獅頭鵝MAP2K1基因SNP位點篩查及生物信息學(xué)分析

陳新企 周光現(xiàn) 王慧芳 李立先 賈汝敏 趙志輝

摘要：MAP2K1基因?qū)儆贕nRH信號通路且與哺乳動物的卵泡發(fā)育緊密相關(guān)。為研究MAP2K1基因在獅頭鵝上的基因多態(tài)性，以200羽獅頭鵝為試驗對象，利用DNA池結(jié)合PCR產(chǎn)物直接測序法，篩選出SNP位點并進行生物信息學(xué)分析。檢測結(jié)果表明，在獅頭鵝群體中發(fā)現(xiàn)1個SNP位點，為E3-63 A>G，存在3種基因型。生物信息學(xué)預(yù)測顯示，MAP2K1基因突變前后編碼氨基酸并未發(fā)生改變，屬于不穩(wěn)定不跨膜酸性親水性蛋白，存在卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，無信號肽存在。亞細胞定位于細胞核、細胞質(zhì)、細胞支架的概率分別為60.9%、30.4%、8.7%，主要在細胞核發(fā)揮生物學(xué)作用;有34個磷酸化位點，有1個N-糖基化位點，1個保守結(jié)構(gòu)S_TKc，蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由α螺旋和無規(guī)則卷曲組成。MAP2K1基因突變前后mRNA的最小自由能，質(zhì)心發(fā)生二級結(jié)構(gòu)，含有假結(jié)的mRNA二級結(jié)構(gòu)、折疊結(jié)構(gòu)、MaxExpect結(jié)果、點-括號結(jié)果、最小自由能、mRNA結(jié)構(gòu)的熱力學(xué)集合、質(zhì)心結(jié)構(gòu)所形成的山地圖發(fā)生改變，且自由能上升，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性變?nèi)?。從獅頭鵝MAP2K1基因的11個外顯子上檢測出1個SNP位點，MAP2K1基因突變前后改變mRNA二級結(jié)構(gòu)，為進一步研究MAP2K1基因?qū)Κ{頭鵝產(chǎn)蛋數(shù)量提供參考。

關(guān)鍵詞：獅頭鵝;MAP2K1基因;SNP;多態(tài)性;生物信息學(xué)

中圖分類號：S835.3 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2022）11-0043-10

收稿日期：2021-07-25

基金項目：廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團隊項目（編號：2019KJ137、2020KJ137）;獅頭鵝品種選育及健康養(yǎng)殖校企合作項目（編號：B15337）。

作者簡介：陳新企（1996—），女，廣西賀州人，碩士研究生，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究。E-mail：2476359974@qq.com。

通信作者：賈汝敏，教授，研究生導(dǎo)師，主要從事家禽遺傳育種與繁殖研究，E-mail：jiarm@gdou.edu.cn;趙志輝，教授，研究生導(dǎo)師，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：zhzhao@jlu.edu.cn。

獅頭鵝被選為廣東省第三屆“十大名牌”農(nóng)產(chǎn)品，生長速度快、耗料少，其營養(yǎng)價值高，亞麻酸含量超過其他肉類并接近人體所需氨基酸的比例，具有很高的經(jīng)濟價值。但獅頭鵝年產(chǎn)蛋不足32枚，不足高產(chǎn)鵝的1/4，遠不能滿足市場需求。絲裂原活化蛋白激酶Ⅰ（mitogen activated protein kinase 1，簡稱MAP2K1，又稱MEK1或MAPKK1），屬于GnRH信號通路，是細胞進入DNA合成期（即S期）的關(guān)鍵，激活ERK1/2，ERK1/2進入細胞核后，又激活轉(zhuǎn)錄因子形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，導(dǎo)致細胞的增殖分化。MAP2K1基因?qū)儆贛EK家族成員，該家族包括MEK1、MEK2、MEK3、MEK4、MEK5、MEK6、MEK7基因，是MAPK信號通路中的重要成員。MAPK信號通路包括：p38MAPK通路（p38 mitogen activated protein，p38MAPK），c-Jun氨基末端激酶通路/應(yīng)激激活蛋白（c-Jun-N-terminal kinase，JNK/stress activated protein kinase，SAPK），細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶通路（extra cellular signal-regulated protein kinase，ERK）及細胞外信號調(diào)節(jié)激酶5（ERK5）通路。MAP2K1基因主要參與ERK途徑，被認為是ERK1/2最主要調(diào)節(jié)因子之一。ERK1/2參與分化細胞的減數(shù)分裂，有絲分裂后功能的調(diào)控^]，活化原始卵泡和卵泡的生長，促進卵泡顆粒細胞增殖及類固醇激素合成。ERK1/2差異性調(diào)節(jié)FSH誘導(dǎo)的卵泡顆粒細胞中孕激素和雌二醇合成。MAP2K1是ERK1/2的上游激酶，為少有的雙重特異性蛋白激酶，既為酪氨酸蛋白激酶，又為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。MAP2K1基因突變導(dǎo)致人各種疾病的發(fā)生，例如肝癌、結(jié)直腸癌等;導(dǎo)致鼠隱性表型致死，影響胎盤的發(fā)育，滋養(yǎng)層細胞不能侵入胎盤迷路;影響豬精子生成，影響公牛精液品質(zhì)。目前，MAP2K1基因在獅頭鵝的研究還未見相關(guān)報道。有關(guān)獅頭鵝最新的研究為基于全基因組重測序技術(shù)的獅頭鵝Indel標記分析和獅頭鵝個體產(chǎn)蛋智能記錄系統(tǒng)研制。而關(guān)于MAP2K1基因的多態(tài)性研究主要與人疾病相關(guān)，迄今為止，還沒有關(guān)于獅頭鵝MAP2K1基因的多態(tài)性及生物信息學(xué)分析，及是否可以作為影響產(chǎn)蛋性能候選基因的報道。因此，研究獅頭鵝MAP2K1基因外顯子多態(tài)性可快速、準確、不受環(huán)境條件干擾地揭示MAP2K1基因是否影響?yīng){頭鵝的產(chǎn)蛋量。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

獅頭鵝由國家級獅頭鵝保種場（廣東省饒平縣）提供，從1 400羽500日齡繁殖期母鵝中隨機挑選200羽健康成年母鵝。在翅下靜脈肝素鈉抗凝采集血樣。Green Taq Mix購自南京諾唯贊生物科技有限公司，HiPure Blood DNA Mini Kit試劑盒購自美基生物公司，DL-2000 Marker購自廣州東盛生物科技有限公司。

1.2 基因組DNA提取和DNA池的構(gòu)建

使用試劑盒進行血液樣品DNA提取。經(jīng)1%凝膠電泳檢測DNA完整性，使用Nanodrop檢測純度。每個混池100個DNA樣品，每個樣品各取 1 μL，然后混合均勻，構(gòu)成獅頭鵝基因組DNA池。

1.3 引物設(shè)計與合成

目前，GenBank上未公布鵝MAP2K1基因序列，根據(jù)文獻發(fā)現(xiàn)鵝的基因序列與鴨的基因序列一致性較高，因此采用鴨的基因序列設(shè)計相應(yīng)引物。由表1可知，根據(jù)GenBank上已公布的綠頭鴨MAP2K1基因序列（登錄號XM_027465642.2），采用Primer Premier 5.0對獅頭鵝MAP2K1基因的11個外顯子（Exon1～Exon11）設(shè)計引物。

1.4 PCR擴增及SNP位點鑒定

PCR反應(yīng)總體系為25.0 μL：Green Taq Mix 12.5 μL，上下游引物各1.0 μL，DNA樣品1.0 μL，ddHO 9.5 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35循環(huán);72℃延伸10 min，4℃保存。利用DNAstar中seq man應(yīng)用查看，找出獅頭鵝MAP2K1基因SNP位點;計算SNP位點等位基因頻率、基因型頻率、純合度、雜合度、有效等位基因數(shù)。使用PIC-CALC和PopGen32分別計算多態(tài)信息量（PIC）和哈代-溫伯格平衡（Hardy Weinberg's law）。

1.5 獅頭鵝MAP2K1蛋白生物信息學(xué)分析

GenBank上目前未有鵝MAP2K1蛋白序列，所使用序列為DNA測序結(jié)果預(yù)測的蛋白序列。利用ExPASy分析理化性質(zhì)、疏水性、卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，利用SignalP4.1 Server對信號肽進行預(yù)測，利用TMHMM預(yù)測蛋白跨膜結(jié)構(gòu)，利用PSORT Ⅱ預(yù)測亞細胞定位，利用SMART預(yù)測蛋白結(jié)構(gòu)域，利用NetPhos2.0預(yù)測磷酸化，利用NetNGlyc1.0 Server預(yù)測糖基化位點，利用SOPMA軟件預(yù)測蛋白二級結(jié)構(gòu)，利用SWISS-MODEL軟件預(yù)測三級結(jié)構(gòu)。

1.6 獅頭鵝MAP2K1基因mRNA二級結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)分析

利用RNAfold web server和RNAstructure進行mRNA二級結(jié)構(gòu)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 獅頭鵝MAP2K1基因PCR擴增

由圖1可知，對獅頭鵝MAP2K1基因Exon1～Exon11進行擴增，PCR擴增后分別獲得472、633、649、252、365、377、384、393、415、419、453 bp的產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示條帶干凈清晰無污染。引物序列大小均與預(yù)期一致。

由表2可知，將擴增產(chǎn)物測序后的序列進行同源比對，發(fā)現(xiàn)該擴增序列與鴨MAP2K1基因序列的一致性達99%。

2.2 獅頭鵝MAP2K1基因混池SNP位點鑒定結(jié)果

利用DNASTAR對獅頭鵝MAP2K1基因測序結(jié)果與GenBank上已公布的綠頭鴨MAP2K1基因序列進行對比分析。由圖2可知，MAP2K1-3引物上有明顯套峰。

2.3 獅頭鵝MAP2K1基因個體驗證

由圖3可知，對引物MAP2K1-3進行200羽獅頭鵝單個DNA樣品PCR擴增后測序，發(fā)現(xiàn)1個SNP位點，有3種基因型。由圖4可知，在Exon3的第63堿基處A突變成G，命名為E3-63 A>G。

2.4 基因型頻率、等位基因頻率及哈代溫伯格定律數(shù)據(jù)分析

對篩選出的1個SNP位點，進行等位基因頻率、基因型頻率、純合子、雜合子、有效等位基因數(shù)、PIC和Hardy Weinberg's law的計算。由表3可知，E3-63 A>G等位基因A和G的頻率分別為19.93%、80.07%，G為優(yōu)勢等位基因，中度多態(tài)（PIC=0.268 2），在群體遺傳過程中符合Hardy Weinberg's law（P>0.05）平衡狀態(tài)。

2.5 MAP2K1蛋白生物信息學(xué)分析

2.5.1 MAP2K1蛋白的理化性質(zhì)分析

利用ExPASy（http：//web.expasy. org/protparam/）對獅頭鵝MAP2K1蛋白突變前后的氨基酸組成、等電點和不穩(wěn)定系數(shù)等理化性質(zhì)進行預(yù)測分析。結(jié)果顯示，MAP2K1蛋白突變前后編碼氨基酸并未發(fā)生改變。MAP2K1蛋白分子式為CHNOS，由395個氨基酸組成，其中，亮氨酸占比最高，為9.1%，相對分子量為43 576.09，理論等電點PI為6.19，說明該蛋白為酸性，正電荷的殘基總數(shù)為46，負電荷的殘基總數(shù)為50，半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)為48.87，說明該蛋白不穩(wěn)定，脂肪系數(shù)為86.63，親水性為-0.323，說明該蛋白為親水性蛋白。

2.5.2 MAP2K1蛋白疏水性分析

利用ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）對編碼氨基酸疏水性進行預(yù)測。以0分為界，數(shù)值越大，疏水性越強，數(shù)值越小，親水性越強。結(jié)果顯示，在第45位和第47位氨基酸親水性最強，為-2.956;在第170位和第173位氨基酸疏水性最強，為1.989，平均親水性為 -0.323，說明該蛋白具有親水性。

2.5.3 MAP2K1蛋白Coil區(qū)分析

利用在線網(wǎng)站（https：//embnet.vital-it.ch/software/COILS_form.html），預(yù)測Coil區(qū)。當不同窗口值大于0.5時，則該位點存在Coil區(qū)。由圖5可知，在14號窗口 30～48位氨基酸有卷曲結(jié)構(gòu)，第30～43位氨基酸的值為1.000，第44～48位氨基酸的值為0.622。在21號窗口第23～50位氨基酸有卷曲結(jié)構(gòu)，第 23～43位氨基酸的值為0.999，第43～50位氨基酸的值為0.989。28號窗口第23～60位氨基酸有卷曲結(jié)構(gòu)，第23～57位氨基酸的值為0.987，第58～60位氨基酸的值為0.626，說明該蛋白具有卷曲螺旋結(jié)構(gòu)。

2.5.4 MAP2K1蛋白信號肽分析

信號肽是決定新生肽鏈在細胞中的定位或決定某些氨基酸殘基修飾的一些肽段。利用蛋白質(zhì)序列信號肽分析工具SignalP4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）對MAP2K1突變前后蛋白進行分析。當3種C、Y、S-score計算結(jié)果>0.5時，則該位點存在信號肽。結(jié)果顯示， 在第6位氨基酸處S最大值為0.108，在第26位氨基酸處C、Y最大值分別為0.119、010，均未超過0.5，說明該蛋白無信號肽存在。

2.5.5 MAP2K1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析

把得到的氨基酸序列輸入TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在線跨膜運輸軟件進行預(yù)測。結(jié)果顯示，MAP2K1蛋白無跨膜區(qū)域，說明MAP2K1不是跨膜蛋白。

2.5.6 MAP2K1蛋白亞細胞定位分析

亞細胞定位是指某種蛋白或表達產(chǎn)物在細胞內(nèi)的具體存在部位。通過工具PSORTⅡ（https：//psort.hgc.jp/form2.html）預(yù)測MAP2K1突變前后編碼蛋白的亞細胞定位。結(jié)果顯示，該蛋白位于細胞核的概率為60.9%、位于細胞質(zhì)的概率為30.4%、位于細胞支架的概率為8.7%，主要在細胞核發(fā)揮生物學(xué)作用。

2.5.7 MAP2K1蛋白磷酸化位點分析

利用NetPhos軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）預(yù)測，當磷酸化電勢大于閾值0.5時，則該位點有可能被磷酸化。結(jié)果顯示，MAP2K1蛋白有34個磷酸化位點，其中，絲氨酸磷酸化位點有23個，位于第18、72、86、90、135、140、150、200、218、222、228、231、241、244、252、268、283、289、300、301、306、366、387位氨基酸處;蘇氨酸磷酸化位點有8個，位于第28、55、178、226、238、294、380、388位氨基酸處;酪氨酸磷酸化位點3個，位于第125、229、318位氨基酸處，說明MAP2K1蛋白主要是絲氨酸（67.65%）磷酸化。

2.5.8 MAP2K1蛋白糖基化分析

利用NetNGlyc1.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）對MAP2K1突變前后蛋白糖基化位點預(yù)測，發(fā)現(xiàn)結(jié)果相同。當N-糖基化電勢大于閾值0.5時，則該位點有可能被N-糖基化。結(jié)果顯示，第21位對應(yīng)天冬氨酰氨殘基的酰胺氮原子存在1個N-糖基化位點，其概率為0.780 8。

2.5.9 MAP2K1蛋白結(jié)構(gòu)域分析

用NCBI和SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）對突變前后蛋白結(jié)構(gòu)域分析。由圖6可知，MAP2K1有1個特殊結(jié)構(gòu)S_TKc，位于68～363位氨基酸處、E值為2.04×10^-79;一個卷曲螺旋結(jié)構(gòu)位于19～59位氨基酸處。

2.5.10 MAP2K1蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用Hopfield（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopm.html）預(yù)測突變前后編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)結(jié)果相同。由圖7可知，MAP2K1蛋白由α螺旋（44.56%）、無規(guī)則卷曲（40.76%）、延伸鏈（11.65%）、和β-轉(zhuǎn)角（3.04%）組成。說明該蛋白主要由α螺旋和無規(guī)則卷曲組成，β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈散布于整個蛋白中。

2.5.11 MAP2K1蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

通過SWISS-MODEL（https：//www.swiss-model.expasy.org/interactive）預(yù)測突變前后編碼蛋白三級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)結(jié)果相同。由圖8可知，MAP2K1蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)與SMTL ID：6u2g.1.模板序列相似性95.92%，說明預(yù)測的蛋白三級結(jié)構(gòu)與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果基本一致。

2.6 MAP2K1基因mRNA二級結(jié)構(gòu)分析

利用軟件RNAfold web server（http：//nibiru.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi）和RNAstructure（http：//rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure Web/Servers/Predict1/Predict1.html）分析突變前后MAP2K1基因mRNA二級結(jié)構(gòu)。由圖9可知，MAP2K1基因突變前后mRNA二級結(jié)序列不同，序列由A變成G，下面進一步分析突變前后mRNA二級結(jié)構(gòu)的平面圖、點-括號圖及山地圖是否存在差異。

2.6.1 mRNA最小自由能（MFE）與質(zhì)心二級結(jié)構(gòu)平面圖分析

利用RNAfold對mRNA二級結(jié)構(gòu)進行分析，由圖10可知，突變前后MFE結(jié)構(gòu)存在明顯差異，總自由能由-1 419.11 kJ/mol上升到 -1 415.77 kJ/mol;突變前后質(zhì)心二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，自由能由 -712.19 kJ/mol 上升到 -707.60 kJ/mol;且突變后的內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)多于突變前，說明環(huán)區(qū)的形成是破壞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，突變后自由能均呈上升趨勢，結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性變?nèi)酢?/p>

2.6.2 含有假結(jié)的mRNA二級結(jié)構(gòu)平面圖分析

利用RNAstructure分析含有假結(jié)的mRNA二級結(jié)。平面圈圖將mRNA的堿基均勻地分布在圓形四周，彎成一個圓圈，在圈內(nèi)用弧線或直線把配對堿基連接起來。假結(jié)結(jié)構(gòu)是發(fā)卡結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)的堿基與莖環(huán)結(jié)構(gòu)外側(cè)單鏈區(qū)的一些堿基形成氫鍵，結(jié)果形成類似于兩莖連接結(jié)構(gòu)，但兩莖外側(cè)形成2個環(huán)區(qū)。由圖11可知，突變前后的結(jié)果不同，說明突變前后擁有的生物活性可能不同。

2.6.3 折疊結(jié)構(gòu)平面圖分析

利用RNAstructure分析折疊結(jié)構(gòu)，預(yù)測序列的最低自由能結(jié)構(gòu)和1組低自由能結(jié)構(gòu)。由圖12可知，突變前后折疊結(jié)構(gòu)不同，且自由能從-1 447.12 kJ/mol降低到 -1 455.06 kJ/mol，說明突變前后所折疊成特有的空間結(jié)構(gòu)不同，可能會對生物活性和特定的生物學(xué)功能產(chǎn)生影響。

2.6.4 MaxExpect結(jié)果平面圖分析

利用RNAstructure分析特定結(jié)構(gòu)的基團，這是一種結(jié)構(gòu)預(yù)測的替代方法，在結(jié)構(gòu)預(yù)測中可能具有更高的保真度。由圖13可知，自由能從360.7 kJ/mol降低至 352.4 kJ/mol，突變前后形成的特定結(jié)構(gòu)不同，說明突變前后形成特定結(jié)構(gòu)的基團不同會影響生物活性，可能使生物功能發(fā)生改變，且突變后的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性更穩(wěn)定。

2.6.5 mRNA二級結(jié)構(gòu)點-括號分析

（（（（（....（（...............））中，. （點）表示未配對堿基，（）（括號）則代表表示匹配的堿基。利用RNAfold對mRNA二級結(jié)構(gòu)分析，由圖14、圖15可知，突變前后的MFE和質(zhì)心二級結(jié)構(gòu)點-括號結(jié)果不同，說明變前后堿基配對情況不同，對突變前后的自由能產(chǎn)生影響。

2.6.6 mRNA二級結(jié)構(gòu)山地圖分析

利用RNAfold對突變前后mRNA最小自由能結(jié)構(gòu)、熱力學(xué)集合、質(zhì)心結(jié)構(gòu)的山地圖分析，由圖16可知，突變前后山地圖明顯不一樣，說明突變前后堿基配對不同，對自由能產(chǎn)生影響。

3 討論與結(jié)論

3.1 MAP2K1相關(guān)基因的多態(tài)性分析

目前，還未發(fā)現(xiàn)在動物上與MAP2K1基因多態(tài)性的相關(guān)研究，而MAP2K1相關(guān)基因多態(tài)性的研究主要與豬的經(jīng)濟效益相關(guān)。張佳麗等研究發(fā)現(xiàn)，在法系大白豬MAP2K6基因有4個SNPs位點，分別為內(nèi)含子8、11（Intron8、11，In8、11）和Exon12，均有3種基因型，rs325278117和rs325752048位點A為優(yōu)勢等位基因， rs332107877和rs345304630位點G為優(yōu)勢等位基因，且4個SNPs位點均與經(jīng)濟性狀相關(guān)，影響法系大白豬的經(jīng)濟效益。蒲蕾等研究發(fā)現(xiàn)，在杜洛克豬MAP3K5基因有4個SNPs位點，30769583 A>C位點C為優(yōu)勢等位基因;30781169 A>G位點G為優(yōu)勢等位基因;30940839 A>G位點G為優(yōu)勢等位基因;30962276 G>A位點A為優(yōu)勢等位基因。30769583 A>C、30781169 A>G和 30962276 G>A在杜洛克豬群體中均處于Hardy Weinberg's law平衡狀態(tài)（P>0.05）;30940839 A>G在杜洛克豬群體中偏離Hardy Weinberg's law平衡狀態(tài)（P<0.01）。30769583 A>C、30781169A>G和30940839 A>G低度多態(tài)，30962276 G>A為中度多態(tài)，且分別與剩余采食量、平均日采食量、飼料轉(zhuǎn)化率、平均日增質(zhì)量相關(guān)，影響經(jīng)濟效益。本研究在獅頭鵝MAP2K1基因中發(fā)現(xiàn)1個SNP位點，位于Exon3，堿基A突變?yōu)镚，并未改變氨基酸編碼，G為優(yōu)勢等位基因，中度多態(tài)，處于Hardy Weinberg's law平衡狀態(tài)（P>0.05）。MAP2K6和MAP3K5基因多態(tài)性均影響豬的經(jīng)濟效益，雖本研究并未與產(chǎn)蛋量進行相關(guān)分析，但E3-63 A>G處于中度多態(tài)，具有較大的選擇潛力，是否影響?yīng){頭鵝的產(chǎn)蛋量還需要進行下一步驗證。

3.2 MAP2K1蛋白生物信息學(xué)分析

蔡佳等研究發(fā)現(xiàn)，在紅笛鯛MAPKK5基因cDNA序列全長2 632 bp，分子量為49.42 ku，理論等電點為6.12，編碼438個氨基酸，2個保守結(jié)構(gòu)域PB1和S_TKc區(qū)，22個磷酸化位點，主要在細胞質(zhì)發(fā)揮生物學(xué)功能，α螺旋占36%，β折疊占11%，無規(guī)則卷曲占39%;而本研究MAP2K1基因cDNA序列全長1 188 bp，相對分子量為43 576.09，理論等電點PI為6.19，編碼395個氨基酸，1個保守結(jié)構(gòu)域S_TKc區(qū)，主要在細胞核發(fā)揮生物學(xué)作用，有34個磷酸化位點，蛋白二級結(jié)構(gòu)由α螺旋（44.56%）、無規(guī)則卷曲（40.76%）、延伸鏈（11.65%）、和β-轉(zhuǎn)角（3.04%）組成。說明MAPKK5與MAP2K1蛋白均屬于不穩(wěn)定不跨膜酸性親水性蛋白，無信號肽存在，蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由α螺旋和無規(guī)則卷曲組成;但編碼氨基酸數(shù)量、保守結(jié)構(gòu)、發(fā)揮生物學(xué)作用的場所均不同。蒲蕾等研究發(fā)現(xiàn)，在大白豬MAP3K5蛋白同樣具有保守結(jié)構(gòu)域S_TKc。由此看出，MAPKK5、MAP2K1與MAP3K5蛋白均存在S_TKc結(jié)構(gòu)域，S_TKc結(jié)構(gòu)域具有絲氨酸/蘇氨酸激酶催化功能，被上游激酶激活后，能將胞外信號傳遞至胞內(nèi)，進而使機體對外界刺激做出應(yīng)答。

3.3 MAP2K1基因mRNA二級結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)分析

mRNA二級結(jié)構(gòu)主要通過調(diào)節(jié)核糖體在序列上的移動速率來調(diào)控各種生物過程，mRNA二級結(jié)構(gòu)能幫助mRNA正確定位。突變前后改變mRNA二級序列，序列由A突變成G，突變前后MFE結(jié)構(gòu)與質(zhì)心二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，且自由能上升，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性變?nèi)?。突變后的?nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)多于突變前，說明各種環(huán)區(qū)的形成破壞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性;突變前后的折疊不同，且mRNA二級結(jié)構(gòu)中環(huán)結(jié)構(gòu)含量與蛋白質(zhì)折疊速率呈顯著的正相關(guān)性，從而得知突變前后的mRNA二級結(jié)構(gòu)的折疊速率不一樣，折疊成不同的空間結(jié)構(gòu)，不同的空間結(jié)構(gòu)具有不同的生物活性，行使不同的生物學(xué)功能，突變前后的mRNA二級可能發(fā)揮不同的生物功能。假結(jié)結(jié)構(gòu)在mRNA中有非常重要的地位，有研究表明在植物病毒中發(fā)現(xiàn)了假結(jié)的存在，發(fā)現(xiàn)一旦假結(jié)結(jié)構(gòu)消失，RNA的生物活性也隨之消失;核糖體在假結(jié)被降解，核糖體就會喪失其生物活性，不會參與到蛋白質(zhì)的合成過程中，突變前后含假結(jié)結(jié)構(gòu)不同，可能擁有不同的生物活性。綜上，從mRNA二級結(jié)構(gòu)的多方面分析，可知突變前后的mRNA可能會擁有不同生物活性及其生物功能。

本研究首次篩選了獅頭鵝MAP2K1基因的SNP位點，MAP2K1基因E3-63 A>G位點屬于中度多態(tài)，具有較大的選擇潛力。MAP2K1蛋白屬于不穩(wěn)定不跨膜酸性親水性蛋白，主要在細胞核發(fā)揮生物學(xué)作用，有34個磷酸化位點，有1個N-糖基化位點，1個保守結(jié)構(gòu)域S_TKc區(qū)，蛋白二級主要由α螺旋和無規(guī)則卷曲組成。MAP2K1基因突變前后mRNA的最小自由能，質(zhì)心發(fā)生二級結(jié)構(gòu)，含有假結(jié)的mRNA二級結(jié)構(gòu)，折疊結(jié)構(gòu)，MaxExpect結(jié)果，點-括號結(jié)果，最小自由能、mRNA結(jié)構(gòu)的熱力學(xué)集合、質(zhì)心結(jié)構(gòu)所形成的山地圖發(fā)生改變，且自由能上升，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性變?nèi)?。該研究可為后續(xù)提高獅頭鵝產(chǎn)蛋量候選基因的鑒定提供理論依據(jù)。

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