固態(tài)發(fā)酵葛根渣制備葛根素

張帥，羅靜怡，唐婷范，程昊*，劉承耀

（1.肇慶學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，廣東 肇慶 526601；2.廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西柳州螺螄粉工程技術(shù)研究中心，廣西 柳州 545006；3.蔗糖產(chǎn)業(yè)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西 南寧 530004；4.濟(jì)南市第六人民醫(yī)院/濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬章丘區(qū)人民醫(yī)院骨關(guān)節(jié)科，山東 濟(jì)南 250200）

葛根（Radix puerariae）是多年生落葉藤本植物野葛或甘葛藤的塊根[1]。野葛[Pueraria lobata（Willd.）O－h(huán)wi]和粉葛（P.thomsonii Benth.）是最具代表性的兩種葛根，由于含有異黃酮和淀粉因而具有藥食兩用特性[2]。廣東和廣西主要分布的是粉葛，粉葛淀粉含量高，因而主要用于食品工業(yè)中葛粉的生產(chǎn)[3]。葛粉加工后會(huì)產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物葛根渣，葛根渣通常是作為廢棄物被填埋或焚燒，有時(shí)會(huì)用作花卉植物和食用菌的栽培料，利用價(jià)值很低且易造成環(huán)境污染[4-5]。

葛粉加工主要是將葛根淀粉提取出來(lái)，異黃酮損失很小，因而葛根渣中通常含有大量異黃酮[6]。葛根異黃酮的主要成分是葛根素，葛根素是大豆苷元的8-C-葡萄糖苷[7]，具有廣泛的藥理作用，如舒張血管、保護(hù)心臟和神經(jīng)、抗氧化、抗炎癥、止痛、促進(jìn)骨形成、提高細(xì)胞免疫力、減輕胰島素抵抗等，臨床上已用于心腦血管疾病、糖尿病及并發(fā)癥、骨壞死、帕金森、阿爾茨海默、子宮內(nèi)膜異位及癌癥的治療[8-14]。

提取葛根素的常規(guī)方法是醇提法[15-17]。由于葛根細(xì)胞壁的纖維素及半纖維素組成的結(jié)晶結(jié)構(gòu)能阻礙葛根素的有效溶出，因而醇提法雖然簡(jiǎn)單易行，但葛根素提取率較低[18-19]，目前僅限于實(shí)驗(yàn)室研究。為了破壞細(xì)胞壁的纖維結(jié)構(gòu)，使葛根素易于溶出，先加入纖維素酶進(jìn)行水解，然后再提取葛根素，可顯著提高產(chǎn)品得率。然而纖維素酶目前價(jià)格還比較高，因此采用酶法提取葛根素生產(chǎn)成本較高，難以實(shí)現(xiàn)規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)。

本研究利用黑曲霉菌株固態(tài)發(fā)酵葛根渣高效制備葛根素。通過(guò)微生物自身酶系對(duì)植物細(xì)胞壁的酶解作用來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞通透性，從而提高葛根素的提取率。將發(fā)酵產(chǎn)物用乙醇提取以獲得葛根素粗提物，最后采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法檢測(cè)粗提物中葛根素的含量。通過(guò)微生物發(fā)酵技術(shù)獲得葛根素，生產(chǎn)成本低，產(chǎn)品得率高，發(fā)酵后的培養(yǎng)基殘?jiān)€可用作肥料，因而有望實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。本研究對(duì)于促進(jìn)我國(guó)葛根及相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義，也可為其他天然活性產(chǎn)物的高效制備提供方法參考和技術(shù)示范。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種：黑曲霉，肇慶學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院食品微生物實(shí)驗(yàn)室4℃冰箱保藏；葛根渣：柳州市葛源貿(mào)易有限責(zé)任公司，105℃烘干至恒重后粉碎，過(guò)50目篩。粉末狀葛根渣封袋備用。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）（粉末狀商品）：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，按說(shuō)明書(shū)配好后分裝試管，滅菌后做成PDA斜面若干，冷藏備用。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：葛根渣8.0g，麩皮3.0g（渣麩質(zhì)量比8∶3），NH4NO30.85g，MnCl20.05g，MgSO4·7H2O0.005g，KH2PO40.005 g，水8.3 g（約占固體成分質(zhì)量的70%）。

葛根素標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）：成都埃法生物科技有限公司；甲醇（色譜純）：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DGX-9143 B-1電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴箱：江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；LC-2030高效液相色譜儀（配套SPD-10A紫外檢測(cè)儀）：日本島津公司；XB-10B高速多功能粉碎機(jī)：東莞市隆鑫機(jī)電設(shè)備有限公司；H-1850臺(tái)式高速離心機(jī)：湘潭湘儀儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑曲霉菌懸液制備

將黑曲霉劃線接種于PDA斜面，30℃培養(yǎng)72 h后斜面長(zhǎng)滿(mǎn)黑色孢子。無(wú)菌條件下，取1環(huán)孢子接入10 mL已滅菌的含0.1%吐溫-80的0.85%生理鹽水中搖勻，即得黑曲霉菌懸液。

1.3.2 固態(tài)發(fā)酵葛根渣

取250 mL錐形瓶若干，分別裝入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌后分別接入1 mL黑曲霉菌懸液，振蕩錐形瓶使菌懸液盡量均勻分布于培養(yǎng)基中30℃發(fā)酵。不同錐形瓶分別發(fā)酵 24、48、72、96、120、144、168h，然后分別提取葛根素并測(cè)定發(fā)酵物料的木聚糖酶和CMC酶活力。

1.3.3 木聚糖酶和CMC酶活力測(cè)定

參考施英英等[20]的測(cè)定方法，一個(gè)木聚糖酶活力國(guó)際單位（IU）表示每分鐘降解反應(yīng)底物木聚糖釋放1.0 μmol還原糖（以木糖計(jì)）所需的酶量；以羧甲基纖維素鈉（sodium salt of caboxy methyl cellulose，CMCNa）作為底物測(cè)定CMC酶的活力，1個(gè)酶活力單位（U）定義為在50℃、pH4.8條件下每小時(shí)降解底物生成1.0 mg還原糖（以葡萄糖計(jì)）所需的酶量。

1.3.4 葛根素提取

發(fā)酵結(jié)束后，取出一半發(fā)酵物料置于另一250 mL錐形瓶中，在兩個(gè)發(fā)酵物料錐形瓶中各加入70%乙醇溶液100 mL，搖勻后置于80℃恒溫水浴中提取180 min，期間每30 min振搖一次錐形瓶。最后將瓶?jī)?nèi)物料進(jìn)行抽濾，濾液合并即為葛根素粗提液。

1.3.5 葛根素HPLC檢測(cè)

1.3.5.1 樣品預(yù)處理

將葛根素粗提液置于高速離心機(jī)中，10 000 r/min離心20 min后，收集上清液，共得170 mL。上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后，進(jìn)樣高效液相色譜儀檢測(cè)。

1.3.5.2 葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

先將葛根素標(biāo)準(zhǔn)品用30%乙醇溶液配制成濃度為1.0 mg/mL的葛根素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，然后按0.001、0.010、0.200、0.400、0.600、0.800 mg/mL 的濃度梯度稀釋。以葛根素標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5.3 色譜條件

色譜柱：Shim-pack VP-ODS型C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm），流動(dòng)相：甲醇-水（體積比 30∶70），檢測(cè)波長(zhǎng)250nm，流速1mL/min，進(jìn)樣量10μL，恒定柱溫30℃。

1.3.5.4 發(fā)酵葛根渣所得葛根素含量的計(jì)算

求出樣品色譜峰面積，代入葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出樣品中葛根素濃度Cx，則發(fā)酵葛根渣所得葛根素含量：C1/（mg/g）=（170×Cx）/8.0。

1.3.6 葛根渣直接醇提葛根素及檢測(cè)

稱(chēng)取葛根渣4.0 g置于250 mL錐形瓶中，加入70%乙醇溶液100 mL提取葛根素，操作方法同1.3.4。獲得的葛根素粗提液按1.3.5.1預(yù)處理后共收集到75 mL。葛根素HPLC檢測(cè)色譜條件同1.3.5.3。求出樣品色譜峰面積，由葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出葛根素濃度Cy，則葛根渣直接醇提的葛根素含量：C2/（mg/g）=（75×Cy）/4.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 葛根渣固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)葛根素和產(chǎn)酶進(jìn)程

葛根渣固態(tài)發(fā)酵不同時(shí)間產(chǎn)葛根素進(jìn)程如圖1所示，產(chǎn)酶（木聚糖酶和CMC酶）進(jìn)程如圖2所示。

圖1 固態(tài)發(fā)酵葛根渣產(chǎn)葛根素進(jìn)程Fig.1 Puerarin production process of solid state fermentation of Pueraria root residue

圖2 固態(tài)發(fā)酵葛根渣產(chǎn)酶進(jìn)程Fig.2 Enzyme production process of solid state fermentation of Pueraria root residue

木聚糖酶能夠降解葛根細(xì)胞壁中的半纖維素[21]，而CMC酶則可以將細(xì)胞壁纖維素分解[22]，二者協(xié)同作用可進(jìn)一步提高葛根細(xì)胞壁的通透性[3]，從而加速胞內(nèi)葛根素的溶出。由圖1和圖2可知，產(chǎn)葛根素進(jìn)程與產(chǎn)酶進(jìn)程二者密切相關(guān)。發(fā)酵24 h時(shí)培養(yǎng)基內(nèi)僅生成少量白色菌絲，此時(shí)產(chǎn)酶很低，對(duì)葛根細(xì)胞壁通透性的影響較小，因此測(cè)得的葛根素含量基本等同于直接醇提葛根渣獲得的葛根素。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，菌絲增加、孢子生成，酶活力迅速提升，葛根細(xì)胞壁通透性不斷加強(qiáng)，葛根素含量亦不斷提高。當(dāng)發(fā)酵72 h時(shí)，培養(yǎng)基內(nèi)已長(zhǎng)滿(mǎn)黑色孢子，CMC酶活力達(dá)到最高值1 274 U/g，發(fā)酵96 h時(shí)，木聚糖酶活力達(dá)到最高值8 825 IU/g，繼續(xù)發(fā)酵，隨著菌體的老化，酶活力逐漸下降。由于酶對(duì)細(xì)胞壁的降解破壞作用是累積的，因此葛根素含量達(dá)到最高值需要比酶活力達(dá)到最高值更長(zhǎng)的發(fā)酵時(shí)間，當(dāng)發(fā)酵至120 h時(shí)，葛根素含量已接近最大值，繼續(xù)發(fā)酵，葛根素含量雖略有提高，但曲線已趨于平穩(wěn)，說(shuō)明葛根素已最大程度溶出。

2.2 葛根素HPLC檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線

不同濃度的葛根素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的HPLC圖如圖3所示。

圖3 葛根素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的HPLC圖Fig.3 HPLC chart of puerarin standard solution

基于葛根素濃度和色譜峰面積建立的葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=46 053 070.57x-25 078.99，校正系數(shù)R2=0.999 86，表明方程線性擬合良好。

2.2.2 葛根渣中葛根素含量

固態(tài)發(fā)酵葛根渣120 h后，發(fā)酵物料中的葛根素HPLC檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。直接醇提葛根渣所得葛根素HPLC色譜圖如圖5所示。

圖4 葛根渣發(fā)酵后醇提液葛根素的HPLC圖Fig.4 HPLC chart of puerarin in alcohol extract of Pueraria root residue after fermentation

圖5 葛根渣醇提液葛根素的HPLC圖Fig.5 HPLC chart of puerarin in alcohol extract of Pueraria root residue

由圖4可知，根據(jù)樣品色譜峰面積，求得葛根素含量為5.68 mg/g。由圖5可知，根據(jù)樣品色譜峰面積，求得葛根素含量為3.25 mg/g?？梢?jiàn)，由于黑曲霉固態(tài)發(fā)酵葛根渣產(chǎn)生的木聚糖酶、CMC酶對(duì)葛根細(xì)胞壁纖維結(jié)構(gòu)的降解破壞作用，使得葛根渣發(fā)酵后醇提液中的葛根素含量比直接醇提葛根渣所得葛根素提高了74.8%。

3 結(jié)論

本文研發(fā)了一項(xiàng)利用葛根加工廢棄物葛根渣來(lái)高效制備葛根素的技術(shù)。用黑曲霉對(duì)葛根渣進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，產(chǎn)生的木聚糖酶和CMC酶可以降解葛根細(xì)胞壁的半纖維素和纖維素，達(dá)到破壞細(xì)胞壁纖維結(jié)構(gòu)、增大細(xì)胞壁通透性從而使葛根素易于溶出的目的。8.0 g葛根渣經(jīng)固態(tài)發(fā)酵120 h后，利用HPLC檢測(cè)的葛根素含量高達(dá)5.68 mg/g，比直接醇提葛根渣獲得的葛根素含量提高了74.8%，實(shí)現(xiàn)了葛根素的高效制備。