牽拉損傷對(duì)蛙坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位影響的定量研究

陳鈺涵，陳 穗，羅 勇，王水金，郭佳銘，林柏先，劉 靜，2

（1．汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院機(jī)能學(xué)實(shí)驗(yàn)室，廣東 汕頭 515041；2．汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，廣東 汕頭 515041）

周圍神經(jīng)損傷是臨床上常見(jiàn)的一類疾病，若未能及時(shí)有效地接受神經(jīng)修復(fù)和康復(fù)治療，患者的感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)功能將會(huì)受損，甚至喪失工作和生活能力[1]。而牽拉損傷是一種特殊的周圍神經(jīng)急性損傷類型，嚴(yán)重的牽拉損傷可引起失神經(jīng)支配導(dǎo)致不可逆的功能障礙[2]。某些手術(shù)容易引起神經(jīng)牽拉損傷，如甲狀腺腺葉切除術(shù)、腰椎間盤切除術(shù)等[3-4]。此外，牽拉伸長(zhǎng)神經(jīng)在一些手術(shù)操作中必不可少，如神經(jīng)延長(zhǎng)術(shù)和肢體延長(zhǎng)術(shù)等[5-6]。因此，神經(jīng)牽拉損傷也是這類手術(shù)的重要并發(fā)癥，若外科手術(shù)中牽拉使神經(jīng)張力過(guò)大將導(dǎo)致神經(jīng)損傷，從而影響神經(jīng)的修復(fù)與功能，而預(yù)防神經(jīng)牽拉損傷的關(guān)鍵在于明確神經(jīng)能夠耐受牽拉的程度。本研究使用牛蛙坐骨神經(jīng)作為研究對(duì)象，建立簡(jiǎn)便、可量化的神經(jīng)牽拉損傷模型，探究牽拉對(duì)蛙坐骨神經(jīng)動(dòng)作電位的影響及坐骨神經(jīng)能夠耐受的牽拉程度，為臨床手術(shù)中神經(jīng)牽拉損傷的研究提供動(dòng)物模型的參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

牛蛙60只，年齡、雌雄不限，健康，體質(zhì)量約200 g，由汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院機(jī)能學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要儀器和試劑

常用蛙類手術(shù)器械、經(jīng)典神經(jīng)干屏蔽盒、BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司）、艾德堡HP-5N推拉力計(jì)及HLA螺旋機(jī)架（樂(lè)清市艾德堡儀器有限公司）、任氏液（自配）。

1.3 蛙坐骨神經(jīng)干牽拉裝置

HP-5N推拉力計(jì)固定于配套的HLA螺旋機(jī)架上，轉(zhuǎn)動(dòng)螺旋機(jī)架的轉(zhuǎn)盤可使推拉力計(jì)勻速上升或下降。在推拉力計(jì)下方的小鐵鉤加套一條小塑膠管（圖1），使鉤子牽拉神經(jīng)干的接觸面積增大，同時(shí)避免金屬對(duì)神經(jīng)干的影響。牛蛙毀髓后剪開(kāi)大腿部皮膚，用玻璃分針沿坐骨神經(jīng)溝游離出坐骨神經(jīng)。用蛙足釘穿過(guò)蛙的髖關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié)，避開(kāi)坐骨神經(jīng)，將蛙固定在蛙板上，置于推拉力計(jì)下方。推拉力計(jì)調(diào)零后，使其鉤子勾住坐骨神經(jīng)干的中段，轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)盤，緩慢勻速地向上牽拉神經(jīng)干。當(dāng)推拉力計(jì)顯示拉力到達(dá)目標(biāo)拉力值后，維持拉力不變持續(xù)30 s。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中在神經(jīng)干表面滴加任氏液保持濕潤(rùn)。

圖1 蛙坐骨神經(jīng)干牽拉實(shí)驗(yàn)裝置示意圖

1.4 蛙坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位相關(guān)指標(biāo)的測(cè)量

牽拉后的坐骨神經(jīng)干兩端結(jié)扎后剪斷，離體，長(zhǎng)度約6～7 cm，在任氏液中浸泡10 min后，置于神經(jīng)干屏蔽盒中且使神經(jīng)干頭端位于刺激輸出電極一側(cè)，尾端位于記錄電極一側(cè)（圖2）。蓋上屏蔽盒蓋子，開(kāi)始運(yùn)行系統(tǒng)模塊：（1）最適刺激強(qiáng)度，程控單刺激，波寬0.05 ms，延時(shí)5 ms，采樣率50 kHz，刺激強(qiáng)度從0開(kāi)始，增量為0.02 V；（2）不應(yīng)期，起始波間隔8 ms，減量為0.2 ms，刺激時(shí)間間隔2 s，刺激強(qiáng)度2 V；（3）雙電極法測(cè)神經(jīng)干動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度，刺激強(qiáng)度2 V，見(jiàn)圖3。

圖3 蛙坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位相關(guān)指標(biāo)的測(cè)量

1.5 牽拉處理分組

將60只牛蛙的120根坐骨神經(jīng)隨機(jī)分為12組，每組10根，區(qū)分左右。其中一組為對(duì)照組，將神經(jīng)干離體后在任氏液中浸泡10.5 min，之后測(cè)量相關(guān)指標(biāo)。其余為實(shí)驗(yàn)組，各組體神經(jīng)干分別以0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2 N的拉力牽拉30 s，之后將神經(jīng)干離體，于任氏液中浸泡10 min后測(cè)量相關(guān)指標(biāo)。根據(jù)需要加做0.1、0.2、0.3 N組。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

將BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的數(shù)據(jù)導(dǎo)出，整理出各組標(biāo)本的動(dòng)作電位幅度、絕對(duì)不應(yīng)期、神經(jīng)干傳導(dǎo)速度。采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以[M（Q1，Q3）]表示，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同牽拉力對(duì)蛙坐骨神經(jīng)干完整性及活性的影響

牽拉力＜2.8 N時(shí)，神經(jīng)干未斷裂。牽拉力為2.8 N時(shí)，有2條神經(jīng)干引導(dǎo)出的動(dòng)作電位幅度為0 mV，其余神經(jīng)干可引導(dǎo)出一定幅度的雙相動(dòng)作電位。而牽拉力為3.2 N時(shí)，該組所有神經(jīng)干均斷裂。

2.2 不同牽拉力對(duì)蛙坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位波形的影響

選擇各組中有代表性（各項(xiàng)指標(biāo)接近平均值）的動(dòng)作電位波形進(jìn)行比較。牽拉力不超過(guò)2.8 N時(shí)，隨著刺激強(qiáng)度增大，動(dòng)作電位波形表現(xiàn)為幅度降低、波寬增大、波峰與刺激起點(diǎn)的時(shí)間間隔增大；牽拉力達(dá)到3.2 N時(shí)，無(wú)動(dòng)作電位產(chǎn)生。見(jiàn)圖4。

圖4 不同牽拉力作用對(duì)蛙坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位波形的影響

2.3 不同牽拉力對(duì)蛙坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位各項(xiàng)指標(biāo)的影響

采用0～0.4 N的牽拉力處理蛙坐骨神經(jīng)干，發(fā)現(xiàn)動(dòng)作電位的傳導(dǎo)速度顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.05），見(jiàn)表1。進(jìn)一步加大牽拉力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了2.8 N處理組，其他組動(dòng)作電位的刺激閾值與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＞0.05）；對(duì)于絕對(duì)不應(yīng)期，2.4、2.8 N處理組與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.05）；而動(dòng)作電位幅度及傳導(dǎo)速度均隨著牽拉力的增大而逐漸減少（P值均＜0.05）。見(jiàn)圖5。

表1 不同牽拉力對(duì)蛙坐骨神經(jīng)干傳導(dǎo)速度的影響

圖5 不同牽拉力對(duì)蛙坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位的影響

3 討論

周圍神經(jīng)牽拉損傷是臨床常見(jiàn)的疾病，嚴(yán)重的神經(jīng)牽拉損傷可導(dǎo)致不可逆的感覺(jué)及運(yùn)動(dòng)功能障礙。對(duì)周圍神經(jīng)牽拉損傷進(jìn)行定量研究將有助于明確神經(jīng)可耐受的牽拉程度。本研究中，0.4 N的牽拉力對(duì)神經(jīng)干的動(dòng)作電位幅度未產(chǎn)生顯著影響，0.8 N以上的牽拉力才能降低神經(jīng)干的動(dòng)作電位幅度，而0.1 N的牽拉力則足以使神經(jīng)干的動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度降低，這表明與動(dòng)作電位幅度相比，傳導(dǎo)速度的變化對(duì)牽拉損傷更為敏感。因此，推測(cè)0.1～0.4 N的牽拉力與≥0.8 N的牽拉力造成神經(jīng)損傷的機(jī)制不同。

根據(jù)神經(jīng)結(jié)構(gòu)受損情況，Sunderland將神經(jīng)損傷分為5個(gè)級(jí)別。Ⅰ級(jí)：髓鞘中斷，軸突連續(xù)性完好；Ⅱ級(jí)：軸突及其髓鞘失去連續(xù)性，神經(jīng)的各種結(jié)締組織即神經(jīng)內(nèi)膜、神經(jīng)外膜和神經(jīng)束膜得以保留；Ⅲ級(jí)：軸突和神經(jīng)內(nèi)膜受損，但神經(jīng)束膜未受損；Ⅳ級(jí)：軸突、神經(jīng)內(nèi)膜和神經(jīng)束膜受損，但神經(jīng)外膜保留；Ⅴ級(jí)：神經(jīng)斷裂[7-8]?？梢?jiàn)，髓鞘是神經(jīng)最早、最易損傷的結(jié)構(gòu)。脊椎動(dòng)物神經(jīng)產(chǎn)生的動(dòng)作電位依賴?yán)娠w結(jié)進(jìn)行快速的跳躍性傳導(dǎo)，而髓鞘化的軸突是形成郎飛結(jié)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[9]，髓鞘損傷將導(dǎo)致神經(jīng)傳導(dǎo)速度降低[10]。因此，本研究中0.1～0.4 N的牽拉力對(duì)神經(jīng)干造成的損傷可能屬于Sunderland Ⅰ級(jí)，僅造成了神經(jīng)干內(nèi)軸突髓鞘損傷或中斷從而引起傳導(dǎo)速度減慢，而軸突的連續(xù)性保留使動(dòng)作電位得以正常產(chǎn)生。0.8 N以上的牽拉力造成的神經(jīng)損傷可能屬于Sunderland Ⅱ級(jí)，由于軸突的斷裂，部分神經(jīng)纖維在刺激電極處產(chǎn)生的動(dòng)作電位無(wú)法傳導(dǎo)至接收電極，使神經(jīng)干動(dòng)作電位幅度降低。3.2 N的牽拉力使神經(jīng)干完全斷裂，屬于Sunderland Ⅴ級(jí)損傷。

0.4～2.0 N的牽拉力對(duì)絕對(duì)不應(yīng)期沒(méi)有明顯影響，而2.4 N的牽拉力則引起絕對(duì)不應(yīng)期的明顯延長(zhǎng)。與此類似的是刺激閾值，2.8 N的牽拉力才足以引起刺激閾值的增大。且絕對(duì)不應(yīng)期與刺激閾值隨牽拉力變化的曲線非常相似。絕對(duì)不應(yīng)期是神經(jīng)細(xì)胞在發(fā)生一次興奮后細(xì)胞膜鈉通道失活的時(shí)期，之后鈉通道開(kāi)始復(fù)活[11]。刺激閾值主要與細(xì)胞膜中鈉通道的密度和功能狀態(tài)以及細(xì)胞外的鈣離子濃度有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中絕對(duì)不應(yīng)期和刺激閾值在牽拉力較大時(shí)也無(wú)明顯變化，原因可能是牽拉后部分未斷裂軸突的離子通道的密度和功能仍正常，動(dòng)作電位在這些“幸存”的軸突中能正常產(chǎn)生并被接受電極記錄。本研究的不足之處在于未能在細(xì)胞水平觀察不同程度牽拉力造成的神經(jīng)損傷病理變化，對(duì)神經(jīng)損傷的量化局限于神經(jīng)功能水平，對(duì)損傷引起的神經(jīng)結(jié)構(gòu)的改變?nèi)杂写M(jìn)一步研究。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)周圍神經(jīng)損傷的研究多為探討其損傷后的病理學(xué)改變或修復(fù)機(jī)制，且絕大多數(shù)所用的模型為大鼠或家兔。用無(wú)齒輸精管分離鉗在體牽拉大鼠或家兔的坐骨神經(jīng)至神經(jīng)延長(zhǎng)1倍長(zhǎng)度并持續(xù)30 s[12-14]，使用高精度測(cè)力計(jì)以0.2 N的拉力在體牽拉大鼠的海綿體神經(jīng)[15]。上述牽拉神經(jīng)干的方法多為一次性的牽拉，不能用于定量研究牽拉程度對(duì)神經(jīng)的損傷情況。

本研究利用定量研究的方法探討了牽拉力對(duì)蛙坐骨神經(jīng)干的損傷程度。蛙坐骨神經(jīng)干在2.8 N以下的牽拉力作用下可保持形態(tài)完整，3.2 N牽拉力則可使神經(jīng)干發(fā)生斷裂。蛙坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位的不同指標(biāo)對(duì)牽拉損傷的耐受程度不同，傳導(dǎo)速度對(duì)牽拉損傷最敏感，0.1 N的牽拉力即可降低傳導(dǎo)速度。當(dāng)牽拉力達(dá)到0.8 N時(shí)，動(dòng)作電位幅度才開(kāi)始降低。這可能是因?yàn)?.1～0.4 N的牽拉力只造成神經(jīng)髓鞘損傷而引起傳導(dǎo)速度的減慢，0.8 N以上的牽拉力則可造成神經(jīng)干內(nèi)軸索斷裂而降低復(fù)合動(dòng)作電位幅度。刺激閾值和絕對(duì)不應(yīng)期則對(duì)牽拉損傷的耐受程度較高。本研究的蛙坐骨神經(jīng)牽拉損傷模型量化了牽拉力對(duì)坐骨神經(jīng)動(dòng)作電位相關(guān)指標(biāo)的影響。