王佳鑫，余東林，楊 希，劉雪會(huì)，呂 湘

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 病理生理學(xué)系 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100005

成熟的哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞是無(wú)核的。紅系造血在祖細(xì)胞階段具有正常的細(xì)胞核,進(jìn)入終末分化后經(jīng)歷原始紅細(xì)胞(proerythroblast, ProE)、早幼紅細(xì)胞(basophilic erythroblast, BasoE)、中幼紅細(xì)胞(polychromatophilic erythroblast, PolyE)以及晚幼紅細(xì)胞(orthochromatic erythroblast, OrthoE)時(shí)期,細(xì)胞核固縮并最終被排出[1]。

Ikzf1編碼含6個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子IKAROS,是鋅指 DNA 結(jié)合蛋白家族成員,與染色質(zhì)重塑相關(guān),對(duì)造血系統(tǒng)的發(fā)育至關(guān)重要。IKAROS參與染色質(zhì)重塑復(fù)合物SWI/SNF 相關(guān)蛋白復(fù)合物(PYR 復(fù)合物)的DNA結(jié)合,其含量與PYR復(fù)合物形成具有劑量效應(yīng)[2]。IKAROS缺失小鼠存在淋巴細(xì)胞、干細(xì)胞和多種造血細(xì)胞缺陷,包括貧血和巨核細(xì)胞異常。其缺失還可引起珠蛋白基因簇γ 到 β發(fā)育開關(guān)的轉(zhuǎn)換延遲[3]。但I(xiàn)kzf1在紅系終末分化過程中的作用尚不十分清楚。

SCENIC(single-cell regulatory network inference and clustering)分析可基于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄因子[4]。本研究使用SCENIC分析對(duì)人和小鼠骨髓紅系細(xì)胞單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘,并在小鼠胎肝體外分化系統(tǒng)中驗(yàn)證預(yù)測(cè)所得轉(zhuǎn)錄因子Ikzf1基因是否調(diào)控紅系終末分化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞:人胚腎上皮細(xì)胞系HEK-293T(ATCC細(xì)胞庫(kù));原代小鼠胎肝Ter119陰性細(xì)胞取自C57BL/6J孕鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)E13.5胎肝,通過Ter119磁珠陰性分選獲得。

1.1.2 試劑:地塞米松、β-巰基乙醇、全轉(zhuǎn)鐵蛋白(holo-transferrin)、MTG和膽固醇(Sigma-Aldrich公司); 培養(yǎng)基IMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium)和DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)(Servicebio公司);SCF和IGF-1(Stem cell公司);EPO和IL-3(Peprotech公司);胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、L-谷氨酰胺(L-glutamine)和PFHM-Ⅱ(Gibco公司);重組人胰素(翎圣公司);Ter119磁珠(BD公司);F108和青霉素-鏈霉素(Invitrogen公司);膠回收試劑盒(賽默飛世爾公司);T4 DNA連接酶及緩沖液、EcoRⅠ、XhoⅠ內(nèi)切酶(New England Biolabs公司);感受態(tài)細(xì)胞DH5α(北京擎科生物科技股份有限公司);線性PEI轉(zhuǎn)染試劑 (北京蘭博利德高新技術(shù)企業(yè));Trizol reagent(Life Technologies)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green PCR Mix(南京諾唯贊生物科技公司)。

1.1.3 流式抗體及染料:抗小鼠 CD16、CD32 抗體封閉劑、Hoechst 33342和Ter119-PE(Sigma-Aldrich公司),CD71-APC(BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒的構(gòu)建:利用 SplashRNA(http://splashrna.mskcc.org)設(shè)計(jì)兩條Ikzf1的shRNA序列,序列信息見表1。序列前后加上保護(hù)堿基和酶切位點(diǎn),由上海生工公司合成,梯度退火得到各自相應(yīng)雙鏈DNA。SFFV-GFP-miR30 載體質(zhì)粒經(jīng)酶切后與雙鏈DNA連接。使用DH5α 感受態(tài)細(xì)胞于LB培養(yǎng)基(含氨芐)中轉(zhuǎn)化后37 ℃過夜孵育,次日挑取各3個(gè)單克隆進(jìn)行測(cè)序,確定構(gòu)建成功的質(zhì)粒。

表1 小鼠Ikzf1基因及對(duì)照干擾序列Table 1 shRNA sequences for control luciferase and mouse Ikzf1 gene

1.2.2 病毒的包裝:將HEK-293T于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基,恒溫37 ℃,5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。配制500 μL的病毒包裝質(zhì)粒體系(psPAX2 7.5 μg、pMD2G 3.5 μg、相應(yīng)的干擾質(zhì)粒10 μg、轉(zhuǎn)染試劑P4000 20 μL和0.9%氯化鈉溶液), 混勻后室溫靜置15 min。將其加入培養(yǎng)至70%-80% 匯合的HEK-293T細(xì)胞。48 h和72 h后各收集一次培養(yǎng)基(病毒上清),以4 ℃ 3 000×g的條件離心10 min后用0.45 μm濾膜過濾掉細(xì)胞沉淀。然后通過4 ℃ 50 000×g離心濾液4 h得到病毒沉淀,用胎肝增殖培養(yǎng)基重懸后凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 小鼠Ter119陰性胎肝細(xì)胞的體外紅系分化:取新鮮或凍存的小鼠胎肝Ter119陰性細(xì)胞,用胎肝增殖培養(yǎng)基重懸培養(yǎng)。24 h后加入5% HEPES、5% F108和相應(yīng)病毒懸液感染胎肝細(xì)胞,增殖培養(yǎng)3 d后換分化培養(yǎng)基培養(yǎng)4 d,收集細(xì)胞用于檢測(cè)[5],培養(yǎng)基配方見表2。

表2 胎肝增殖和分化培養(yǎng)基配方Table 2 Fetal liver proliferation and differentiation medium formulation

1.2.4 流式熒光激活細(xì)胞的分選與分析:收集106個(gè)上述胎肝體外分化細(xì)胞加入0.5 μL FcR于4 ℃封閉15 min。加入抗鼠Ter119-PE、CD71-APC抗體,4 ℃避光孵育30 min。4 ℃ 500×g離心5 min,PBS洗滌一次后,加入 Hoechst 33342染料室溫染色10 min。使用SONY MA900全自動(dòng)流式分選儀進(jìn)行流式數(shù)據(jù)采集,分析體外紅系分化和脫核效率,數(shù)據(jù)分析使用Flow JoV10軟件。其余細(xì)胞收集洗滌后上機(jī)分選GFP陽(yáng)性細(xì)胞約50萬(wàn)個(gè),用于干擾效率檢測(cè)。另將誘導(dǎo)體外紅系分化第4天的胎肝細(xì)胞按CD71與Ter119信號(hào)強(qiáng)度分為R1-R5 5個(gè)不同成熟度的紅系終末分化細(xì)胞群分別分選收集,用于檢測(cè)Ikzf1基因表達(dá)。

1.2.5 RT-qPCR檢測(cè)mRNA:上述收取的R1-R5和GFP陽(yáng)性細(xì)胞,分別使用Trizol提取RNA,檢測(cè)濃度和質(zhì)量合格后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR Green法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析(擴(kuò)增條件:95 ℃ 5 min, 95 ℃ 10 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 40個(gè)循環(huán),72 ℃ 5 min),檢測(cè)Ikzf1基因在mRNA水平的表達(dá)情況。引物序列見表3。

表3 RT-qPCR引物序列Table 3 Primer sequences for RT-qPCR

1.2.6 生物信息分析: 在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)獲取小鼠和人紅系終末分化過程中各個(gè)階段的bulk轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集(GSE53983)[6],對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行清洗后,通過hisat2軟件分別比對(duì)到小鼠基因組mm10和人類基因組hg19獲取sam文件,經(jīng)samtools壓縮為bam文件,最后通過featureCounts軟件獲得基因表達(dá)矩陣。

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析:從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載人血細(xì)胞單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集GSE149938[8],選擇其中的紅系細(xì)胞亞群數(shù)據(jù)。并從下述鏈接(https://nicheview.shiny.embl.de/)下載處理好的小鼠骨髓單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)NicheData10x.rda,提取其中的紅系細(xì)胞[7],使用Seurat包,經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化,歸一以及降維和聚類等分析后,使用SCENIC包預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄因子。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析提示 Ikzf1參與紅系終末分化調(diào)控

利用Seurat處理并提取人血細(xì)胞和小鼠骨髓單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集(GSE149938和GSE122467)中的紅系細(xì)胞群體(圖1A,B)。SCENIC預(yù)測(cè)分別得到人和小鼠紅系細(xì)胞潛在調(diào)控因子(regulon)314個(gè)和202個(gè),包括158個(gè)人與小鼠共有,156個(gè)人類特異的和44個(gè)小鼠特異的調(diào)控因子(圖1C)。其中Ikzf1作為人與小鼠數(shù)據(jù)共同預(yù)測(cè)到紅系調(diào)控因子,其regulon活性和RNA表達(dá)水平在人與小鼠紅系細(xì)胞中均較高(圖1D,E)。

A,B.t-SNE projection of human (A) and mouse (B) bone marrow erythroid cells from two publicly available datasets (human GSE149938, mouse GSE122467), subclusters were shown in different colors; C.Venn diagram represented SCENIC predicted transcription factors using the datasets shown in A and B; D, E.regulon activity (left) and RNA expression (right) of Ikzf1 in human (D) and mouse (E) erythroid cells.圖1 人和小鼠骨髓紅系單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組SCENIC分析共同提示 Ikzf1參與調(diào)控紅系終末分化Fig 1 SCENIC analysis for the single cell transcriptome of human and mouse bone marrow erythroid cells suggested the involvement of Ikzf1 in terminal erythroid differentiation

2.2 Ikzf1在人和小鼠紅系終末分化早期富集

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集(GSE53983)分析提示IKZF1在人早幼紅細(xì)胞BasoE,尤其是BasoE晚期(late-BasoE)表達(dá)水平最高, 而后逐漸下調(diào)(圖2A)。小鼠Ikzf1基因也在紅系終末分化早期高表達(dá),但在原紅細(xì)胞ProE中表達(dá)水平最高(圖2B)。進(jìn)一步在小鼠胎肝細(xì)胞體外紅系分化體系中驗(yàn)證,利用紅系終末分化標(biāo)志Ter119與CD71的熒光信號(hào)強(qiáng)度判斷細(xì)胞分化成熟度,共分為5個(gè)細(xì)胞群(R1～R5),RT-qPCR分析顯示Ikzf1在終末分化早期的R2～R3(即原紅和早幼紅細(xì)胞)有較高表達(dá),隨后表達(dá)水平開始下降(圖2C),與小鼠的骨髓轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致。

2.3 敲低Ikzf1抑制小鼠胎肝來(lái)源紅系細(xì)胞終末分化及脫核

與對(duì)照組相比,兩條shRNA干擾序列均顯著降低Ikzf1的mRNA表達(dá)水平(圖3A)。在分化第4天時(shí)流式細(xì)胞分析檢測(cè)紅系分化效率和細(xì)胞脫核率。與對(duì)照組相比,敲低Ikzf1抑制紅系終末分化進(jìn)程,主要表現(xiàn)為早幼紅細(xì)胞R3增多,中幼紅R4減少(圖3B),無(wú)核紅細(xì)胞(Ter119+Hoechst-)的比例即脫核率顯著降低(圖3C)。

3 討論

本研究利用人和小鼠骨髓紅系單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,并結(jié)合已發(fā)表的bulk轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和功能實(shí)驗(yàn)初步研究了轉(zhuǎn)錄因子Ikzf1在紅系終末分化過程中的表達(dá)變化及功能。 結(jié)果顯示Ikzf1在紅系終末分化早期的原紅和早幼紅細(xì)胞階段表達(dá)較高,敲低Ikzf1表達(dá)導(dǎo)致小鼠胎肝細(xì)胞體外紅系分化阻滯在早幼紅時(shí)期,同時(shí)細(xì)胞脫核受阻,提示Ikzf1參與調(diào)控紅系終末分化。

早期在敲除鼠中的研究工作發(fā)現(xiàn)IKAROS缺失會(huì)引起多系造血細(xì)胞生成障礙,其中紅系祖細(xì)胞BFU-E和CFU-E的比例大幅下降[8]。IKAROS敲除鼠可成活但存在貧血和明顯的脾臟紅系造血代償,骨髓中原紅和早幼紅細(xì)胞比例有所增加[4]。有趣的是,僅影響其DNA結(jié)合能力的IkarosPlastic點(diǎn)突變反而導(dǎo)致胚胎純合致死,伴隨更明顯的貧血表型以及早幼紅至晚幼紅細(xì)胞的數(shù)量大幅減少,脫核率也顯著降低[9]。此外,近年臨床研究發(fā)現(xiàn)IKZF1基因點(diǎn)突變與先天性純紅細(xì)胞再生障礙性貧血(Diamond-Blackfan anemia, DBA)的發(fā)生有關(guān)[9],支持IKZF1在紅系終末分化中發(fā)揮重要作用[10]。本研究利用小鼠胎肝體外紅系分化體系,觀察到敲低Ikzf1后紅系終末分化受到抑制,且脫核率降低顯著,為Ikzf1參與紅系終末分化提供了更為直接的證據(jù)。

在分子水平上,IKAROS可通過與靶位點(diǎn)直接結(jié)合,募集SWI/SNF和 NURD 復(fù)合物發(fā)揮激活或抑制基因轉(zhuǎn)錄的功能,影響包括CD71 轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、EKLF在內(nèi)的多個(gè)紅系基因表達(dá)[3]。在IkarosPlastic純合突變鼠胎肝原紅細(xì)胞中觀察到c-Kit表達(dá)的明顯下降[9]。Ikzf1調(diào)控紅系終末分化和脫核過程的下游靶基因和具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。