李俞羲，路遙，田野

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院 1.麻醉科；2.胸外科，沈陽 110032）

肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤［1］，嚴(yán)重威脅人類健康。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌的最常見類型，約占確診肺癌的80%～85%［1］。目前，NSCLC的治療手段主要包括外科手術(shù)、放療、化療、靶向治療和免疫治療。盡管近年來NSCLC的治療方法不斷進(jìn)步，但是由于多數(shù)NSCLC患者確診時已屬臨床Ⅳ期，無法采用外科手術(shù)切除，而以鉑類為基礎(chǔ)的化療存在耐藥性［2］。目前NSCLC患者的5年生存率僅為10%～15%［1］，因此尋找更有效的臨床治療方法對提高患者生存率十分重要。

安羅替尼是小分子多靶點酪氨酸激酶抑制劑，能夠有效抑制血管內(nèi)皮生長因子受體、血小板源生長因子受體和成纖維生長因子受體等［3］。臨床研究［4-5］表明，安羅替尼作為三線藥物可以顯著延長NSCLC患者的總生存期和無進(jìn)展生存期。RNA高通量測序和分析發(fā)現(xiàn)同源異型盒基因A10（homeobox A10，HOXA10）與NSCLC對安羅替尼的耐藥性相關(guān)［6］，然而具體的作用機制尚未闡明。研究抗腫瘤藥物的耐藥機制有利于改善治療效果，進(jìn)一步優(yōu)化治療方案。因此，本研究通過敲低HOXA10，探討HOXA10對NSCLC細(xì)胞安羅替尼敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5、人肺癌細(xì)胞A549和PC-9購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。安羅替尼購自美國MCE公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、HOXA10小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）、對照siRNA和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Thermo Fisher公司。CCK-8試劑、Annexin V凋亡檢測試劑盒購自碧云天公司。HOXA10、GAPDH抗體購自美國Santa Cruz公司。Transwell小室購自美國康寧公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

人肺癌細(xì)胞A549和PC-9培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)液內(nèi)含有青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL。細(xì)胞均置于含5% CO2的37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，0.25%胰酶-EDTA消化傳代，細(xì)胞處于對數(shù)生長期時用于實驗。當(dāng)細(xì)胞生長融合度為70%～80%時，按照Lipofectamine 2000試劑說明書轉(zhuǎn)染si-NC（對照組）或si-HOXA10。

1.3 RNA提取和實時定量PCR

采用TRIzol提取細(xì)胞總RNA，用QuantiTect Reverse Transcription 試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后使用SYBR Green PCR Master Mix進(jìn)行實時定量PCR。引物序列：HOXA10，正向5’-CTCGCCCATAGACCTGTGG-3’，反向5’-GTTCTGCGCGAAAGAGCAC-3’；GAPDH，正 向5’-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3’，反向5’-ACA CCATGTATTCCGGGTCAAT-3’。采用2-ΔΔCt法計算目的基因表達(dá)。

1.4 蛋白提取和Western blotting

采用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取各樣本等量蛋白進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，分別孵育HOXA10（1 ∶500）或者GAPDH（1 ∶1 000）一抗4 ℃過夜。洗膜后，室溫孵育耦聯(lián)HRP的二抗1 h。采用ECL發(fā)光液檢測蛋白條帶，GAPDH為內(nèi)參。

1.5 CCK-8法

采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性，以評估安羅替尼細(xì)胞毒性。將轉(zhuǎn)染后的A549和PC-9細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，以不同濃度（1、2、4、8、10、15、25、50、95 μg/mL）安羅替尼處理細(xì)胞。安羅替尼處理24 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育1 h。酶標(biāo)儀檢測450 nm吸光度。每組設(shè)置至少3個復(fù)孔。

1.6 克隆形成實驗

A549和PC-9細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，以0.25%胰酶-EDTA消化，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸并接種至6孔板，細(xì)胞密度為800/孔。繼續(xù)培養(yǎng)14 d，4%多聚甲醛固定后進(jìn)行0.1%結(jié)晶紫染色，拍照記錄克隆數(shù)。

1.7 Transwell法檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力

細(xì)胞遷移實驗不需預(yù)包被Transwell小室，細(xì)胞侵襲實驗前需用Matrigel包被Transwell小室。將轉(zhuǎn)染后的A549和PC-9細(xì)胞懸液加入Transwell上室無血清培養(yǎng)，Transwell下室加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。Transwell上室和下室中均含4 μg/mL安羅替尼，細(xì)胞在含5% CO2的37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，用棉簽擦去Transwell上室細(xì)胞。4%多聚甲醛固定后以0.1%結(jié)晶紫染色。隨機選取5個視野，計數(shù)每個視野中的遷移或侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

采用Annexin V/碘化丙啶染色，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用8 μg/mL安羅替尼處理24 h。細(xì)胞以胰酶消化，用PBS洗滌3次后重懸于binding buffer，加入Annexin-V-FITC和碘化丙啶溶液避光染色30 min。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，Annexin V陽性為早期凋亡細(xì)胞，Annexin V和碘化丙啶雙陽性為晚期凋亡細(xì)胞。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HOXA10在NSCLC中呈高表達(dá)

與人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5相比，HOXA10在人肺癌細(xì)胞A549和PC-9中呈高表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.030 3，P=0.001 2），表明HOXA10在NSCLC細(xì)胞中呈高表達(dá)。見圖1。

圖1 HOXA10在NSCLC細(xì)胞中的表達(dá)水平Fig.1 Expression of HOXA10 in NSCLC cell lines

2.2 敲低HOXA10降低安羅替尼在A549和PC-9細(xì)胞中的半數(shù)抑制濃度（half-maximal inhibitory concentration，IC50）

為了進(jìn)一步研究HOXA10對安羅替尼藥物敏感性的影響，分別將si-NC和si-HOXA10轉(zhuǎn)染至A549和PC-9細(xì)胞。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h，采用Western blotting檢測HOXA10表達(dá)水平。與轉(zhuǎn)染si-NC的A549和PC-9細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染si-HOXA10的細(xì)胞中HOXA10表達(dá)水平顯著降低，見圖2A。

將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以不同濃度（1、2、4、8、10、15、25、50、95 μg/mL）安羅替尼處理24 h，采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性，結(jié)果顯示，敲低HOXA10的A549和PC-9細(xì)胞的生存率顯著低于對照組（P<0.05），說明安羅替尼對敲低HOXA10的細(xì)胞增殖有抑制作用。見圖2B。此外，敲低HOXA10會降低安羅替尼 在A549和PC-9細(xì)胞中的IC50，si-NC-A549細(xì) 胞和si-HOXA10-A549細(xì)胞中安羅替尼的IC50分別為（35.29±3.24）和（18.33±2.07）μg/mL，si-NC-PC-9細(xì)胞和si-HOXA10-PC-9細(xì)胞中安羅替尼的IC50分別為（24.32±4.06）和（10.31± 2.83）μg/mL，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。

圖2 敲低HOXA10降低安羅替尼在A549和PC-9細(xì)胞中的IC50Fig.2 Half-maximal inhibitory concentration（IC50）of anlotinib after HOXA10 knockdown in A549 and PC-9 cells

2.3 敲低HOXA10后安羅替尼對細(xì)胞增殖的抑制作用增強

克隆形成實驗結(jié)果表明，A549和PC-9細(xì)胞中，未經(jīng)處理的轉(zhuǎn)染si-NC的細(xì)胞（si-NC組）、未經(jīng)處理的轉(zhuǎn)染si-HOXA10的細(xì)胞（si-HOXA10組）、經(jīng)4 μg/mL安羅替尼處理的細(xì)胞（Anlotinib組）比較，細(xì)胞增殖抑制率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05），經(jīng)4 μg/mL安羅替尼處理的轉(zhuǎn)染si-HOXA10的細(xì)胞（si-HOXA10+anlotinib組）與上述3組細(xì)胞比較，細(xì)胞增殖抑制率明顯增高（均P<0.05），說明敲低HOXA10后安羅替尼對細(xì)胞增殖的抑制作用增強。見圖3。

圖3 敲低HOXA10后安羅替尼對細(xì)胞增殖抑制作用增強Fig.3 Inhibition of cell proliferation by anlotinib is enhanced after HOXA10 knockdown

2.4 敲低HOXA10后安羅替尼對細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用增強

Transwell細(xì)胞遷移和侵襲實驗表明，A549和PC-9細(xì)胞中，未經(jīng)處理的轉(zhuǎn)染si-NC的細(xì)胞（si-NC組）、未經(jīng)處理的轉(zhuǎn)染si-HOXA10的細(xì)胞（si-HOXA10組）、經(jīng)4 μg/mL安羅替尼處理的細(xì)胞（Anlotinib組）比較，細(xì)胞遷移和侵襲相對數(shù)量的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05），經(jīng)4 μg/mL安羅替尼處理的轉(zhuǎn)染si-HOXA10的細(xì)胞（si-HOXA10+anlotinib組）與上述3組細(xì)胞比較，細(xì)胞遷移和侵襲相對數(shù)量明顯降低（均P<0.05），說明敲低HOXA10后安羅替尼對細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用增強。見圖4。

圖4 敲低HOXA10后安羅替尼對細(xì)胞遷移和侵襲抑制作用增強Fig.4 Anlotinib-induced inhibition of cell migration and invasion is enhanced after HOXA10 knockdown

2.5 敲低HOXA10促進(jìn)安羅替尼誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果（圖5）顯示，8 μg/mL安羅替尼誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染si-NC的A549或PC-9細(xì)胞凋亡。未經(jīng)處理的si-NC-A549細(xì)胞凋亡率為（14.14±3.9）%；經(jīng)安羅替尼處理的si-NC-A549細(xì)胞凋亡率為（15.11±4.2）%；未經(jīng)處理的si-HOXA10-A549細(xì)胞凋亡率為（18.63±3.8）%；經(jīng)安羅替尼處理的si-HOXA10-A549細(xì)胞凋亡率為（36.9±4.5）%；未經(jīng)處理的si-NC-PC-9細(xì)胞凋亡率為（16.31±4.2）%；經(jīng)安羅替尼處理的si-NC-PC-9細(xì)胞凋亡率為（16.59±3.7）%；未經(jīng)處理的si-HOXA10-PC-9細(xì)胞凋亡率為（20.78±3.8）%；經(jīng)安羅替尼處理的si-HOXA10-PC-9細(xì)胞凋亡率為（32.31±3.9）%。與對照組相比，相同濃度安羅替尼顯著上調(diào)敲低HOXA10的A549或PC-9細(xì)胞的凋亡率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.001）。結(jié)果表明，敲低HOXA10促進(jìn)安羅替尼誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

圖5 敲低HOXA10促進(jìn)安羅替尼誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡Fig.5 Anlotinib-induced apoptosis is enhanced after HOXA10 knockdown

3 討論

腫瘤耐藥性在晚期NSCLC患者的治療中幾乎無法避免。盡管第一代酪氨酸激酶抑制劑吉菲替尼、厄洛替尼和?？颂婺岬缺蛔C明能夠有效治療NSCLC，但研究［7］發(fā)現(xiàn)，在中位治療時間10個月后患者會出現(xiàn)耐藥問題。近年來研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤耐藥是多種基因共同作用的結(jié)果，鑒定相關(guān)耐藥分子并闡明其作用機制，對增加腫瘤細(xì)胞藥物敏感性、提高臨床療效十分重要。

HOXA10屬于同源異型盒基因家族，該家族成員多為轉(zhuǎn)錄因子，以高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域調(diào)控下游目的基因表達(dá)［8］。HOX基因家族許多成員在腫瘤中異常表達(dá)，參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。HOXA10在多種惡性腫瘤中發(fā)揮促癌基因功能［9-10］。研究［11］發(fā)現(xiàn)，HOXA10在NSCLC中高表達(dá)，然而其作用機制尚不清楚。本研究通過實時定量PCR檢測NSCLC細(xì)胞中HOXA10表達(dá)水平，結(jié)果表明HOXA10在NSCLC細(xì)胞中呈高表達(dá)，與最新臨床樣本分析［12］結(jié)果一致。

臨床研究［4-5］證實，安羅替尼作為三線抗腫瘤藥物可有效提高晚期NSCLC患者的總生存期。機制研究［13］發(fā)現(xiàn)，安羅替尼通過抑制趨化因子CCL2而抑制血管生成，血清CCL2水平是潛在的NSCLC預(yù)后指標(biāo)?；赗NA測序技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析［6］發(fā)現(xiàn)，肺癌細(xì)胞中CXC趨化因子配體2（C-X-C motif ligand 2，CXCL2）與安羅替尼耐藥性相關(guān)。在安羅替尼敏感的NCI-H1975細(xì)胞中，安羅替尼可以顯著下調(diào)CXCL2水平；而在耐藥細(xì)胞中，安羅替尼對CXCL2表達(dá)水平無明顯影響。后續(xù)功能實驗［6］驗證了CXCL2對安羅替尼耐藥性的影響。值得注意的是，轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析［6］也發(fā)現(xiàn)HOXA10在安羅替尼敏感細(xì)胞中可被安羅替尼顯著下調(diào)，而在耐藥細(xì)胞中無明顯變化，提示HOXA10與NSCLC安羅替尼敏感性相關(guān)。

與NCI-H1975細(xì)胞相比，A549和PC-9細(xì)胞對安羅替尼的敏感性相對較差。因此，本研究選擇了這2個細(xì)胞系用于研究安羅替尼耐藥性。本研究通過敲低HOXA10，首次探討了其與安羅替尼藥物敏感性的關(guān)系。由于本研究使用了濃度較低的安洛尼替處理細(xì)胞，在對照組未觀察到安羅替尼對細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的明顯抑制作用。而CCK-8和克隆形成實驗證實，敲低HOXA10顯著增加安羅替尼的細(xì)胞毒性，增強其抑制細(xì)胞增殖的作用。Transwell實驗發(fā)現(xiàn)，在HOXA10低表達(dá)細(xì)胞中，安羅替尼抑制細(xì)胞遷移和侵襲的能力明顯增強。此外，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，敲低HOXA10促進(jìn)安羅替尼誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。由此可見，敲低HOXA10可提高A549和PC-9細(xì)胞對安羅替尼的敏感性。由于腫瘤細(xì)胞耐藥機制比較復(fù)雜，后續(xù)還需要通過動物體內(nèi)實驗進(jìn)一步驗證。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)HOXA10在NSCLC中對增強安羅替尼敏感性起關(guān)鍵作用，為提高安羅替尼治療效果提供了新的思路。