陳芷羽,胡群祺,馬益琪,費雪瑜,李想,蔣晨琳,王涵芝,瞿思穎,方劍喬,何曉芬,蔣永亮

(浙江中醫(yī)藥大學第三臨床醫(yī)學院康復醫(yī)學院,杭州 310053)

糖尿病神經痛(diabetic neuropathic pain, DNP)是一種常見的糖尿病并發(fā)癥,屬于典型的外周性神經病理性疼痛[1]。DNP常表現為對熱和機械性刺激的敏感性增高。DNP癥狀可采用鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)誘導的糖尿病鼠模型進行模擬,STZ誘導的糖尿病模型大鼠有較長的病程,造模后可出現顯著的熱痛和機械痛變化[2],有很多研究通過檢測大鼠機械痛閾和熱痛閾來評價DNP模型[3-4]。

小膠質細胞在調節(jié)DNP的形成中發(fā)揮著重要作用,已成為治療 DNP的重要靶點[5]。脊髓中離子鈣結合適配器分子(ionized calcium binding adapter molecule 1, Iba1)是小膠質細胞的標記物之一。脊髓背角離子通道型嘌呤能受體 P2X4(purinergic ligand-gated ion channel 4 receptor, P2X4R)在神經病理性痛痛覺過敏中起重要作用,P2X4R的表達下調,痛覺過敏癥狀明顯減輕甚至逆轉[6-7]。目前電針已被廣泛用于治療各種慢性疼痛,已有研究表明電針能緩解DNP[8-9],但其鎮(zhèn)痛機制有待進一步明確和探究。已有研究表明,在坐骨神經慢性壓迫性損傷模型中,電針可能通過下調P2X4R表達以提高大鼠熱痛閾[10]。ZHENG Y等[11]研究表明電針可降低小膠質細胞P2X4R的高表達緩解 L5脊神經結扎誘導的神經病理痛,但電針對DNP模型大鼠脊髓P2X4R的干預作用有待研究。因此本實驗通過建立DNP大鼠模型來探討電針鎮(zhèn)痛是否與其有效干預脊髓背角小膠質細胞和P2X4R表達有關。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性SD大鼠20只,體質量(200±50)g,由中國科學院上海實驗動物中心動物科學實驗中心提供,許可證號為SCXK(滬)2018—0006。大鼠在12 h明暗交替、溫度20～25 ℃、濕度45%～55%的環(huán)境中飼養(yǎng),允許大鼠自由攝食和飲水。適應性喂養(yǎng)7 d后開始實驗操作。實驗過程中所有的操作嚴格遵守《關于善待實驗動物的指導性意見》中對實驗動物進行處置的相關規(guī)定。

1.2 實驗試劑與儀器

鏈脲佐菌素(S0130,美國Sigma),兔抗Iba1抗體(ab178846,英國 Abcam),兔抗 P2X4抗體(APR-002,以色列 Alomone),山羊抗兔二抗(7074,美國 CST),韓氏穴位神經刺激儀(HANS-200E,南京濟生醫(yī)療科技有限公司),足底熱痛儀(37370,意大利 Ugobasile),血糖儀(德國 Roche Diagnostics GmbH),純水儀(美國Thermo Fisher Scientific),全波長酶標儀(美國Molecular Devices),電泳儀(美國 Bio-Rad),轉印儀(美國 Bio-Rad),凝膠成像儀(美國 Bio-Rad),移液器(德國Eppendorf),pH計(瑞士METTLER TOLEDO)。

1.3 分組與模型制備

將20只大鼠隨機選取6只作為對照組,對其余14只大鼠禁食16 h后參照KAUR N等[12]造模方法予以腹腔注射STZ溶液(65 mg/kg),監(jiān)測大鼠體質量、空腹血糖和熱痛閾?？崭寡侵怠?6.7 mmol·L-1,熱痛閾下降≥15%以上[13-14]則表示DNP造模成功。DNP造模成功的大鼠有12只。對照組大鼠予以注射等量的檸檬酸鈉緩沖液。

1.4 干預方法

電針干預于造模后第 14天開始,選取自制的布套[15]將大鼠予以固定,根據邰昭霞等[16]實驗大鼠選穴依據,選取大鼠膝關節(jié)后外側,在腓骨小頭下5 mm的足三里穴和大鼠后肢外踝尖與跟腱之間凹陷處的昆侖穴。用規(guī)格為0.25 mm×13 mm的針灸針進行針刺,并連接電針儀進行電針干預,電針頻率為 2 Hz,強度為1～2 mA,每次治療30 min,每日1次,連續(xù)電針7 d。對照組和模型組大鼠于電針組干預的相同時間段不做任何干預,僅予以固定,每次固定 30 min,連續(xù)固定7 d。

1.5 指標檢測

1.5.1 空腹血糖測定

用尾靜脈采血檢測各組大鼠的空腹血糖,并在0 d、7 d、14 d、21 d測大鼠的體質量。

1.5.2 熱痛閾測定

參照FEI X Y等[17]測定大鼠熱痛閾的方法,待大鼠安靜后采用足底熱痛儀照射大鼠足底中部直至其產生抬足、舔足的反應時間,記作熱痛閾。檢測大鼠0 d、7 d、14 d、21 d足跖熱痛閾。

1.5.3 脊髓組織中Iba1和P2X4R蛋白表達檢測

參考杜俊英等[18]取大鼠脊髓背角的方法,腹腔注射戊巴比妥溶液麻醉大鼠并對其進行開胸,用生理鹽水快速灌注左心室及升主動脈至大鼠肝臟發(fā)白。將大鼠開背置于冰上,剪斷脊柱兩旁的肋骨,剪取L4節(jié)段以上約5 cm的脊柱,用50 mL注射器沖出脊髓,留取中間膨大區(qū)域并用刀片切取大鼠脊髓背角,放置超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。用Western blot法檢測小膠質細胞標記物Iba1和P2X4R蛋白表達。取出大鼠脊髓背角,加入裂解液,勻漿后離心。用BCA試劑盒進行蛋白定量檢測,再進行SDS-PAGE凝膠電泳,將分離的蛋白電泳至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉,加入一抗,稀釋比依次為兔抗 Iba1(1:1 000),P2X4R(1:1 000),內參β-actin抗體(1:5 000),4 ℃過夜。TBST洗滌3次后加入山羊抗兔二抗孵育1 h,用TBST洗滌3次,最后用ECL顯影。應用Image J軟件對結果進行圖像分析,計算目的蛋白與β-actin的灰度比值。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS22.0軟件對數據進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料采用均數±標準差表示;重復測量數據采用多次重復測量方差分析方法分析,其余數據采用單因素方差(one-way ANOVA)分析;若方差齊,組間兩兩比較采用LSD法,若方差不齊則采用Dunnett’s T3分析。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠體質量變化

各組大鼠 0 d體質量比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);與對照組比較,模型組和電針組大鼠在7 d、14 d、21 d體質量明顯下降,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);與模型組比較,電針組大鼠在7 d體質量上升,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。詳見圖1。

圖1 各組大鼠體質量變化情況

2.2 各組大鼠空腹血糖變化

各組大鼠 0 d空腹血糖比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);與對照組比較,模型組和電針組大鼠在7 d、14 d、21 d空腹血糖明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。詳見圖2。

圖2 各組大鼠空腹血糖變化情況

2.3 各組大鼠熱痛閾變化情況

各組大鼠0 d和7 d熱痛閾比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);與對照組比較,模型組大鼠在14 d、21 d熱痛閾明顯下降,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);與對照組比較,電針組大鼠在14 d熱痛閾明顯下降,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);與模型組比較,電針組大鼠在21 d熱痛閾明顯升高(P＜0.01)。詳見圖3。

圖3 各組大鼠熱痛閾變化情況

2.4 各組大鼠脊髓Iba1、P2X4R蛋白表達水平

與對照組比較,模型組Iba1、P2X4R蛋白表達明顯增加,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與模型組比較,電針組Iba1、P2X4R蛋白表達顯著減少,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。詳見圖4、圖5。

圖4 各組大鼠脊髓Iba1蛋白表達情況

圖5 各組大鼠脊髓P2X4R蛋白表達情況

3 討論

糖尿病是嚴重危害人類健康的慢性疾病之一[19],糖尿病神經痛(DNP)是其常見的并發(fā)癥之一[20]。DNP在臨床上表現為肢體疼痛、感覺減退、麻木、灼熱、冰涼等,也可表現為自發(fā)性疼痛、痛覺過敏、痛覺超敏,甚至發(fā)展至糖尿病足潰瘍或需要截肢,嚴重影響患者生活質量。STZ可誘發(fā)糖尿病[21],它可通過破壞胰島β細胞,導致血糖升高[22]。本實驗采用單次腹腔注射STZ誘導DNP大鼠模型,STZ注射后大鼠出現體質量下降,空腹血糖明顯上升,在STZ注射2周后熱痛閾下降,且持續(xù)至模后3周,說明DNP造模成功。

足三里為足陽明胃經的合穴,《靈樞·五邪》:“邪在脾胃,則病肌肉痛,陽氣有余,陰氣不足,則熱中善饑;陽氣不足,陰氣有余,則寒中腸鳴腹痛;陰陽俱有余,若俱不足,則有寒有熱,皆調于三里。”由此可見,除了本經的作用養(yǎng)胃健脾,足三里還可以鎮(zhèn)痛、平衡陰陽。有研究證明針刺足三里可以提高痛閾[23],臨床治療急性腎絞痛[24]、癌痛[25]、肩周炎[26]、三叉神經痛[27]效果顯著。昆侖為足太陽膀胱經的經穴,《針灸大成》中提到“昆侖主腰尻腳氣,足腨腫不得履地,鼽衄,腘如結,踝如裂,頭痛,肩背拘急,咳喘滿,腰脊內引痛……”,可見昆侖對身體各部有鎮(zhèn)痛作用,臨床多用來治療腰扭傷[28]、坐骨神經痛[29]、眉棱骨痛[30]等,近年來在無痛分娩[31]方面也取得了成效。更有研究發(fā)現,電針下肢穴位鎮(zhèn)痛效果比上肢更明顯[32],故本實驗選取足三里和昆侖二穴治療DNP。研究結果表明,電針可提高DNP大鼠的熱痛閾。

研究發(fā)現鞘內注射小膠質細胞抑制劑米諾環(huán)素[33]和P2X4R拮抗劑可抑制脊髓小膠質細胞和P2X4R的表達[4]。小膠質細胞源性腦源性神經營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)的合成與釋放與P2X4R密切相關[34-35]。周圍神經損傷后,P2X4可通過刺激小膠質細胞釋放 BDNF作用于脊髓背角神經元的酪氨酸激酶B受體參與神經痛[36]。王英等[37]研究表明,電針能夠通過調節(jié)神經元內生物活性物質的合成與釋放以發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應。ZHENG Y等[38]研究還發(fā)現電針可通過下調大鼠脊髓P2X4R緩解神經病理性疼痛。課題前期研究[39]表明,電針可能通過抑制DNP大鼠脊髓背角小膠質細胞表達和 BDNF的表達發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。故本課題進一步探究電針治療DNP除了與下調DNP大鼠脊髓小膠質細胞BDNF有關以外,是否還與其有效干預脊髓小膠質細胞和 P2X4R有關。研究結果表明,STZ注射后模型組大鼠脊髓背角上小膠質細胞和P2X4蛋白表達增多,電針可下調其蛋白表達。

綜上所述,低頻電針能有效改善糖尿病神經痛,可能與其有效干預脊髓小膠質細胞和 P2X4蛋白表達有關。