足為>30 ng/mL[13]。根據(jù)血清1,25(OH)2D3水平將受試者分為3組：A組為1,25(OH)2D3缺乏組(<20 ng/mL)；B組為1,25(OH)2D3不足組(20～30 ng/mL)；C組為1,25(OH)2D3充足組(>30 ng/mL)。

1.2.4 FIB-4指數(shù)計算 FIB-4=年齡(歲)×AST(U/L)/[PLT(109/L)×ALT(U/L)1/2]

1.2.5 肝組織活檢 在B超引導(dǎo)下，使用滬產(chǎn)160 mm×16G穿刺針，在患者呼氣末屏住呼吸時負(fù)壓吸取長度超過1 cm的肝組織，經(jīng)10%中性甲醛固定、石蠟包埋，切片為5 μm后行HE染色，依據(jù)Kleiner等[14]及張榮春等[15]建議的肝臟病理分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 共納入NASH患者120例，其中男69例，女51例，平均年齡(39.71±10.49)歲。A、B、C 3組各40例，3組患者的年齡和性別比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05)(表1)。

2.2 3組患者1,25(OH)2D3水平及肝功能比較 結(jié)果顯示，與A組比較，B、C兩組患者1,25(OH)2D3水平均顯著升高(P值均<0.05)，而ALT、AST、TBil水平均顯著下降(P值均<0.05)。與B組比較，C組患者1,25(OH)2D3水平升高，ALT、AST水平下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)(表1)。

2.3 3組患者FIB-4指數(shù)及TC、TG、IL-18、IL-37水平比較 結(jié)果顯示，與A組比較，B、C兩組患者FIB-4指數(shù)和TC、TG、IL-18水平均明顯降低(P值均<0.05)，IL-37水平明顯升高(P<0.05)。與B組比較，C組患者FIB-4指數(shù)和TC、TG、IL-18水平均降低，IL-37水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)(表1)。

表1 3組患者觀察指標(biāo)比較

2.4 1,25(OH)2D3與ALT、AST、TBil、TC、TG、IL-18、IL-37水平及FIB-4指數(shù)的相關(guān)性分析 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，1,25(OH)2D3與ALT(r=-0.84，P<0.001)、AST(r=-0.77，P<0.001)、TBil(r=-0.32，P<0.001)、TC(r=-0.45，P<0.001)、TG(r=-0.42，P<0.001)、IL-18(r=-0.40，P<0.001)及FIB-4指數(shù)(r=-0.62，P<0.001)均呈負(fù)相關(guān)，而與IL-37(r=0.59，P<0.001)呈正相關(guān)(圖1)。

圖1 1,25(OH)2D3與ALT、AST、TBil、TC、TG、IL-18、IL-37水平及FIB-4指數(shù)的相關(guān)性

2.5 3組患者肝臟病理組織學(xué)比較 與A組相比，B、C組中與重度脂肪變、橋接纖維化與早期肝硬化、橋接壞死與大片壞死比例下降，且相較于B組，C組比例更低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)(表2)。光鏡下可見A組患者肝細(xì)胞廣泛氣球樣變，肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量大泡性為主的脂滴，肝板排列紊亂，大量淋巴細(xì)胞浸潤，局灶橋接纖維化(圖2a)；B組多數(shù)為點灶壞死，門靜脈周圍纖維化，脂滴大小不等，少量中性粒細(xì)胞浸潤，部分肝細(xì)胞氣球樣變，肝小葉結(jié)構(gòu)尚清晰(圖2b)；C組少量肝細(xì)胞氣球樣變，局灶竇周纖維化，少數(shù)點灶壞死，肝細(xì)胞胞質(zhì)可見少量脂滴，大多數(shù)為大泡性，部分為小泡性或混合性(圖2c)。

表2 3組患者的肝臟病理組織學(xué)比較

注：a，A組；b，B組；c，C組。

3 討論

在世界范圍內(nèi)，一般人群中NAFLD患病率可達(dá)20%～30%[16]，其中NASH作為NAFLD的嚴(yán)重類型是心血管疾病的獨立危險因素[17]。近年來，NASH發(fā)病率上升了5倍，且更多發(fā)生于年輕人，預(yù)測2030年德國NASH發(fā)病率將進(jìn)一步增加15%[18]，成為肝移植的最常見適應(yīng)證。肝纖維化程度是反映NAFLD預(yù)后的主要標(biāo)志[19]，也可以用來區(qū)分非酒精性單純性脂肪肝和NASH，因此肝纖維化檢測在NASH患者中具有重要意義。已有FibroScan、FIB-4指數(shù)、APRI等無創(chuàng)方式來診斷及預(yù)測肝纖維化程度，但肥胖癥嚴(yán)重影響了FibroScan的檢測成功率，25%的患者無法獲取準(zhǔn)確的肝臟彈性值[20]，而FIB-4指數(shù)因易獲得，準(zhǔn)確性與FibroScan相當(dāng)，在幾種無創(chuàng)纖維化檢測方法中占據(jù)一定優(yōu)勢。目前，肝穿刺活檢病理分級為評估脂肪變、纖維化及炎癥程度的金標(biāo)準(zhǔn)，因此，本研究選取FIB-4指數(shù)及肝臟病理組織學(xué)作為評判肝纖維化程度的指標(biāo)。

維生素D作為一種多效性激素除了參與鈣穩(wěn)態(tài)之外，也參與免疫炎癥和代謝過程。已有研究[21-22]證實，維生素D缺乏與胰島素抵抗相關(guān)疾病密不可分，如2型糖尿病、NAFLD及代謝綜合征。在以往的研究中，學(xué)者們試圖回答補充維生素D是否可以改善NAFLD，但結(jié)果存在爭議。例如，Dabbaghmanesh等[23]對NAFLD患者及轉(zhuǎn)氨酶正常的非糖尿病維生素D缺乏患者補充維生素D3(50 000 IU/周)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與安慰劑相比，補充維生素D3未顯著改變肝酶水平；Geier等[24]研究中NASH患者每日補充2100 IU維生素D3，48周后NASH患者的血清ALT水平顯著降低。針對這一問題，本研究擬探討維生素D水平與肝纖維化及病情嚴(yán)重程度之間的關(guān)系，為后期NASH治療提供新的線索。

1,25(OH)2D3是人體內(nèi)維生素D的最終活性形式，其半衰期為2～3周，這些條件決定了1,25(OH)2D3能夠作為評估人體維生素D含量的相對穩(wěn)定指標(biāo)。對大部分人而言，獲取維生素D的途徑來源于陽光照射，已有眾多研究[25-26]表明，適當(dāng)?shù)娜照漳軌蚋纳凭S生素D缺乏性佝僂病、骨質(zhì)疏松等，而維生素D的生成量與日照中紫外線照射時長及強度密切相關(guān)，夏季和秋季相對日照時間較長、強度較大，為避免日照時長和強度對1,25(OH)2D3水平的影響，本試驗選擇冬春季的住院患者為研究對象，提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。本研究結(jié)果顯示，1,25(OH)2D3水平越低，ALT、AST、TBil、TC、TG水平及FIB-4指數(shù)越高，肝細(xì)胞損傷范圍越大，胞質(zhì)內(nèi)脂肪沉積越多，表明維生素D缺乏的NASH患者肝損傷、肝纖維化程度更明顯，1,25(OH)2D3水平可以在一定程度上反映病情進(jìn)展情況，NASH患者補充維生素D可提高脂肪清除能力，減少脂質(zhì)沉積，減輕肝損傷，減慢肝纖維化進(jìn)程。

IL-18致使肝臟微循環(huán)受損，逐步加重肝細(xì)胞線粒體破環(huán)，導(dǎo)致肝細(xì)胞脂質(zhì)攝取和肝細(xì)胞炎癥因子的生成增加，亦可調(diào)節(jié)自然殺傷細(xì)胞分化，同時誘導(dǎo)多種多肽介質(zhì)的產(chǎn)生，引起局部炎癥反應(yīng)，還能夠刺激巨噬細(xì)胞生成一氧化氮，加強誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的活性，誘導(dǎo)增強溶性細(xì)胞間黏附因子1的表達(dá)，促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡壞死[27]。IL-37降低肝細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子和趨化因子的能力，以及減少中性粒細(xì)胞激活和呼吸爆發(fā)，直接保護(hù)肝細(xì)胞免受氧化誘導(dǎo)的損傷[28]。本研究證實，隨著1,25(OH)2D3水平升高，肝損傷減輕，IL-18水平逐漸下降，而IL-37水平上升，提示NASH患者的肝纖維化及病情嚴(yán)重程度與IL-18高表達(dá)、IL-37低表達(dá)有關(guān)，炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激促進(jìn)了肝損傷的進(jìn)展，通過補充維生素D可能減輕炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激。

綜上所述，維生素D水平與NASH患者肝纖維化及病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)，可以作為評估肝損傷程度的重要指標(biāo)，同時為干預(yù)NASH提供新的方向，適時補充維生素D有望減輕肝損傷，減慢肝纖維化進(jìn)程，但合適的補充劑量、時間及療程還有待進(jìn)一步探討。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2019年7月1日經(jīng)由長沙市第一醫(yī)院倫理委員會審批，批號：20190613030，所納入患者均簽署知情同意書。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：周荃負(fù)責(zé)實施研究過程，采集整理數(shù)據(jù)，設(shè)計論文框架，起草論文，修訂論文，終審論文；李金強負(fù)責(zé)調(diào)研整理文獻(xiàn)，提出研究選題，設(shè)計研究方案；黎曉武負(fù)責(zé)統(tǒng)計分析，提供指導(dǎo)性支持。