楊 提，王 雪，楊云云，丁 楠，王學(xué)彬,4#，陳井霞#

(1.上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院藥劑科，上海200135； 2.海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，上海 200433； 3.沈陽藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，沈陽 110016； 4.復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院生物藥物系，上海 201203)

慢性膽囊炎一般是由長期存在的膽囊結(jié)石或急性膽囊炎反復(fù)發(fā)作遷延不愈導(dǎo)致的膽囊慢性炎癥。根據(jù)膽囊內(nèi)是否存在結(jié)石，分為結(jié)石性膽囊炎和非結(jié)石性膽囊炎。目前，慢性膽囊炎以西藥及手術(shù)治療等為主，但結(jié)石殘余率、復(fù)發(fā)率高，手術(shù)并發(fā)癥及再手術(shù)的發(fā)生風(fēng)險較高。有研究結(jié)果表明，中藥治療慢性膽囊炎的臨床效果顯著且遠期療效可觀[1]。中藥膽寧片的主要成分為大黃、虎杖、青皮和山楂等7味中藥，具有消炎利膽、防石護肝、清熱通下之功效，對于慢性膽囊炎具有較好的治療效果，是為數(shù)不多的具有防石溶石作用的純中藥制劑。雖然膽寧片在治療慢性膽囊炎和預(yù)防膽固醇結(jié)石形成中有一定的療效，但其作用靶點仍不明確[2]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析是在系統(tǒng)生物學(xué)與多向藥理學(xué)的基礎(chǔ)上提出的新思想、新策略，能夠系統(tǒng)綜合地觀察藥物對疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)和影響，尤其適用于“多成分-多靶點-多通路”的中藥藥理學(xué)研究[3]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探討膽寧片治療慢性膽囊炎的藥物作用靶點，為膽寧片后續(xù)藥理作用研究提供基礎(chǔ)理論。

1 資料與方法

1.1 膽寧片活性成分及潛在靶點獲取

膽寧片由大黃、虎杖、青皮、陳皮、郁金、山楂和白茅根等7味中藥組成，通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php)和草本組鑒數(shù)據(jù)庫(HERB)(http://herb.ac.cn/)檢索中藥膽寧片的化學(xué)組分?？诜锢枚?OB)指化合物在給藥后，吸收進入血液循環(huán)系統(tǒng)的相對量，是決定化合物是否具有分子類藥性的關(guān)鍵指標(biāo)；類藥性(DL)反映化合物的結(jié)構(gòu)特征及理化性質(zhì)，可用于評估生物分子作為藥物的可能性。因此，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)系統(tǒng)特點，以O(shè)B≥30%且DL≥0.18為條件，篩選具有生物活性的化合物及其作用的蛋白質(zhì)靶點，并導(dǎo)入Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org)得到標(biāo)準(zhǔn)化的蛋白質(zhì)靶點信息。

1.2 慢性膽囊炎相關(guān)靶點的獲取

以“gallbladder”和“chronic cholecystitis”為關(guān)鍵詞，分別在GeneCards數(shù)據(jù)庫(http://www.GeneCards.org)、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(http://www.disgenet.org/)及Drugbank數(shù)據(jù)庫(https://go.drugbank.com/)中檢索，得到慢性膽囊炎相關(guān)靶點。在GeneCards數(shù)據(jù)庫中，Score值越高，靶點與疾病之間的關(guān)聯(lián)越密切，以相關(guān)性分值≥5分作為篩選條件，對檢索到的慢性膽囊炎靶點進行重整，再合并檢索結(jié)果去重后，最終獲得慢性膽囊炎相關(guān)靶點。

1.3 膽寧片作用于慢性膽囊炎相關(guān)靶點的預(yù)測

利用Venny 2.1繪制膽寧片-慢性膽囊炎靶點韋恩圖，得到藥物-疾病共有靶點，即膽寧片治療慢性膽囊炎的作用靶點。

1.4 膽寧片所含化合物與慢性膽囊炎相關(guān)靶點相互作用的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將每個化學(xué)成分與其作用的慢性膽囊炎靶點相聯(lián)系，通過Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建膽寧片成分-慢性膽囊炎相關(guān)靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)并繪制網(wǎng)絡(luò)圖，利用軟件中的內(nèi)置工具包NetworkAnalyzer分析網(wǎng)絡(luò)節(jié)點度和介數(shù)中心度。

1.5 膽寧片治療慢性膽囊炎靶點蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將“1.3”項下所得共有靶點輸入STRING平臺(http://www.string-db.org/)，設(shè)定物種為“Homo sapiens”，最小互相作用閾值設(shè)定為“medium confidence”(>0.4)，其余設(shè)置均為默認設(shè)置，構(gòu)建膽寧片-慢性膽囊炎靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖。再將PPI網(wǎng)路數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，通過Cytoscape 3.7.2內(nèi)置工具包NetworkAnalyzer分析PPI網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)參數(shù)，并根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)參數(shù)篩選核心靶點，再利用R語言軟件中count.R插件統(tǒng)計篩選出的核心靶點在PPI網(wǎng)絡(luò)中的出現(xiàn)頻次分布情況。

1.6 基因本體(GO)與京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析

GO對基因和蛋白質(zhì)功能進行限定和描述，將基因功能分為3個部分，即細胞組分(CC)、分子功能(MF)和生物過程(BP)[4]。KEGG是一個整合基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能信息的數(shù)據(jù)庫[5]。應(yīng)用R語言軟件中Cluster Profiler GO.R插件及Perl語言對膽寧片活性成分及藥物-疾病共有靶點進行GO分析和KEGG通路富集，對結(jié)果進行可視化分析，得到膽寧片治療慢性膽囊炎的生物功能和信號通路。

1.7 膽寧片成分-慢性膽囊炎靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

運用Cytoscape 3.7.2構(gòu)建膽寧片成分-慢性膽囊炎靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖，利用Cytoscape 3.7.2內(nèi)置工具分析有效成分及靶點的網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)，包括連接度、介度及緊密度等，并根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)參數(shù)判斷核心靶點及發(fā)揮藥效的主要活性成分。

2 結(jié)果

2.1 膽寧片的主要活性成分和潛在靶點

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫和HERB數(shù)據(jù)庫對中藥膽寧片大黃、虎杖、青皮、陳皮、郁金、山楂和白茅根分別進行檢索，篩選OB≥30%且DL≥0.18的活性成分及相應(yīng)的作用靶點，得到活性成分32種，潛在作用靶點251個。

2.2 慢性膽囊炎相關(guān)疾病靶點獲取

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫、DisGeNET數(shù)據(jù)庫及Drugbank數(shù)據(jù)庫分別檢索關(guān)鍵詞“gallbladder”和“chronic cholecystitis”以獲取疾病靶點，合并搜索結(jié)果后刪除重復(fù)靶點，得到361個慢性膽囊炎相關(guān)靶點。

2.3 膽寧片活性成分與慢性膽囊炎的共有靶點

將上述篩選所得的膽寧片活性成分靶點與慢性膽囊炎相關(guān)靶點取交集，并通過Venny 2.1繪制韋恩圖，得到膽寧片治療慢性膽囊炎的作用靶點60個(見圖1)及其對應(yīng)的潛在活性化合物24種，根據(jù)共有靶點與活性化合物化合物可知所屬中藥名稱，見表1。

圖1 膽寧片活性成分-慢性膽囊炎靶點韋恩圖Fig 1 Wayne diagram of active ingredients of Danning tablets-chronic cholecystitis targets

2.4 膽寧片靶點-慢性膽囊炎相互作用網(wǎng)絡(luò)

將候選化學(xué)成分與慢性膽囊炎靶點通過Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建膽寧片成分靶點-慢性膽囊炎靶點群網(wǎng)絡(luò)，得出膽囊片靶點-慢性膽囊炎網(wǎng)絡(luò)主要由84個節(jié)點(24個化合物節(jié)點，60個靶點節(jié)點)和257條邊組成，其中三角形節(jié)點表示膽寧片藥物活性成分，圓形節(jié)點表示膽寧片可能是通過這些基因治療慢性膽囊炎，連接化合物與靶點的每條邊表示膽寧片活性成分與慢性膽囊炎靶點之間的相互作用關(guān)系，見圖2。在膽寧片靶點-慢性膽囊炎靶點網(wǎng)絡(luò)中，膽寧片中有24種主要成分作用于慢性膽囊炎相關(guān)靶點，充分體現(xiàn)了其多成分、多靶點的作用特點。其主要的化合物有槲皮素(quercetin)、柚皮素(naringenin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、川陳皮素(nobiletin)、木犀草素(luteolin)、蘆薈大黃素(aloe-emodin)、毒扁豆次堿(physovenine)、橘皮素(tangeretin)和大黃酸(rhein)等，所屬活性成分可能膽寧片是治療慢性膽囊炎的物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖2 膽寧片活性成分-慢性膽囊炎靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig 2 Network diagram of active ingredients of Danning tablets-chronic cholecystitis targets

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將藥物-疾病共有靶點60個輸入STRING平臺得到膽寧片-慢性膽囊炎共有靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖(40個節(jié)點，455條邊)，見圖3。應(yīng)用R語言count.R統(tǒng)計出現(xiàn)頻率前15位的蛋白靶點，其中出現(xiàn)頻率較高的有腫瘤蛋白p53(TP53)、白細胞介素6(IL-6)和血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)等，見圖4。

圖3 膽寧片與慢性膽囊炎共有靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 Network diagram of protein-protein interaction (PPI) of shared targets of Danning tablets and chronic cholecystitis

2.6 GO功能分析與KEGG富集分析結(jié)果

通過GO分析得到BP、CC和MF 3類，并根據(jù)信號通路中基因所占總體輸入基因的比率進行排列，篩選出前15位，見圖5(A—C)。如圖5(A)所示，膽寧片治療慢性膽囊炎主要涉及的BP為上皮細胞增殖(epithelial cell proliferation)、細胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)(cellular response to oxidative stress)和細胞的化學(xué)應(yīng)激反應(yīng)(cellular response to chemical stress)等；如圖5(B)所示，治療的關(guān)鍵靶點主要作用于核膜(nuclear membrane)、囊腔(vesicle lumen)和頂端質(zhì)膜(apical plasma membrane)等；如圖5(C)所示，主要涉及的MF為受體配體活動(receptor ligand activity)、信號受體活動(signaling receptor activity)和生長因子受體結(jié)合(growth factor receptor binding)等。

根據(jù)通路基因所占總體輸入基因的比率排序，展示排序居前20的信號通路，見圖5(D)。膽寧片治療慢性膽囊炎的作用靶點主涉及的信號通路主要包括膀胱癌(bladder cancer)、人巨細胞病毒感染(human cytomegalovirus infection)和磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)等，體現(xiàn)了膽寧片多成分、多靶點、多通路的作用特點，見表2。

2.7 膽寧片成分-慢性膽囊炎靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

運用Cytoscape 3.7.2構(gòu)建膽寧片成分-慢性膽囊炎靶點-通路網(wǎng)絡(luò)，見圖6。運用Cytoscape 3.7.2內(nèi)置的Network Analyzer分析膽寧片治療慢性膽囊炎網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)參數(shù)，得到核心成分及核心作用靶點。結(jié)果表明，槲皮素(quercetin)連接度為32，介度為0.242 652，緊密度為0.652 174，預(yù)測槲皮素為膽寧片治療慢性膽囊炎的主要成分；其次為木犀草素(luteolin)、川陳皮素(nobiletin)和蘆薈大黃素(aloe-emodin)，見表3。TP53在網(wǎng)絡(luò)中的連接度為22，介度為0.076 612，緊密度為0.571 429，預(yù)測TP53為膽寧片治療慢性膽囊炎的最主要靶點；Cyclin依賴性激酶抑制劑1(CDKN1A)、G1/S-特異性Cyclin-D1(CCND1)、原癌基因絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶1(RAF1)、表皮生長因子受體(EGFR)、VEGFA、腫瘤壞死因子(TNF)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)、受體酪氨酸蛋白激酶2(ERBB2)和視網(wǎng)膜母細胞瘤相關(guān)蛋白1(RB1)亦為相對重要的靶點，見表4。

表3 膽寧片主要活性成分網(wǎng)絡(luò)節(jié)點特征參數(shù)Tab 3 Characteristic parameters of network nodes of main active ingredients of cholinester tablets

表4 膽寧片主要活性成分靶點網(wǎng)絡(luò)節(jié)點特征參數(shù)Tab 4 Characteristic parameters of targets network nodes of main active ingredients in Danning tablets

3 討論

慢性膽囊炎最典型的癥狀為間歇性膽絞痛，是由膽囊結(jié)石阻塞膽囊管的反復(fù)發(fā)作所致，最終由于膽囊壁的增厚和硬化導(dǎo)致膽囊萎縮并喪失生理功能。我國缺乏全國性的慢性膽囊炎、膽石癥流行病學(xué)資料。一項覆蓋24個省市的針對體檢人群的調(diào)查結(jié)果顯示，我國不同年齡段人群膽囊結(jié)石的患病率為1.1%～11.2%，50歲以上中老年人為膽囊炎患病的主要人群[6]。慢性膽囊炎容易復(fù)發(fā)，為消化系統(tǒng)疾病中治療費用較高的疾病。

膽寧片為臨床治療膽石癥和膽囊炎的有效中藥制劑，具有調(diào)節(jié)膽汁成分、抑制膽石結(jié)石的作用。研究結(jié)果表明，膽寧片可能通過促進膽汁酸、卵磷脂的分泌，降低膽汁黏稠度，減少膽汁中膽固醇的含量[7]；同時，可降低膽汁中游離膽紅素的含量，從而防止膽色素結(jié)石的形成及增大[8]。

根據(jù)Cytoscape網(wǎng)絡(luò)分析膽寧片成分與疾病靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果表明，槲皮素、木犀草素、川陳皮素和蘆薈大黃素為膽寧片治療慢性膽囊炎的主要成分，其中槲皮素可能是最主要的有效成分。槲皮素是自然界中廣泛存在的多醇羥基黃酮類化合物，具有抗惡性腫瘤、抗氧化、抗炎、抗血栓、抗病毒、心血管保護和免疫調(diào)節(jié)等多種藥理學(xué)活性[9]。慢性膽囊炎多為慢性結(jié)石性膽囊炎，而膽固醇代謝異常引起的膽囊膽固醇結(jié)石是引起慢性膽囊炎的主要病因，槲皮素可以通過促進膽固醇向膽汁酸的轉(zhuǎn)化，促進體內(nèi)膽固醇外排，抑制膽固醇合成的限速酶HMG-CoA還原酶的表達，進而降低總膽固醇及膽固醇酯含量[10-11]。

通過構(gòu)建膽寧片與慢性膽囊炎的共有靶點PPI網(wǎng)絡(luò)，以及膽寧片成分-慢性膽囊炎靶點-通路網(wǎng)絡(luò)，對結(jié)果進行分析，得到膽寧片治療慢性膽囊炎的最主要靶點為TP53，其次為CDKN1A、CCND1、RAF1、EGFR、VEGFA、TNF、MMP9、ERBB2和RB1等。TP53基因表達異常與惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，TP53能結(jié)合并激活細胞分裂制動基因，從而抑制細胞的增殖和分化。研究結(jié)果表明，少數(shù)慢性膽囊炎壁肥厚伴重度異型上皮增生病例表現(xiàn)出TP53基因陽性[12]。在慢性膽囊炎中，TP53基因的轉(zhuǎn)化突變可能與膽囊癌的發(fā)生密切相關(guān)[13]。細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A(CDKN1A)能夠在G1期調(diào)節(jié)細胞周期的功能，該基因的表達受到TP53的嚴(yán)格控制[14]；并且，TP53參與包括鱗狀細胞癌、乳腺癌和膀胱癌等多種腫瘤的病理生理過程[15]。然而，CDKN1A在慢性膽囊炎病理生理學(xué)過程中的作用還未見報道。

A.GO-BP功能富集；B.GO-CC功能富集；C.GO-MF功能富集；D.KEGG通路富集A.GO-BP function enrichmen; B.GO-CC function enrichment; C.GO-MF function enrichment; D.KEGG pathway enrichment圖5 膽寧片治療慢性膽囊炎潛在靶點的GO功能富集和KEGG通路富集分析氣泡圖Fig 5 Bubble diagram of GO function enrichment and KEGG pathway enrichment analysis of potential targets of Danning tablets in the treatment of chronic cholecystitis

本研究根據(jù)GO和KEGG富集分析結(jié)果，可以得出膽寧片在慢性膽囊炎治療中參與的生物過程和信號通路。其中主要涉及的生物過程包括上皮細胞增殖、細胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)和細胞的化學(xué)應(yīng)激反應(yīng)等；主要參與的信號通路包括膀胱癌信號通路、人巨細胞病毒感染信號通路和PI3K-Akt信號通路等，涉及CCND1、CDKN1A、EGFR、MYC、TP53和IL-6等靶基因，以上通路與細胞的生長、增殖和分化等密切相關(guān)[16]。IL-6是由184個氨基酸組成的多功能糖蛋白，在慢性膽囊炎患者的膽汁和血清中呈高表達狀態(tài)，其作為一種炎癥細胞因子，反映了機體對炎癥及感染的反應(yīng)狀態(tài)[17-18]。膽囊局部的炎癥反應(yīng)是膽囊炎發(fā)病的重要基礎(chǔ)，有效控制炎癥對治療膽囊炎具有明顯的促進作用。EGFR在膽囊癌組織中的陽性表達率為70.7%，在膽囊不典型增生組織中的陽性表達率為85.7%，而在正常膽囊組織中沒有陽性表達，推測EGFR與慢性膽囊炎和膽囊癌的發(fā)生可能有密切關(guān)系[19]。

綜上所述，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，得到膽寧片治療慢性膽囊炎可能與抗炎、調(diào)節(jié)膽固醇代謝相關(guān)。目前僅通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對膽寧片參與治療慢性膽囊炎的主要靶點、生物過程和重要信號通路進行探討，為進一步闡明膽寧片治療慢性膽囊炎的作用機制提供了理論基礎(chǔ)。但是，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法自身的局限性以及藥方中各味中藥材組分在煎煮過程中發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的復(fù)雜性，本研究并未將膽寧片原有的活性成分經(jīng)過體內(nèi)代謝后仍具有活性的代謝物納入分析。本研究主要是以生物信息學(xué)技術(shù)分析結(jié)果為基礎(chǔ)，后續(xù)將在此分析結(jié)果的基礎(chǔ)上進一步篩選并在動物或細胞水平進行實驗驗證，進而明確膽寧片調(diào)控慢性膽囊炎的主要靶點。